引用本文： 卢昌怀, 刘志军, 张宏波, 段扬, 曹延林. TGF-β1 诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子的表达影响. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(7): 883-888. doi: 10.7507/1002-1892.201812016 复制
腰椎管狭窄症是一种常见的老年人运动功能障碍性疾病[1]，通常因腰椎退行性病变如黄韧带增生肥厚、钙化，椎体小关节增生，椎间盘突出等，导致腰椎后部结构改变所引起。其中椎管内黄韧带增生肥厚被认为是腰椎管狭窄发展中最重要的致病因素之一。引起黄韧带增生肥厚的原因很多，包括年龄、脊柱机械应力改变及细胞因子的调节等。在黄韧带增生肥厚过程中，有研究表明结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和 TGF-β1 表达显著增加[2-5]。然而关于两者在黄韧带增生肥厚发病机制中的具体作用机制，至今尚未完全阐明。因此，本研究以外源性重组 CTGF 蛋白和 TGF-β1 共同刺激黄韧带细胞，观察细胞生长增殖变化，探讨二者在黄韧带增生肥厚中的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美国）；CTGF 中和抗体（Sigma 公司，美国）；兔抗Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体、兔抗波形蛋白单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（BOSTER 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（DBI 公司，德国）；RNA 提取试剂 Trizol（Takara 公司，日本）。StratageneMx3000P qRT-PCR 仪（Agilent 公司，美国）；倒置光学显微镜（MOTIC 公司，中国）；正置荧光显微镜（Zeiss 公司，德国）。
1.2 人腰椎黄韧带细胞的分离培养与鉴定
1.2.1 细胞分离培养
取常德市第一中医医院骨伤科脊柱病区腰椎椎间盘突出患者髓核摘除术中的黄韧带组织（术前均经影像学检查确定无明显黄韧带增生，术后取材通过显微镜观察，保证黄韧带细胞健康，排除肥大及其他病理变化），采用胶原酶预消化组织块培养法[6-7]分离，进行传代培养得到黄韧带细胞。
1.2.2 细胞鉴定
① 细胞形态观察：采用倒置光学显微镜观察分离培养过程中细胞形态变化。② 免疫荧光染色观察：取第 1、3、5 代细胞，分别将细胞接种到 96 孔培养板中，待细胞长成单层后 PBS 洗 2 次；用冷丙酮固定 20 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；0.3%PBS-Triton X-100 通透 20 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封闭 30 min，分别滴加兔抗波形蛋白单克隆抗体（1∶100），兔抗Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体（1∶100），4℃ 震动，过夜；PBS 处理 3 次，每次 5 min；加入 Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体（1∶100），37℃ 避光孵育 30 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常温染色 10 min 晾干，抗荧光猝灭封片剂封片，4℃ 保存。荧光倒置显微镜拍照观察。③ MTT 法检测细胞增殖：取第 1、3、5 代细胞，PBS 洗涤 2 次，加入 0.25% 胰蛋白酶，显微镜下观察当细胞质回缩时，加入新鲜的完全培养基，吸取细胞悬液滴在盖玻片边缘，静置 3 min；调整细胞浓度为 1×105个/mL，取 100 μL 细胞悬液加入 96 孔板，放入培养箱培养。0、24、48、72 h 时按照 MTT 法采用酶标仪检测 450 nm 波长下细胞吸光度（A）值。
1.3 实验分组及方法
取第 3 代黄韧带细胞，以 5×104 个/mL 密度接种于 96 孔板，常规培养 24 h 后将细胞分为 5 组。A 组于细胞中加入 3 ng/mL TGF-β1[8]，B 组加入 50 ng/mL CTGF[8]，C 组加入 3 ng/mL TGF-β1+CTGF 中和抗体（1∶500）封闭，D 组加入 50 ng/mL CTGF+CTGF 中和抗体（1∶500）封闭，E 组加入无血清 DMEM 作为对照。
1.4 观测指标
1.4.1 MTT 法检测 TGF-β1 和 CTGF 对黄韧带细胞增殖的影响
各组继续培养 24 h 后，同上法采用 MTT 法检测各组细胞增殖 A 值。
1.4.2 Western blot 检测 CTGF 蛋白表达
培养 24 h 分别收集各组细胞（每组约 1×107个），加入 0.5 mL 裂解液，按步骤提取样本总蛋白并对蛋白定量；进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后将聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜分别放入装有 3 mL CTGF（1∶1 000；转膜条件：300 mA 恒流转膜 38 min）的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 1 h；再将 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 40 min；洗涤 PVDF 膜进行化学发光、显影、定影。将胶片进行扫描，用 Image-Pro Plus 6.0 图像处理系统分析条带 A 值。以 GAPDH 为内参，将 CTGF 与 GAPDH 的 A 值比值作为 CTGF 蛋白相对表达量。实验重复 3 次，取均值。
1.4.3 qRT-PCR 检测各基因表达
取第 3 代细胞，于含 10%FBS 的 DMEM 中培养 24 h，使其处于 G0 期，然后按分组方法处理细胞 24 h。按 Trizol 试剂说明书方法提取细胞总 RNA，按逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系合成 cDNA 第一链，配制 qPCR 扩增的反应体系，进行 PCR 检测。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环；融解曲线分析：温度 62～95℃。引物序列：Ⅰ型胶原正义链：5'-AGATCTGAA-GTGTGATGACTCAGG-3'，反义链：5'-CAGATC-ACGTCATCGCACAAC-3'；Ⅲ型胶原正义链：5'-ATGTTCCACGGAAACACTGG-3'，反义链：5'-GGAGAGAAGTCGAAGGAATGC-3'；GAPDH 正义链：5'- ACACCCACTCCTCTCCACCTTT-3'，反义链：5'-TTACTCCTTGGACTGGCCATGT-3'；CTGF 正义链：5'-GGAGTGGGTGCTTGTGAC-GAG-3'，反义链：5'-GTCTTCCAGTCGGTAAGC-CG-3'。用 2−ΔΔCt法计算各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较及组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 黄韧带细胞形态观察及鉴定
2.1.1 形态观察
培养 6～8 d，可见黄韧带组织块周围有少量细胞爬出，细胞呈梭形；12 d 细胞数量增加，形态呈多样性，包括梭形、多角形、扇形，细胞质丰富，细胞核呈椭圆形，细胞膜清晰。见图 1。
图1
黄韧带细胞形态观察（倒置光学显微镜×100）
a. 培养 7 d；b. 培养 12 d
Figure1. Morphological observation of the ligamentum flavum cells (Inverted optical microscope×100)a. Cultured for 7 days; b. Cultured for 12 days
2.1.2 免疫荧光染色观察
免疫荧光染色示，第 1、3、5 代细胞均呈阳性反应，均表现出典型的黄韧带成纤维细胞的细胞表型。所有细胞均表达Ⅰ型胶原蛋白及波形蛋白，部分细胞表达Ⅲ型胶原蛋白。见图 2。
图2
第 3 代细胞免疫荧光染色观察（荧光倒置显微镜×100）
a. Ⅰ型胶原；b. 波形蛋白；c. Ⅲ型胶原
Figure2. Immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence inverted microscope×100)a. Collagen typeⅠ; b. Vimentin; c. Collagen type Ⅲ
2.1.3 MTT 法检测细胞增殖情况
随培养时间延长，各代细胞 A 值均逐渐增加，同代细胞各时间点间 A 值比较差异均有统计学意义（P<0.05）；相同时间点各代细胞间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
MTT 法检测第 1、3、5 代黄韧带细胞增殖情况
Figure3.
Detecting the proliferation of the 1st, 3rd, and 5th gene ration of ligamentum flavum cells with MTT assay
2.2 MTT 法检测 TGF-β1 和 CTGF 对黄韧带细胞增殖的影响
培养 24 h，A、B、C、D、E 组 A 值分别为 0.477±0.002、0.493±0.004、0.428±0.003、0.435±0.003、0.405±0.003。A、B 组 A 值显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；而加入 CTGF 中和抗体后，C、D 组 A 值降低，但仍高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。
2.3 Western blot 检测 CTGF 蛋白表达
A、B、C、D、E 组 CTGF 蛋白相对表达量分别为 0.398±0.095、0.477±0.061、0.159±0.030、0.135±0.015、0.053±0.006。A、B 组 CTGF 蛋白相对表达量明显高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；而加入 CTGF 中和抗体后，C、D 组 CTGF 蛋白相对表达量显著降低，但仍高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测各组培养 24 h CTGF 蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：E 组
Figure4. Protein expression of CTGF at 24 hours detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D5: Group E
2.4 qRT-PCR 检测各基因表达
与 E 组比较，A 组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量均显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；C 组各基因表达受到抑制，mRNA 相对表达量显著低于 A 组，但仍显著高于 E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。B 组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05），但 CTGF mRNA 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。D 组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量受到抑制，低于 B 组，但仍显著高于 E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；CTGF mRNA 相对表达量与 B、E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
qRT-PCR 检测各组各基因表达
Figure5.
Detection of relative expression of genes in each group by qRT-PCR
3 讨论
黄韧带肥厚是引起腰椎管狭窄症的主要原因，肥厚和纤维化被认为是黄韧带退变的病理基础。通过流行病学调查发现，很多因素如脊柱椎体节段、年龄、椎体屈伸活动造成的机械应力改变[9]和生长因子调节[10]等，参与了黄韧带增生、肥厚的病变过程。既往研究表明 TGF-β1 可以在腰椎管狭窄的肥厚、退变黄韧带组织中大量表达[11-13]。连续的机械应力会刺激 TGF-β1 含量增加，导致黄韧带变性[14]。弹性纤维丢失、组织纤维化、胶原组织增多是退变黄韧带共同的病理特征[6-7]。研究发现[15]在黄韧带轻度肥大阶段，TGF-β1 mRNA 表达量最大，而在黄韧带成熟肥大阶段，TGF-β1 mRNA 表达量明显降低，表明随着黄韧带厚度增加，TGF-β1 的表达却成负相关。由此可见，TGF-β1 在黄韧带细胞中表达上调与黄韧带肥厚过程密切相关。
CTGF 是一个促纤维化因子，参与纤维化过程，促进细胞增殖、迁移、黏附及细胞外基质合成和新生血管形成等，参与创伤修复[16]。研究表明，将正常黄韧带组织与增生肥厚黄韧带组织细胞外基质进行对比发现，两组 CTGF 含量有显著差异，其表达的增加与韧带肥厚程度成正相关[2]。在腰椎肥大的黄韧带中 CTGF 表达增加，推测 CTGF 可能参与黄韧带肥大的过程[17]。目前对 TGF-β1 及 CTGF 与黄韧带增生肥厚之间的关系尚不清楚。因此，我们设想在黄韧带微损伤早期，黄韧带细胞释放 TGF-β1 调控 CTGF 修复损伤的黄韧带，而随着修复持续发展，CTGF 引发的瘢痕炎性反应出现导致黄韧带增生肥厚。本研究通过将 TGF-β1 和外源性 CTGF 蛋白共同刺激黄韧带细胞，观察细胞生长增殖变化，探讨二者在黄韧带增生肥厚中的可能作用机制。
我们通过胶原酶预消化组织块培养法提取并培养黄韧带细胞。加入外源性 TGF-β1 刺激后，发现可以促进黄韧带细胞增殖，并从基因和蛋白水平提高 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。而当加入 CTGF 中和抗体后，TGF-β1 增加黄韧带细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA 及 CTGF mRNA 表达的能力明显下降，说明 TGF-β1 可通过 CTGF 途径对黄韧带细胞的胶原蛋白含量进行调节。TGF-β1 通过调节 CTGF mRNA 的表达，达到增加 CTGF 蛋白含量的目的，但这种联系可以被中和抗体阻断，说明 CTGF 抗体是通过阻断 CTGF 和 CTGF 受体之间的相互作用来阻断 TGF-β1，与细胞内 CTGF 的蛋白水平和 mRNA 水平无关。而加入外源性 CTGF 可以增加黄韧带细胞 CTGF 蛋白的含量，但不能增加 CTGF mRNA 的表达，说明外源性 CTGF 可以进入细胞内，但无法影响 mRNA 合成。由此认为，在黄韧带微损伤早期，黄韧带细胞通过释放 TGF-β1，介导调控 CTGF mRNA 生成，增加 CTGF 蛋白表达。而 CTGF 可提高胶原蛋白的生成，促进黄韧带细胞纤维化，最终导致组织肥厚。因此，通过以上实验可以推测，TGF-β1 增加Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 的表达，导致黄韧带细胞增生是通过影响 CTGF mRNA 表达完成的；通过阻断 CTGF，则可以抑制黄韧带细胞的增生。
综上述，我们的研究首次发现 TGF-β1 通过影响 CTGF 协同促进黄韧带细胞增生，为探讨黄韧带增生肥厚的发病机制及防治措施提供了理论依据，为下一步继续研究 TGF-β1 影响 CTGF mRNA 表达的可能信号通路提供可靠线索。
作者贡献：刘志军、段扬负责科研课题设计；卢昌怀、曹延林负责实验实施及文章撰写；张宏波负责数据收集、整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经常德市第一中医医院医学伦理委员会批准（2016-S017）。
腰椎管狭窄症是一种常见的老年人运动功能障碍性疾病[1]，通常因腰椎退行性病变如黄韧带增生肥厚、钙化，椎体小关节增生，椎间盘突出等，导致腰椎后部结构改变所引起。其中椎管内黄韧带增生肥厚被认为是腰椎管狭窄发展中最重要的致病因素之一。引起黄韧带增生肥厚的原因很多，包括年龄、脊柱机械应力改变及细胞因子的调节等。在黄韧带增生肥厚过程中，有研究表明结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和 TGF-β1 表达显著增加[2-5]。然而关于两者在黄韧带增生肥厚发病机制中的具体作用机制，至今尚未完全阐明。因此，本研究以外源性重组 CTGF 蛋白和 TGF-β1 共同刺激黄韧带细胞，观察细胞生长增殖变化，探讨二者在黄韧带增生肥厚中的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美国）；CTGF 中和抗体（Sigma 公司，美国）；兔抗Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体、兔抗波形蛋白单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（BOSTER 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（DBI 公司，德国）；RNA 提取试剂 Trizol（Takara 公司，日本）。StratageneMx3000P qRT-PCR 仪（Agilent 公司，美国）；倒置光学显微镜（MOTIC 公司，中国）；正置荧光显微镜（Zeiss 公司，德国）。
1.2 人腰椎黄韧带细胞的分离培养与鉴定
1.2.1 细胞分离培养
取常德市第一中医医院骨伤科脊柱病区腰椎椎间盘突出患者髓核摘除术中的黄韧带组织（术前均经影像学检查确定无明显黄韧带增生，术后取材通过显微镜观察，保证黄韧带细胞健康，排除肥大及其他病理变化），采用胶原酶预消化组织块培养法[6-7]分离，进行传代培养得到黄韧带细胞。
1.2.2 细胞鉴定
① 细胞形态观察：采用倒置光学显微镜观察分离培养过程中细胞形态变化。② 免疫荧光染色观察：取第 1、3、5 代细胞，分别将细胞接种到 96 孔培养板中，待细胞长成单层后 PBS 洗 2 次；用冷丙酮固定 20 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；0.3%PBS-Triton X-100 通透 20 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封闭 30 min，分别滴加兔抗波形蛋白单克隆抗体（1∶100），兔抗Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体（1∶100），4℃ 震动，过夜；PBS 处理 3 次，每次 5 min；加入 Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体（1∶100），37℃ 避光孵育 30 min，PBS 处理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常温染色 10 min 晾干，抗荧光猝灭封片剂封片，4℃ 保存。荧光倒置显微镜拍照观察。③ MTT 法检测细胞增殖：取第 1、3、5 代细胞，PBS 洗涤 2 次，加入 0.25% 胰蛋白酶，显微镜下观察当细胞质回缩时，加入新鲜的完全培养基，吸取细胞悬液滴在盖玻片边缘，静置 3 min；调整细胞浓度为 1×105个/mL，取 100 μL 细胞悬液加入 96 孔板，放入培养箱培养。0、24、48、72 h 时按照 MTT 法采用酶标仪检测 450 nm 波长下细胞吸光度（A）值。
1.3 实验分组及方法
取第 3 代黄韧带细胞，以 5×104 个/mL 密度接种于 96 孔板，常规培养 24 h 后将细胞分为 5 组。A 组于细胞中加入 3 ng/mL TGF-β1[8]，B 组加入 50 ng/mL CTGF[8]，C 组加入 3 ng/mL TGF-β1+CTGF 中和抗体（1∶500）封闭，D 组加入 50 ng/mL CTGF+CTGF 中和抗体（1∶500）封闭，E 组加入无血清 DMEM 作为对照。
1.4 观测指标
1.4.1 MTT 法检测 TGF-β1 和 CTGF 对黄韧带细胞增殖的影响
各组继续培养 24 h 后，同上法采用 MTT 法检测各组细胞增殖 A 值。
1.4.2 Western blot 检测 CTGF 蛋白表达
培养 24 h 分别收集各组细胞（每组约 1×107个），加入 0.5 mL 裂解液，按步骤提取样本总蛋白并对蛋白定量；进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后将聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜分别放入装有 3 mL CTGF（1∶1 000；转膜条件：300 mA 恒流转膜 38 min）的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 1 h；再将 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动 40 min；洗涤 PVDF 膜进行化学发光、显影、定影。将胶片进行扫描，用 Image-Pro Plus 6.0 图像处理系统分析条带 A 值。以 GAPDH 为内参，将 CTGF 与 GAPDH 的 A 值比值作为 CTGF 蛋白相对表达量。实验重复 3 次，取均值。
1.4.3 qRT-PCR 检测各基因表达
取第 3 代细胞，于含 10%FBS 的 DMEM 中培养 24 h，使其处于 G0 期，然后按分组方法处理细胞 24 h。按 Trizol 试剂说明书方法提取细胞总 RNA，按逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系合成 cDNA 第一链，配制 qPCR 扩增的反应体系，进行 PCR 检测。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环；融解曲线分析：温度 62～95℃。引物序列：Ⅰ型胶原正义链：5'-AGATCTGAA-GTGTGATGACTCAGG-3'，反义链：5'-CAGATC-ACGTCATCGCACAAC-3'；Ⅲ型胶原正义链：5'-ATGTTCCACGGAAACACTGG-3'，反义链：5'-GGAGAGAAGTCGAAGGAATGC-3'；GAPDH 正义链：5'- ACACCCACTCCTCTCCACCTTT-3'，反义链：5'-TTACTCCTTGGACTGGCCATGT-3'；CTGF 正义链：5'-GGAGTGGGTGCTTGTGAC-GAG-3'，反义链：5'-GTCTTCCAGTCGGTAAGC-CG-3'。用 2−ΔΔCt法计算各组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量。实验重复 3 次，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较及组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 黄韧带细胞形态观察及鉴定
2.1.1 形态观察
培养 6～8 d，可见黄韧带组织块周围有少量细胞爬出，细胞呈梭形；12 d 细胞数量增加，形态呈多样性，包括梭形、多角形、扇形，细胞质丰富，细胞核呈椭圆形，细胞膜清晰。见图 1。
图1
黄韧带细胞形态观察（倒置光学显微镜×100）
a. 培养 7 d；b. 培养 12 d
Figure1. Morphological observation of the ligamentum flavum cells (Inverted optical microscope×100)a. Cultured for 7 days; b. Cultured for 12 days
2.1.2 免疫荧光染色观察
免疫荧光染色示，第 1、3、5 代细胞均呈阳性反应，均表现出典型的黄韧带成纤维细胞的细胞表型。所有细胞均表达Ⅰ型胶原蛋白及波形蛋白，部分细胞表达Ⅲ型胶原蛋白。见图 2。
图2
第 3 代细胞免疫荧光染色观察（荧光倒置显微镜×100）
a. Ⅰ型胶原；b. 波形蛋白；c. Ⅲ型胶原
Figure2. Immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence inverted microscope×100)a. Collagen typeⅠ; b. Vimentin; c. Collagen type Ⅲ
2.1.3 MTT 法检测细胞增殖情况
随培养时间延长，各代细胞 A 值均逐渐增加，同代细胞各时间点间 A 值比较差异均有统计学意义（P<0.05）；相同时间点各代细胞间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
MTT 法检测第 1、3、5 代黄韧带细胞增殖情况
Figure3.
Detecting the proliferation of the 1st, 3rd, and 5th gene ration of ligamentum flavum cells with MTT assay
2.2 MTT 法检测 TGF-β1 和 CTGF 对黄韧带细胞增殖的影响
培养 24 h，A、B、C、D、E 组 A 值分别为 0.477±0.002、0.493±0.004、0.428±0.003、0.435±0.003、0.405±0.003。A、B 组 A 值显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；而加入 CTGF 中和抗体后，C、D 组 A 值降低，但仍高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。
2.3 Western blot 检测 CTGF 蛋白表达
A、B、C、D、E 组 CTGF 蛋白相对表达量分别为 0.398±0.095、0.477±0.061、0.159±0.030、0.135±0.015、0.053±0.006。A、B 组 CTGF 蛋白相对表达量明显高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；而加入 CTGF 中和抗体后，C、D 组 CTGF 蛋白相对表达量显著降低，但仍高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测各组培养 24 h CTGF 蛋白表达
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：E 组
Figure4. Protein expression of CTGF at 24 hours detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D5: Group E
2.4 qRT-PCR 检测各基因表达
与 E 组比较，A 组 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量均显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；C 组各基因表达受到抑制，mRNA 相对表达量显著低于 A 组，但仍显著高于 E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。B 组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05），但 CTGF mRNA 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。D 组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 相对表达量受到抑制，低于 B 组，但仍显著高于 E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；CTGF mRNA 相对表达量与 B、E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
qRT-PCR 检测各组各基因表达
Figure5.
Detection of relative expression of genes in each group by qRT-PCR
3 讨论
黄韧带肥厚是引起腰椎管狭窄症的主要原因，肥厚和纤维化被认为是黄韧带退变的病理基础。通过流行病学调查发现，很多因素如脊柱椎体节段、年龄、椎体屈伸活动造成的机械应力改变[9]和生长因子调节[10]等，参与了黄韧带增生、肥厚的病变过程。既往研究表明 TGF-β1 可以在腰椎管狭窄的肥厚、退变黄韧带组织中大量表达[11-13]。连续的机械应力会刺激 TGF-β1 含量增加，导致黄韧带变性[14]。弹性纤维丢失、组织纤维化、胶原组织增多是退变黄韧带共同的病理特征[6-7]。研究发现[15]在黄韧带轻度肥大阶段，TGF-β1 mRNA 表达量最大，而在黄韧带成熟肥大阶段，TGF-β1 mRNA 表达量明显降低，表明随着黄韧带厚度增加，TGF-β1 的表达却成负相关。由此可见，TGF-β1 在黄韧带细胞中表达上调与黄韧带肥厚过程密切相关。
CTGF 是一个促纤维化因子，参与纤维化过程，促进细胞增殖、迁移、黏附及细胞外基质合成和新生血管形成等，参与创伤修复[16]。研究表明，将正常黄韧带组织与增生肥厚黄韧带组织细胞外基质进行对比发现，两组 CTGF 含量有显著差异，其表达的增加与韧带肥厚程度成正相关[2]。在腰椎肥大的黄韧带中 CTGF 表达增加，推测 CTGF 可能参与黄韧带肥大的过程[17]。目前对 TGF-β1 及 CTGF 与黄韧带增生肥厚之间的关系尚不清楚。因此，我们设想在黄韧带微损伤早期，黄韧带细胞释放 TGF-β1 调控 CTGF 修复损伤的黄韧带，而随着修复持续发展，CTGF 引发的瘢痕炎性反应出现导致黄韧带增生肥厚。本研究通过将 TGF-β1 和外源性 CTGF 蛋白共同刺激黄韧带细胞，观察细胞生长增殖变化，探讨二者在黄韧带增生肥厚中的可能作用机制。
我们通过胶原酶预消化组织块培养法提取并培养黄韧带细胞。加入外源性 TGF-β1 刺激后，发现可以促进黄韧带细胞增殖，并从基因和蛋白水平提高 CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。而当加入 CTGF 中和抗体后，TGF-β1 增加黄韧带细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA 及 CTGF mRNA 表达的能力明显下降，说明 TGF-β1 可通过 CTGF 途径对黄韧带细胞的胶原蛋白含量进行调节。TGF-β1 通过调节 CTGF mRNA 的表达，达到增加 CTGF 蛋白含量的目的，但这种联系可以被中和抗体阻断，说明 CTGF 抗体是通过阻断 CTGF 和 CTGF 受体之间的相互作用来阻断 TGF-β1，与细胞内 CTGF 的蛋白水平和 mRNA 水平无关。而加入外源性 CTGF 可以增加黄韧带细胞 CTGF 蛋白的含量，但不能增加 CTGF mRNA 的表达，说明外源性 CTGF 可以进入细胞内，但无法影响 mRNA 合成。由此认为，在黄韧带微损伤早期，黄韧带细胞通过释放 TGF-β1，介导调控 CTGF mRNA 生成，增加 CTGF 蛋白表达。而 CTGF 可提高胶原蛋白的生成，促进黄韧带细胞纤维化，最终导致组织肥厚。因此，通过以上实验可以推测，TGF-β1 增加Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA 的表达，导致黄韧带细胞增生是通过影响 CTGF mRNA 表达完成的；通过阻断 CTGF，则可以抑制黄韧带细胞的增生。
综上述，我们的研究首次发现 TGF-β1 通过影响 CTGF 协同促进黄韧带细胞增生，为探讨黄韧带增生肥厚的发病机制及防治措施提供了理论依据，为下一步继续研究 TGF-β1 影响 CTGF mRNA 表达的可能信号通路提供可靠线索。
作者贡献：刘志军、段扬负责科研课题设计；卢昌怀、曹延林负责实验实施及文章撰写；张宏波负责数据收集、整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经常德市第一中医医院医学伦理委员会批准（2016-S017）。
