引用本文： 翁峰标, 朱立帆, 杨立文, 李勇, 刘荣, 凡进, 周建新. B 淋巴细胞瘤-2 蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(5): 618-627. doi: 10.7507/1002-1892.201812064 复制
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）属于中枢神经功能障碍疾病，具有高并发率、致残率的特点，严重影响患者日常生活，给患者家庭及社会带来巨大的经济负担[1]。研究显示自噬在大鼠 SCI 后的细胞修复中发挥重要作用，SCI 后细胞自噬水平升高，可降低神经元损伤及神经细胞凋亡率，促进大鼠运动功能恢复[2]。B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白为线粒体抗凋亡因子，主要通过转录后磷酸化调控蛋白抗凋亡作用。该蛋白第 70 位及第 87 位丝氨酸残基（Ser70、Ser87）磷酸化后，可改变细胞对凋亡的敏感性，进而抑制或增强 Bcl-2 抗凋亡作用[3]。然而 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位点磷酸化是否参与 SCI 后细胞自噬，目前尚未见报道。本研究通过制备大鼠 SCI 模型，给予自噬促进剂及抑制剂处理，以探究自噬过程对脊髓组织神经细胞凋亡的影响以及 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位点磷酸化情况，以期为 SCI 的发生机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SFP 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 52 只，体质量 220～260 g，由南京医科大学医药实验动物中心提供。饲养条件：温度 22～25℃，自然光照，湿度 50%～60%，自由饮水、摄食。本研究严格遵循《实验动物管理条例》，获得南京医科大学动物伦理委员会批准；实验动物使用许可证号：SYXK（苏）20160008。
3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma 公司，美国）；雷帕霉素（上海吉至生化科技有限公司）；过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性检测试剂盒（南京建成生物研究所）；TNF-α、IL-1β ELISA 检测试剂盒（上海沪震实业有限公司）；HE 染色试剂盒（杭州碧云天生物技术研究所）；鼠抗自噬相关蛋白（Beclin1）、微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）荧光一抗、RIPA 蛋白裂解液（Abcam 公司，美国）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2（Santa Cruze 公司，美国）；p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗（R&D 公司，美国）；辣根过氧化物酶标记二抗、β-actin（CST 公司，美国）。荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；透射电镜（Hitachi 公司，日本）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
实验分为 4 组，分别为 SCI 组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组以及假手术组。
1.2.1 动物模型制备
取 40 只大鼠采用改良 Allen 法[4]制备 SCI 模型。大鼠禁食（不禁水）12 h 后，腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉。于脊柱后正中作 2 cm 长切口，钝性剥离肌肉，行椎板切除术，暴露 T11 脊髓，选用 10 g 重物 2.5 cm 高度垂直打击损害脊髓，造成 SCI 后停留 3 min，将重物锤移除。模型制备成功标准：撞击处脊髓组织出现水肿、充血，鼠尾来回摆动且后肢扑动，大鼠下肢呈瘫痪状，清醒后后肢运动功能发生障碍。术后皮下注射 12 mg/（kg·d）庆大霉素，共 1 周；按摩膀胱辅助大鼠排尿，直至可以自行排尿。排除造模过程中感染、死亡大鼠，共 36 只大鼠造模成功，将其随机分为 SCI 组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组，每组 12 只。
另取 12 只大鼠作为假手术组，同上法麻醉后，仅切除椎板，不撞击脊髓。
1.2.2 给药方法
造模完成后，将各组大鼠固定于操作台上，背部拱起，标记髂前上棘确定脊髓间隙，将微量注射器于定位点垂直进入脊髓鞘内后缓慢推进药物，30 s 后拔针。自噬抑制剂组于鞘内注射 20 μL 600 nmol/L 3-MA[5]，自噬促进剂组注射 20 μL 25 nmol/L 雷帕霉素[6]，假手术组及 SCI 组注射 20 μL 生理盐水。各组每天 1 次，连续注射 4 周。
末次注射 24 h 后，将各组大鼠过量麻醉处死，经原手术入路获取受损脊髓，将部分组织置于 4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋后制备切片，片厚 6 μm，用于 HE 染色、透射电镜观察线粒体超微结构、免疫荧光染色、TUNEL 染色检测；部分新鲜组织用于炎性因子水平检测；部分组织剪碎后置于–80℃ 保存，用于 Western blot 检测。
1.3 观测指标
1.3.1 大鼠后肢运动功能评定
造模后 1 d 及 1、2、4 周，采用 BBB 评分法[7]对大鼠后肢步态、关节活动、整体协调能力进行评定。
1.3.2 脊髓组织炎性因子水平检测
称取脊髓组织，与生理盐水以 1∶9 比例置于匀浆机内，超声匀浆，制备匀浆液。按照 MPO 活性检测试剂盒说明书操作，检测脊髓组织中 MPO 活性。按照 ELISA 检测试剂盒说明书操作，检测脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平。
1.3.3 组织学观察
各组切片常规行 HE 染色，中性树脂封片后，于 40 倍光镜下观察脊髓组织形态学变化。
1.3.4 透射电镜观察
将各组切片置于 2% 戊二醛中固定 24 h，1% 锇酸固定后梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋，制备超薄切片，片厚 100 nm；醋酸铀-柠檬酸铅双染后，于透射电镜下观察线粒体超微结构变化。
1.3.5 免疫荧光染色观察
将各组切片置于 Triton X-100 透化 20 min，添加荧光染液室温避光孵育 20 min，封闭后采用 Beclin1、LC3 荧光一抗（1∶500）4℃ 孵育，过夜后添加荧光二抗，室温孵育 2 h，荧光显微镜下观察 Beclin1、LC3 蛋白表达情况。Beclin1、LC3 蛋白阳性染色均呈红色荧光，采用 Image Pro-Plus 软件计算目的蛋白阳性率。
1.3.6 TUNEL 染色观察
取各组切片按照 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色，用 Image Pro-Plus 软件对细胞凋亡进行定量分析，按以下公式计算细胞凋亡率：阳性染色细胞数/细胞总数×100%。
1.3.7 免疫荧光双染观察
将各组切片以驴血清封闭 30 min。LC3 一抗孵育，加入对应二抗孵育。再按照 TUNEL 凋亡检测试剂盒说明书进行染色，以 DAPI 染色 5 min 后封片拍照，计数阳性细胞。红色荧光为 LC3 阳性细胞，绿色荧光为 TUNEL 阳性细胞。
1.3.8 Western blot 检测
取各组–80℃ 保存的脊髓组织，RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，经 10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，于聚偏二氟乙烯膜上行转膜反应，封闭后用 Bax、Bcl-2 及 p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗抗体（1∶200）4℃ 孵育过夜，清洗后加入二抗，室温下孵育膜 1 h，ECL 曝光显影后，采用 Quantity One 软件评估目标蛋白表达 水平。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠后肢运动功能评定
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组各时间点 BBB 评分均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 BBB 评分显著降低，自噬促进剂组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
各组造模后不同时间点 BBB 评分比较（n=12，
）
Table1.
Comparison of BBB scores at different time points after modeling between groups (n=12, 
)
2.2 脊髓组织炎性因子水平检测
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组上述指标水平显著升高，自噬促进剂组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠脊髓组织中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平比较（n=12，
）
Table2.
Comparison of MPO activity and TNF-α and IL-1β levels in spinal cord tissue of each group (n=12, 
)
2.3 组织学观察
假手术组脊髓组织灰、白质结构完整，灰质中神经细胞分布均匀；SCI 组神经细胞周围间隙增大，细胞核仁模糊，细胞肿胀、出现空泡；自噬抑制剂组脊髓组织中出现大量坏死细胞，空泡增多，炎性浸润程度增加；自噬促进剂组坏死神经细胞及空泡数量较自噬抑制剂组减少，炎性浸润程度减轻。见图 1。
图1
各组 HE 染色观察（×40）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure1. HE staining observation of each group (×40)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.4 透射电镜观察
假手术组细胞质中分散少量线粒体，未发现自噬小体；SCI 组线粒体肿胀变性，其中分散吞噬颗粒及自噬小体；自噬抑制剂组神经细胞出现少量溶酶体及单层膜包裹的自噬囊泡；自噬促进剂组自噬小体增多，细胞质固缩，细胞核核仁形态不规则。见图 2。
图2
各组透射电镜观察（×15k）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure2. Transmission electron microscopy observation of each group (×15k)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.5 免疫荧光染色观测
与假手术组相比，SCI 组及自噬促进剂组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率显著升高，自噬抑制剂组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率显著降低，自噬促进剂组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3、4 及表 3。
表3
各组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率比较（n=12, %, 
）
Table3.
Comparison of positive rates of Beclin1 and LC3 proteins between groups (n=12, %, 
)
图3
免疫荧光染色检测各组 Beclin1 蛋白表达（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、Beclin1 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure3. Immunofluorescence staining for the expressions of Beclin1 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, Beclin1 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
图4
免疫荧光染色检测各组 LC3 蛋白表达（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、LC3 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure4. Immunofluorescence staining for the expression of LC3 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, LC3 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.6 TUNEL 染色观察
假手术组、SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组细胞凋亡率分别为 17.23%±3.26%、34.72%±4.54%、45.18%±5.38%、23.64%±3.13%。与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组细胞凋亡率显著升高，自噬促进剂组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
TUNEL 染色观察各组脊髓组织中细胞凋亡（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、TUNEL 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure5. TUNEL staining for apoptosis in spinal cord tissue of each group (×100)From left to right for DAPI staining, TUNEL staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.7 免疫荧光双染观察
与假手术组相比，SCI 组、自噬促进剂组 LC3、TUNEL 阳性细胞显著增多，自噬抑制剂组 LC3 阳性细胞显著减少、TUNEL 阳性细胞显著增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 LC3 阳性细胞显著减少、TUNEL 阳性细胞显著增多，自噬促进剂组 LC3 阳性细胞显著增多、TUNEL 阳性细胞显著减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6 及表 4。
表4
免疫荧光双染检测各组 LC3/TUNEL 阳性细胞数（n=12，
）
Table4.
Immunofluorescence double staining for LC3/TUNEL positive cells count in each group (n=12, 
)
图6
免疫荧光双染检测各组 LC3、TUNEL 表达（×200）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure6. Immunofluorescence double staining in LC3 and TUNEL expression of each group (×200)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.8 Western blot 检测
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低；自噬促进剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著降低，Bcl-2 蛋白表达显著升高；上述组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 7 及表 5。
表5
Western blot 检测各组 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达（n=12，
）
Table5.
Expressions of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) proteins in each group detected by Western blot (n=12, %, 
)
图7
Western blot 检测脊髓组织中 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达
1：假手术组 2：SCI 组 3：自噬抑制剂组 4：自噬促进剂组
Figure7. Western blot analysis of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) protein expression in spinal cord1: Sham operation group 2: SCI group 3: Autophagy inhibitor group 4: Autophagy promoter group
3 讨论
SCI 病理机制较复杂，为评估药物对 SCI 的干预效果，需要首先进行动物实验。目前实验研究制备 SCI 动物模型的方法较多，包括脊髓撞击（Allen 法）、供血管栓塞或结扎造成脊髓缺血、钳夹压迫等[8]，其中脊髓撞击制备的 SCI 模型与临床 SCI 病理过程相似，稳定性好，可信度高，是基础研究常用 SCI 模型制备方法[9]。本研究采用脊髓撞击法制备 SCI 大鼠模型，结果显示，与假手术组相比，SCI 组大鼠 BBB 评分显著降低，运动功能出现障碍；神经细胞周围间隙增大，细胞核仁模糊，细胞肿胀、出现空泡，与 SCI 后脊髓损伤特征相符[7]，提示 SCI 大鼠模型制备成功。
炎性反应是引发脊髓组织损伤的重要原因，神经细胞损伤后能够释放大量炎性因子（如 TNF-α、IL-1β），进一步促进炎性细胞迁移，导致复杂炎症级联反应，造成组织损伤[10]。中性粒细胞是 SCI 发生后发挥主要作用的炎性细胞，研究显示抑制中性粒细胞活化后，能够减轻脊髓功能损伤程度，进而降低神经功能损伤[11]。本研究显示与假手术组相比，SCI 组脊髓组织中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平升高，提示炎性因子参与 SCI 的发生。
近年来，研究发现自噬现象广泛存在于神经疾病，如脑卒中、脑外伤及神经退行性疾病。一般情况下细胞自噬水平较低，适量自噬可促进细胞生存，当细胞受损后，自噬被激活参与损伤细胞及组织，进而影响神经疾病生理过程[12]。自噬体是判定细胞是否出现自噬的主要诊断标志物，脑损伤及 SCI 后均可在受损组织神经细胞中发现自噬小体及自噬泡的形成，表明组织损伤后能够激活自噬[13-14]。本研究透射电镜观察发现，SCI 组出现吞噬颗粒及自噬小体，而自噬抑制剂组出现少量溶酶体及单层膜包裹的自噬囊泡，自噬促进剂组出现大量自噬小体，提示 SCI 后存在自噬，而进一步激活自噬后可显著增加自噬小体数量。LC3 蛋白是目前检测自噬活性的重要标志物，主要定位于自噬体膜上，当受到外界刺激后，LC3 在 Agt4 的催化下发生泛素化形成 LC3-Ⅰ，随后与磷脂酰乙醇胺偶联形成 LC3-Ⅱ，稳定存在于内膜上，因此 LC3 水平可反映自噬程度[15]。Beclin1 是哺乳动物参与自噬的特异基因之一，主要与 PI3K 结合为复合体调控自噬蛋白在自噬小体的位置，进而调控细胞自噬活性，当细胞发生自噬后，其水平迅速升高，可反映细胞自噬程度[16]。本研究发现 SCI 组脊髓组织中 LC3、Beclin1 蛋白阳性率较假手术组显著升高；与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 LC3、Beclin1 蛋白阳性率明显降低，而自噬促进剂组显著升高；进一步提示自噬参与 SCI 的发生。
SCI 发生后可引发神经细胞凋亡，然而自噬与凋亡同时存在，两者具体关系目前尚无定论。部分学者认为自噬可诱导或加速细胞凋亡[17]；也有学者认为自噬可通过吞噬受损线粒体，减少细胞凋亡，进而保护细胞[18]。本研究发现 SCI 组脊髓组织神经细胞凋亡率较假手术组显著升高。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组大鼠 BBB 评分降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 蛋白表达升高；而自噬促进剂大鼠组 BBB 评分升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2 蛋白表达升高，Bax 蛋白表达降低。LC3/TUNEL 免疫荧光双染得到与 LC3、TUNEL 免疫荧光检测细胞凋亡类似的结果。上述结果提示 SCI 后可激活细胞自噬，能够抑制神经细胞凋亡，进而促进神经功能恢复。
Bcl-2 转录后磷酸化水平对于蛋白发挥抗凋亡作用十分重要，既往研究显示当使用促凋亡剂处理细胞后，能使 Bcl-2 的 Ser 87、Ser 757 位点发生磷酸化，抑制 Bcl-2 转录水平，进而抑制抗凋亡作用，使细胞凋亡率升高[19-20]。体外研究发现，通过诱导心肌细胞中 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 及 T69 位点发生磷酸化，进而导致 Bax 解离，加速心肌细胞的凋亡[21]。以上研究提示 Bcl-2磷酸化水平升高影响细胞的抗凋亡作用，本研究结果显示，与 SCI 组相比，自噬抑制剂组经 3-MA 处理后细胞凋亡率升高，p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低，而自噬促进组结果与之相反。提示 SCI 后自噬水平升高，可能通过下调 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位点磷酸化水平，进而增强抗凋亡作用，抑制脊髓组织神经细胞凋亡。
综上述，大鼠 SCI 后诱导自噬可降低神经细胞凋亡，保护脊髓功能，其机制可能与抑制 BCL-2 蛋白多位点磷酸化有关。本研究尚未就自噬抑制剂和自噬促进剂对假手术大鼠的影响进行观察，仅研究了自噬水平对 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位点磷酸化的影响，对于 Bcl-2 蛋白其他位点磷酸化的作用有待后续深入研究。
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）属于中枢神经功能障碍疾病，具有高并发率、致残率的特点，严重影响患者日常生活，给患者家庭及社会带来巨大的经济负担[1]。研究显示自噬在大鼠 SCI 后的细胞修复中发挥重要作用，SCI 后细胞自噬水平升高，可降低神经元损伤及神经细胞凋亡率，促进大鼠运动功能恢复[2]。B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白为线粒体抗凋亡因子，主要通过转录后磷酸化调控蛋白抗凋亡作用。该蛋白第 70 位及第 87 位丝氨酸残基（Ser70、Ser87）磷酸化后，可改变细胞对凋亡的敏感性，进而抑制或增强 Bcl-2 抗凋亡作用[3]。然而 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位点磷酸化是否参与 SCI 后细胞自噬，目前尚未见报道。本研究通过制备大鼠 SCI 模型，给予自噬促进剂及抑制剂处理，以探究自噬过程对脊髓组织神经细胞凋亡的影响以及 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位点磷酸化情况，以期为 SCI 的发生机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SFP 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 52 只，体质量 220～260 g，由南京医科大学医药实验动物中心提供。饲养条件：温度 22～25℃，自然光照，湿度 50%～60%，自由饮水、摄食。本研究严格遵循《实验动物管理条例》，获得南京医科大学动物伦理委员会批准；实验动物使用许可证号：SYXK（苏）20160008。
3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma 公司，美国）；雷帕霉素（上海吉至生化科技有限公司）；过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性检测试剂盒（南京建成生物研究所）；TNF-α、IL-1β ELISA 检测试剂盒（上海沪震实业有限公司）；HE 染色试剂盒（杭州碧云天生物技术研究所）；鼠抗自噬相关蛋白（Beclin1）、微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）荧光一抗、RIPA 蛋白裂解液（Abcam 公司，美国）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2（Santa Cruze 公司，美国）；p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗（R&D 公司，美国）；辣根过氧化物酶标记二抗、β-actin（CST 公司，美国）。荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；透射电镜（Hitachi 公司，日本）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
实验分为 4 组，分别为 SCI 组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组以及假手术组。
1.2.1 动物模型制备
取 40 只大鼠采用改良 Allen 法[4]制备 SCI 模型。大鼠禁食（不禁水）12 h 后，腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉。于脊柱后正中作 2 cm 长切口，钝性剥离肌肉，行椎板切除术，暴露 T11 脊髓，选用 10 g 重物 2.5 cm 高度垂直打击损害脊髓，造成 SCI 后停留 3 min，将重物锤移除。模型制备成功标准：撞击处脊髓组织出现水肿、充血，鼠尾来回摆动且后肢扑动，大鼠下肢呈瘫痪状，清醒后后肢运动功能发生障碍。术后皮下注射 12 mg/（kg·d）庆大霉素，共 1 周；按摩膀胱辅助大鼠排尿，直至可以自行排尿。排除造模过程中感染、死亡大鼠，共 36 只大鼠造模成功，将其随机分为 SCI 组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组，每组 12 只。
另取 12 只大鼠作为假手术组，同上法麻醉后，仅切除椎板，不撞击脊髓。
1.2.2 给药方法
造模完成后，将各组大鼠固定于操作台上，背部拱起，标记髂前上棘确定脊髓间隙，将微量注射器于定位点垂直进入脊髓鞘内后缓慢推进药物，30 s 后拔针。自噬抑制剂组于鞘内注射 20 μL 600 nmol/L 3-MA[5]，自噬促进剂组注射 20 μL 25 nmol/L 雷帕霉素[6]，假手术组及 SCI 组注射 20 μL 生理盐水。各组每天 1 次，连续注射 4 周。
末次注射 24 h 后，将各组大鼠过量麻醉处死，经原手术入路获取受损脊髓，将部分组织置于 4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋后制备切片，片厚 6 μm，用于 HE 染色、透射电镜观察线粒体超微结构、免疫荧光染色、TUNEL 染色检测；部分新鲜组织用于炎性因子水平检测；部分组织剪碎后置于–80℃ 保存，用于 Western blot 检测。
1.3 观测指标
1.3.1 大鼠后肢运动功能评定
造模后 1 d 及 1、2、4 周，采用 BBB 评分法[7]对大鼠后肢步态、关节活动、整体协调能力进行评定。
1.3.2 脊髓组织炎性因子水平检测
称取脊髓组织，与生理盐水以 1∶9 比例置于匀浆机内，超声匀浆，制备匀浆液。按照 MPO 活性检测试剂盒说明书操作，检测脊髓组织中 MPO 活性。按照 ELISA 检测试剂盒说明书操作，检测脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平。
1.3.3 组织学观察
各组切片常规行 HE 染色，中性树脂封片后，于 40 倍光镜下观察脊髓组织形态学变化。
1.3.4 透射电镜观察
将各组切片置于 2% 戊二醛中固定 24 h，1% 锇酸固定后梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋，制备超薄切片，片厚 100 nm；醋酸铀-柠檬酸铅双染后，于透射电镜下观察线粒体超微结构变化。
1.3.5 免疫荧光染色观察
将各组切片置于 Triton X-100 透化 20 min，添加荧光染液室温避光孵育 20 min，封闭后采用 Beclin1、LC3 荧光一抗（1∶500）4℃ 孵育，过夜后添加荧光二抗，室温孵育 2 h，荧光显微镜下观察 Beclin1、LC3 蛋白表达情况。Beclin1、LC3 蛋白阳性染色均呈红色荧光，采用 Image Pro-Plus 软件计算目的蛋白阳性率。
1.3.6 TUNEL 染色观察
取各组切片按照 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色，用 Image Pro-Plus 软件对细胞凋亡进行定量分析，按以下公式计算细胞凋亡率：阳性染色细胞数/细胞总数×100%。
1.3.7 免疫荧光双染观察
将各组切片以驴血清封闭 30 min。LC3 一抗孵育，加入对应二抗孵育。再按照 TUNEL 凋亡检测试剂盒说明书进行染色，以 DAPI 染色 5 min 后封片拍照，计数阳性细胞。红色荧光为 LC3 阳性细胞，绿色荧光为 TUNEL 阳性细胞。
1.3.8 Western blot 检测
取各组–80℃ 保存的脊髓组织，RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，经 10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，于聚偏二氟乙烯膜上行转膜反应，封闭后用 Bax、Bcl-2 及 p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗抗体（1∶200）4℃ 孵育过夜，清洗后加入二抗，室温下孵育膜 1 h，ECL 曝光显影后，采用 Quantity One 软件评估目标蛋白表达 水平。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠后肢运动功能评定
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组各时间点 BBB 评分均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 BBB 评分显著降低，自噬促进剂组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
各组造模后不同时间点 BBB 评分比较（n=12，）
Table1.
Comparison of BBB scores at different time points after modeling between groups (n=12, )
2.2 脊髓组织炎性因子水平检测
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组上述指标水平显著升高，自噬促进剂组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠脊髓组织中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平比较（n=12，）
Table2.
Comparison of MPO activity and TNF-α and IL-1β levels in spinal cord tissue of each group (n=12, )
2.3 组织学观察
假手术组脊髓组织灰、白质结构完整，灰质中神经细胞分布均匀；SCI 组神经细胞周围间隙增大，细胞核仁模糊，细胞肿胀、出现空泡；自噬抑制剂组脊髓组织中出现大量坏死细胞，空泡增多，炎性浸润程度增加；自噬促进剂组坏死神经细胞及空泡数量较自噬抑制剂组减少，炎性浸润程度减轻。见图 1。
图1
各组 HE 染色观察（×40）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure1. HE staining observation of each group (×40)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.4 透射电镜观察
假手术组细胞质中分散少量线粒体，未发现自噬小体；SCI 组线粒体肿胀变性，其中分散吞噬颗粒及自噬小体；自噬抑制剂组神经细胞出现少量溶酶体及单层膜包裹的自噬囊泡；自噬促进剂组自噬小体增多，细胞质固缩，细胞核核仁形态不规则。见图 2。
图2
各组透射电镜观察（×15k）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure2. Transmission electron microscopy observation of each group (×15k)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.5 免疫荧光染色观测
与假手术组相比，SCI 组及自噬促进剂组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率显著升高，自噬抑制剂组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率显著降低，自噬促进剂组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3、4 及表 3。
表3
各组 Beclin1、LC3 蛋白阳性率比较（n=12, %, ）
Table3.
Comparison of positive rates of Beclin1 and LC3 proteins between groups (n=12, %, )
图3
免疫荧光染色检测各组 Beclin1 蛋白表达（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、Beclin1 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure3. Immunofluorescence staining for the expressions of Beclin1 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, Beclin1 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
图4
免疫荧光染色检测各组 LC3 蛋白表达（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、LC3 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure4. Immunofluorescence staining for the expression of LC3 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, LC3 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.6 TUNEL 染色观察
假手术组、SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组细胞凋亡率分别为 17.23%±3.26%、34.72%±4.54%、45.18%±5.38%、23.64%±3.13%。与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组细胞凋亡率显著升高，自噬促进剂组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
TUNEL 染色观察各组脊髓组织中细胞凋亡（×100）
从左至右分别为 DAPI 染色、TUNEL 染色及二者重叠 a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure5. TUNEL staining for apoptosis in spinal cord tissue of each group (×100)From left to right for DAPI staining, TUNEL staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.7 免疫荧光双染观察
与假手术组相比，SCI 组、自噬促进剂组 LC3、TUNEL 阳性细胞显著增多，自噬抑制剂组 LC3 阳性细胞显著减少、TUNEL 阳性细胞显著增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 LC3 阳性细胞显著减少、TUNEL 阳性细胞显著增多，自噬促进剂组 LC3 阳性细胞显著增多、TUNEL 阳性细胞显著减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6 及表 4。
表4
免疫荧光双染检测各组 LC3/TUNEL 阳性细胞数（n=12，）
Table4.
Immunofluorescence double staining for LC3/TUNEL positive cells count in each group (n=12, )
图6
免疫荧光双染检测各组 LC3、TUNEL 表达（×200）
a. 假手术组；b. SCI 组；c. 自噬抑制剂组；d. 自噬促进剂组
Figure6. Immunofluorescence double staining in LC3 and TUNEL expression of each group (×200)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.8 Western blot 检测
与假手术组相比，SCI 组、自噬抑制剂组及自噬促进剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低；自噬促进剂组 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著降低，Bcl-2 蛋白表达显著升高；上述组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 7 及表 5。
表5
Western blot 检测各组 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达（n=12，）
Table5.
Expressions of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) proteins in each group detected by Western blot (n=12, %, )
图7
Western blot 检测脊髓组织中 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达
1：假手术组 2：SCI 组 3：自噬抑制剂组 4：自噬促进剂组
Figure7. Western blot analysis of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) protein expression in spinal cord1: Sham operation group 2: SCI group 3: Autophagy inhibitor group 4: Autophagy promoter group
3 讨论
SCI 病理机制较复杂，为评估药物对 SCI 的干预效果，需要首先进行动物实验。目前实验研究制备 SCI 动物模型的方法较多，包括脊髓撞击（Allen 法）、供血管栓塞或结扎造成脊髓缺血、钳夹压迫等[8]，其中脊髓撞击制备的 SCI 模型与临床 SCI 病理过程相似，稳定性好，可信度高，是基础研究常用 SCI 模型制备方法[9]。本研究采用脊髓撞击法制备 SCI 大鼠模型，结果显示，与假手术组相比，SCI 组大鼠 BBB 评分显著降低，运动功能出现障碍；神经细胞周围间隙增大，细胞核仁模糊，细胞肿胀、出现空泡，与 SCI 后脊髓损伤特征相符[7]，提示 SCI 大鼠模型制备成功。
炎性反应是引发脊髓组织损伤的重要原因，神经细胞损伤后能够释放大量炎性因子（如 TNF-α、IL-1β），进一步促进炎性细胞迁移，导致复杂炎症级联反应，造成组织损伤[10]。中性粒细胞是 SCI 发生后发挥主要作用的炎性细胞，研究显示抑制中性粒细胞活化后，能够减轻脊髓功能损伤程度，进而降低神经功能损伤[11]。本研究显示与假手术组相比，SCI 组脊髓组织中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平升高，提示炎性因子参与 SCI 的发生。
近年来，研究发现自噬现象广泛存在于神经疾病，如脑卒中、脑外伤及神经退行性疾病。一般情况下细胞自噬水平较低，适量自噬可促进细胞生存，当细胞受损后，自噬被激活参与损伤细胞及组织，进而影响神经疾病生理过程[12]。自噬体是判定细胞是否出现自噬的主要诊断标志物，脑损伤及 SCI 后均可在受损组织神经细胞中发现自噬小体及自噬泡的形成，表明组织损伤后能够激活自噬[13-14]。本研究透射电镜观察发现，SCI 组出现吞噬颗粒及自噬小体，而自噬抑制剂组出现少量溶酶体及单层膜包裹的自噬囊泡，自噬促进剂组出现大量自噬小体，提示 SCI 后存在自噬，而进一步激活自噬后可显著增加自噬小体数量。LC3 蛋白是目前检测自噬活性的重要标志物，主要定位于自噬体膜上，当受到外界刺激后，LC3 在 Agt4 的催化下发生泛素化形成 LC3-Ⅰ，随后与磷脂酰乙醇胺偶联形成 LC3-Ⅱ，稳定存在于内膜上，因此 LC3 水平可反映自噬程度[15]。Beclin1 是哺乳动物参与自噬的特异基因之一，主要与 PI3K 结合为复合体调控自噬蛋白在自噬小体的位置，进而调控细胞自噬活性，当细胞发生自噬后，其水平迅速升高，可反映细胞自噬程度[16]。本研究发现 SCI 组脊髓组织中 LC3、Beclin1 蛋白阳性率较假手术组显著升高；与 SCI 组相比，自噬抑制剂组 LC3、Beclin1 蛋白阳性率明显降低，而自噬促进剂组显著升高；进一步提示自噬参与 SCI 的发生。
SCI 发生后可引发神经细胞凋亡，然而自噬与凋亡同时存在，两者具体关系目前尚无定论。部分学者认为自噬可诱导或加速细胞凋亡[17]；也有学者认为自噬可通过吞噬受损线粒体，减少细胞凋亡，进而保护细胞[18]。本研究发现 SCI 组脊髓组织神经细胞凋亡率较假手术组显著升高。与 SCI 组相比，自噬抑制剂组大鼠 BBB 评分降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 蛋白表达升高；而自噬促进剂大鼠组 BBB 评分升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2 蛋白表达升高，Bax 蛋白表达降低。LC3/TUNEL 免疫荧光双染得到与 LC3、TUNEL 免疫荧光检测细胞凋亡类似的结果。上述结果提示 SCI 后可激活细胞自噬，能够抑制神经细胞凋亡，进而促进神经功能恢复。
Bcl-2 转录后磷酸化水平对于蛋白发挥抗凋亡作用十分重要，既往研究显示当使用促凋亡剂处理细胞后，能使 Bcl-2 的 Ser 87、Ser 757 位点发生磷酸化，抑制 Bcl-2 转录水平，进而抑制抗凋亡作用，使细胞凋亡率升高[19-20]。体外研究发现，通过诱导心肌细胞中 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 及 T69 位点发生磷酸化，进而导致 Bax 解离，加速心肌细胞的凋亡[21]。以上研究提示 Bcl-2磷酸化水平升高影响细胞的抗凋亡作用，本研究结果显示，与 SCI 组相比，自噬抑制剂组经 3-MA 处理后细胞凋亡率升高，p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低，而自噬促进组结果与之相反。提示 SCI 后自噬水平升高，可能通过下调 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位点磷酸化水平，进而增强抗凋亡作用，抑制脊髓组织神经细胞凋亡。
综上述，大鼠 SCI 后诱导自噬可降低神经细胞凋亡，保护脊髓功能，其机制可能与抑制 BCL-2 蛋白多位点磷酸化有关。本研究尚未就自噬抑制剂和自噬促进剂对假手术大鼠的影响进行观察，仅研究了自噬水平对 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位点磷酸化的影响，对于 Bcl-2 蛋白其他位点磷酸化的作用有待后续深入研究。
