引用本文： 李瑛, 吴冰, 丘志河, 梁达强, 柳海峰, 钟名金, 许鉴, 陈康, 冯文哲, 李皓, 彭亮权, 欧阳侃, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 自体腘绳肌腱移植重建前交叉韧带后移植物胶原纤维直径与 Mohawk 表达水平的相关性研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(9): 1095-1101. doi: 10.7507/1002-1892.201902040 复制
目前，对于前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤临床常选择关节镜下自体腘绳肌腱移植重建[1-3]。肌腱移植物在膝关节内经历缺血坏死、血管重建、细胞增殖和组织成熟等生物学改变过程，最终转变为与正常 ACL 组织学相似的组织，这一过程被定义为 ACL 移植物塑形或韧带化[4-5]。研究发现，移植物塑形结果会直接决定移植物的生物力学特性，进而影响膝关节稳定性及运动功能[6-7]。
Ⅰ、Ⅲ型胶原是韧带和肌腱主要组成成分，也是赋予韧带和肌腱力学特性的重要结构基础。ACL 具有大直径（≥90 nm）与小直径（<90 nm）胶原纤维双峰混合分布模式，大直径胶原纤维因胶原分子间高密度的交联而具有更高的抗张力强度[8-9]。结缔组织的最大载荷强度与胶原纤维的总体平均直径成正相关[10-12]，在 ACL 移植物进入塑形稳定期后（术后 9～36 个月后）移植物的组织学特点，尤其是胶原纤维类型、直径、分布等超微结构特点，是判定移植物最终转归结果的金标准[13]。
Mohawk（MKX）是三氨基酸循环超家族中，非典型的同源异型盒基因编码的调节肌肉、软骨、肌腱、骨骼等组织胶原蛋白合成代谢的关键转录因子[14-15]。我们前期研究发现，在自体肌腱重建 ACL 术后移植物塑形过程中，MKX 发挥至关重要的胶原调控作用，在移植物塑形稳定后，关节镜下评估为塑形良好的移植物较塑形一般的移植物其 MKX 及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达更接近正常 ACL[16]。目前缺少 ACL 移植物 MKX 及胶原纤维超微结构相关性研究。因此，本研究拟对塑形稳定期 ACL 移植物 MKX 表达水平进行观察，分析其与移植物胶原纤维直径的相关性，为研究 MKX 调控 ACL 移植物塑形的相关机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 韧带标本来源
以 2018 年 1 月—8 月于我院行关节镜下自体腘绳肌腱单束重建 ACL 术后 48 个月以上、因移除胫骨端内固定物行二次关节镜探查患者的移植物为研究对象。患者纳入标准：① 关节镜下应用自体腘绳肌腱单束解剖重建 ACL 术后 48 个月以上；重建手术由同一组医生完成，术中腘绳肌腱编织成 4～8 股，移植物直径 7.5～9.0 mm、长 6.5～10.0 cm；股骨端带袢钛板（Smith & Nephew 公司，美国）悬吊固定，胫骨端骨道内固定翼系统及界面螺钉（Smith & Nephew 公司，美国）加骨道外门形钉双重固定；术后采用相同康复计划。② 二次关节镜探查术前 Lachman 试验阴性、轴移试验阴性，KT-2000（MED metric 公司，美国）检查双侧膝关节胫骨前向位移差值≤5 mm，膝关节 Lysholm 评分≥80 分。③ 患膝关节 MRI 检查证实移植物连续性完整，无移植物明显缺失、迂曲及高信号影，MRI 评分[17]≥75 分。④ 二次关节镜探查证实关节内移植物连续性完整、无容量缺损，关节镜下测量移植物直径较重建术时减少比例≤30%。排除标准：① ACL 翻修；② 联合同种异体肌腱重建 ACL；③ 合并膝关节其他慢性代谢或传染性关节病变。
1.2 移植物关节镜下评分
两位未参与 ACL 重建术的高年资医生分别对 ACL 移植物进行关节镜下评估，取均值。根据关节镜下移植物质量评估标准[18-19]进行评分，包括移植物滑膜及血管覆盖、移植物张力、移植物容量及纤维再撕裂情况。其中，移植物关节镜下评分 5～6 分为塑形良好，3～4 分为塑形一般，0～2 分为塑形不良。
1.3 关节镜下取材
关节镜下行移植物探查及关节清理后，使用探钩及射频纵形切开移植物中央表面滑膜，探查确认移植物纤维胫骨端与股骨端完整后，使用自制的 ACL 取样针从移植物中央区域纵向钳取厚 2 mm、长 6 mm 标本，注意避免钳取滑膜组织及避开移植物撕裂或磨损区域。
移植物样本取出后于无菌环境下分为 3 份，其中 2 份进行透射电镜观察，纵切面与横切面各 1 份，大小分别厚 1 mm、长 2 mm 以及厚 2 mm、长 1 mm，标本置于预冷的 4℃ 电镜固定液（2.5% 中性戊二醛）中保存。另外 1 份样本（厚 2 mm、长 3 mm）行实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）检查，标本取出后立即置于液氮罐中保存，然后转移至−80℃ 冰箱冻存。
1.4 透射电镜观察
样本于 2.5% 中性戊二醛固定 2 h 后取出，0.1 mol/L PBS 漂洗 6 次，每次 30 min；1% 锇酸固定 1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 10 min；梯度乙醇脱水，Epon812 树脂包埋；电热鼓风干燥箱中加热聚合固化。超薄切片机（Leica 公司，德国）半薄切片（层厚 1 μm），光镜（OLYMPUS 公司，日本）下定位目标观察区域后行超薄切片，厚度 60 nm。2% 醋酸双氧铀染色 30 min，柠檬酸铅染色 15 min，双蒸水冲洗切片，烤灯下烤 15 min，使切片彻底干燥。
于透射电镜（JEOL 公司，日本）下观察样本胶原纤维超微结构特点，采用自带 RADIUS 采图测量软件进行观察，用 2 160 行/nm 的复制光栅进行放大检查。在横切面样本上测量胶原纤维直径及不同类型纤维比值，每个切片至少测量 5 个视野，取均值。测量指标：移植物胶原纤维直径（Dc）、大直径（≥90 nm）胶原纤维直径（DL）、小直径（< 90 nm）胶原纤维直径（DS）以及大、小直径胶原纤维数量比值（RL/S）。
1.5 qRT-PCR 检测 MKX 表达水平
每个样本取约 200 mg 组织，分离提取总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析和分光度测定 RNA 的完整性和浓度、纯度，然后逆转录合成 cDNA，反应体系如下：5×RT Master Mix 4 μL，RNA Template 2 μg，加入 Nuclease-free Water 至 20 mL。处理步骤：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃ 5 min，离心并−20℃ 保存。于荧光定量 PCR 仪（ABI 7900HT，Applied Biosystems 公司，美国）采用 Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix（Takara 公司，日本）进行检测，以 GAPDH 为内参基因。引物设计：MKX，上游 5′-GAAGGCAACTTTGTCTATCGCA-3′，下游 5′-TGATCTCCTTCCAATACGTGTC-3′；GAPDH，上游 5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。共 40 个循环，退火温度为 60℃。采用 2−ΔΔCt 方法计算目标基因表达，计算与内参基因 GAPDH 的比值作为 MKX 相对表达值。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，检验水准 α=0.05。首先，对 ACL 移植物 MKX 表达水平与 Dc、DL、Ds、RL/S 进行 Spearman 相关分析；若结果呈直线相关，则以 MKX 表达水平为自变量（x）、移植物胶原纤维直径为因变量（y）进一步进行线性回归，以获得二者之间的线性依存关系。
2 结果
2.1 纳入研究患者基本资料
共 26 例患者符合选择标准，其 ACL 移植物标本纳入研究。男 20 例，女 6 例；年龄 21～44 岁，平均 32.3 岁。ACL 重建术至二次关节镜探查时间为 52～128 个月，平均 78.6 个月。二次关节镜探查前，膝关节 Lysholm 评分为 83～96 分，平均 90.3 分。Lachman 试验及轴移试验均为阴性。KT-2000 检测双侧膝关节胫骨前向位移差值为 0～4 mm，平均 2.3 mm。MRI 检查所有移植物连续性完整，无移植物明显缺失、迂曲及高信号影；移植物评分为 78～89 分，平均 82.8 分。关节镜下移植物质量评分为 3～6 分，平均 4.8 分；塑形良好 17 例、塑形一般 9 例。
2.2 透射电镜观察
ACL 移植物均表现为大直径与小直径胶原纤维双峰混合排列，与正常 ACL 类似。与塑形一般的移植物相比，塑形良好的移植物可见更丰富的大直径胶原纤维，且大、小直径胶原纤维间隔交叉分布更均匀、有序（图 1）。
图1
移植物观察
从左至右分别为关节镜下以及纵切面、横切面透射电镜（×50 k）观察 L：大直径胶原纤维 S：小直径胶原纤维a. 塑形良好移植物；b. 塑形一般移植物
Figure1. Graft observationFrom left to right for arthroscopic observation and longitudinal and cross sections observations by transmission electron microscopy (×50 k) L: Large-diameter collagen fiber S: Small-diameter collagen fiber a. Excellent remodeling graft; b. Fair remodeling graft
移植物 Dc、DL、DS 及 RL/S 分别为（65.2±9.3）nm、（91.6±10.5）nm、（45.7±8.6）nm、0.73±0.12。
2.3 移植物 MKX 表达水平及其与移植物胶原纤维直径相关性分析
移植物 MKX 相对表达量为 1.42±0.11。相关分析显示，移植物 MKX 表达水平与 Dc、DL 及 RL/S 成正相关（r=0.809，P=0.000；r=0.861，P=0.000；r=0.942，P=0.000），与 DS 无相关（r=0.147，P=0.238）。进一步回归分析示，MKX 表达水平可以预测移植物 Dc、DL及 RL/S（P<0.05）。见表1。
表1
MKX 表达水平与移植物胶原纤维 DC、DL 及 RL/S 的线性回归分析
Table1.
Linear regression analysis of MKX expression level and DC, DL, and RL/S of graft collagen fiber
3 讨论
3.1 ACL 塑形阶段及塑形时间
自体腘绳肌腱是 ACL 重建常用移植物，在形态学、组织学及生物力学三方面均具有优势[1-3]。然而，移植物组织最终能否完全转化为超微结构类似正常 ACL 的组织，还是仅作为股骨与胫骨之间的纤维连接，目前尚无定论[5]。游离肌腱移植物植入膝关节后，在关节内通过一系列复杂的组织学生物学变化，转变为大体与正常 ACL 相似的组织[4-5]。移植物塑形过程分为塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形稳定期 4 个阶段，一般重建术后 9～18 个月达塑形稳定期[20-21]。但目前对于移植物塑形稳定期时间仍有争议，因为大部分塑形研究均未超过术后 15 个月[5]。Sánchez 等[22]提出 ACL 移植物塑形成熟需要 2 年左右，Rougraff 等[23]报道 ACL 重建术后 3 年仍然可以观察到移植物局部去血管化和细胞富集。为此，为保证移植物均达塑形稳定期，本研究选择 ACL 重建术后至少 4 年的移植物作为研究对象。
3.2 ACL 胶原纤维超微结构特点
自 Parry 等[12]报道成人成熟肌腱及韧带胶原纤维呈双峰分布之后，后续研究将 ACL 胶原纤维分成小直径（细）胶原纤维和大直径（粗）胶原纤维两大类，前者直径范围为 30～90 nm，占整个韧带纤维数量的 70%～80%；后者直径范围为 90～110 nm，占整个韧带纤维的 20%～30%[23-25]。研究发现，粗、细胶原纤维的超微结构不同，前者轮廓不规则、直径大小不统一；后者纤维轮廓规则、边缘平滑、直径统一，直径分布波峰在 45 nm 处[22]。有学者认为肌腱及韧带高抗拉强度与存在大直径胶原纤维相关，因为大直径胶原纤维分子间胶原交联密度更高。相关定量分析证实了这一假设[26]，研究发现在关节外环境中，大直径胶原纤维与猪屈肌腱和伸肌腱拉伸强度存在明显正相关。进一步研究发现，韧带的胶原纤维超微结构特点与韧带局部生物力学环境密切关系，不均匀的大直径胶原纤维有利于韧带抵抗高牵拉应力，而均匀一致的小直径胶原纤维则与韧带抗多向应力相关[27-28]。因此，研究不同塑形情况的移植物胶原纤维超微结构特点，可以掌握移植物的组织学及生物力学特点，进而为研究移植物塑形机制提供良好的评判标准及评估体系。
3.3 ACL 重建术后移植物超微结构变化
ACL 重建术后，肌腱移植物超微结构变化主要体现在胶原纤维数量及大、小直径胶原纤维比例的改变。既往研究发现肌腱移植物在塑形过程中，大直径胶原纤维逐步减少，塑形成熟后只有小直径胶原纤维的单峰分布。Shino 等[25]使用各种同种异体肌腱组织重建 ACL 并分析其胶原纤维构成，发现术后 6 个月内大直径胶原纤维比例下降，但仍呈单峰与双峰混合的双峰分布；6 个月后大直径胶原纤维消失，被小直径胶原纤维取代，呈典型单峰分布。Abe 等[21]发现骨-髌腱-骨移植物在术后 6～15 个月时呈统一的小直径胶原纤维分布，大直径胶原纤维通常在术后 9 个月内减少，术后约 1 年完全消失。Zaffagnini 等[20]研究评估了自体腘绳肌腱重建术后 10 年的超微结构变化特点，结果显示腘绳肌腱移植物胶原纤维数目和直径改变发生在术后 2 年内，表现为移植物胶原纤维直径分布范围小于正常肌腱，大部分胶原纤维直径<50 nm，2 年后移植物超微结构不再发生明显变化，小直径胶原纤维单峰分布一直维持到术后 10 年。这种超微结构变化现象在动物模型中出现更早，Jackson 等[29]报道了山羊 ACL 重建模型中，自体肌腱移植物大直径胶原纤维在术后 12 周即消失，52 周内移植物表面区域大直径胶原纤维完全消失。在其他动物模型中也观察到胶原纤维由双峰向单峰分布的类似变化，不能恢复完整 ACL 中存在的不同类型胶原纤维异质性组成[30-31]。
本研究发现不管是关节镜下评分表现为塑形良好还是塑形一般的 ACL 移植物，在术后 4～10 年均存在大直径胶原纤维的分布，关节镜下塑形成熟度越高的移植物组织，大直径胶原纤维含量越丰富且胶原纤维直径更大，与 Dong 等[32]、夏春等[33]研究结果一致，但是与之前的研究结果不同，分析可能有以下两方面原因：首先，本研究标本均来自取胫骨端内固定物而行二次关节镜探查的患者，其临床功能评分、影像学评分、关节镜评分均表现优良。临床工作中，我们对移植物塑形不良的患者往往采取进一步保守康复治疗，而对失败患者采取翻修手术（部分加强或重建），因此这部分塑形不良或塑形失败的患者未纳入研究。所以本研究只能说明 ACL 重建术后塑形成功的患者，其移植物超微结构特点可以表现为正常 ACL 结构的大、小直径胶原纤维双峰分布特征。其次，ACL 移植物会根据新的生物力学和生物环境进行组织学重建，影响移植物重建过程的因素很多，包括手术技术、移植物固定和康复方案[4]。移植物组织受力强度和持续时间可传导给调控硫酸葡萄糖胺糖合成的细胞，而硫酸葡萄糖胺糖最终决定胶原纤维直径，从而使组织更适应功能和力学需要。大直径胶原纤维占移植物的横截面积越大，移植物抗张力性能越强，反映移植物此时局部的生物力学特点接近正常 ACL。本研究采用的 ACL 解剖重建可能使得移植物在解剖结构特点上更接近正常 ACL，从而具有更类似的局部生物力学环境。同时，本研究纳入患者在术后 2 年内均采取保守的康复策略，以保护移植物在塑形成熟前免受过多外界应力刺激干扰，并防止移植物局部纤维的再撕裂；从术后 6 个月开始，每 3 个月行 MRI 检查，根据患者移植物 MRI 评分不断调整患者运动方式、运动量与运动频率，使得患者 MRI 评分稳步维持在优良水平，从而保证移植物在每个阶段都能有一个适合的力学刺激强度，最终逐步达到正常 ACL 局部生物力学状态，从而有助于移植物胶原纤维超微结构特点向正常 ACL 组织转变。
3.4 移植物 MKX 表达与 ACL 移植物塑形的关系
MKX 是三氨基酸循环超家族中非典型的同源异型盒基因，是肌腱调节胶原蛋白合成代谢的关键基因[14-15]。在损伤肌腱修复过程中，MKX 发挥着重要作用。在肌腱组织损伤早期 MKX 表达增加，可促进肌腱胶原纤维的合成，利于组织修复[32]。骨关节炎患者 ACL 胶原组织排列不规则、紊乱，成纤维细胞中 MKX 表达量明显降低[34]。我们前期研究对不同塑形程度 ACL 移植物的 MKX 及胶原表达进行了对比研究，发现正常 ACL 及塑形良好移植物中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量丰富，纤维排列有序，MKX 阳性细胞比例高；而塑形不良的移植物中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量明显降低，纤维排列较紊乱，MKX 阳性细胞比例减少[16]。
本次研究进一步探讨了移植物 MKX 表达水平与胶原纤维超微结构的相关性，结果表明移植物 MKX 表达水平与移植物大直径胶原纤维分布含量存在密切关系。其中，MKX 相对表达水平与 Dc、DL 及 RL/S 成正相关，与 DS 不相关。因此，在自体腘绳肌腱移植物塑形稳定后，MKX 表达水平可预测电镜下胶原纤维超微结构测量结果，可作为移植物胶原合成代谢水平的重要评估依据。这一研究成果表明在关节内局部生物学及生物力学环境因素的作用下，MKX 可能通过调控表达胶原代谢及硫酸葡萄糖胺糖等相关基因，影响移植物最终胶原构成。由于重建方式、康复方案、膝关节运动方式不同，导致个体 ACL 移植物局部生物力学环境也不同，组织为适应这种生物力学差异表现出了不一样的生物学特性，MKX 通过上调或下调与抗张力强度直接相关的大直径胶原纤维表达水平，从而适应移植物局部生物力学的环境。
本研究着眼于术后塑形稳定期 ACL 移植物的 MKX 与胶原纤维超微结构的相关性，主要存在以下不足：① 本研究是侵入性人体组织活体取材研究，由于伦理要求及限制，不能取韧带中央标本或整条韧带进行多处病理检查。因此，实验结果可能受取材部位的影响，比如移植物表面与移植物中央标本组织学结果可能不同。② 移植物胶原纤维超微结构评估指标还包括胶原纤维横截面面积，弹性纤维及耐酸纤维数量、比例、分布等指标[22]，需要在今后研究中进一步探讨。
作者贡献：陆伟、王大平负责科研设计，李瑛、吴冰、丘志河、梁达强、柳海峰、彭亮权负责实验实施及文章撰写，李皓、钟名金、陈康、冯文哲负责数据收集整理及统计分析，许鉴、欧阳侃、朱伟民负责论文审校。
利益冲突：本文所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。本研究来源的基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）医学伦理委员会批准（批号：20173357201819），患者均知情同意。
目前，对于前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤临床常选择关节镜下自体腘绳肌腱移植重建[1-3]。肌腱移植物在膝关节内经历缺血坏死、血管重建、细胞增殖和组织成熟等生物学改变过程，最终转变为与正常 ACL 组织学相似的组织，这一过程被定义为 ACL 移植物塑形或韧带化[4-5]。研究发现，移植物塑形结果会直接决定移植物的生物力学特性，进而影响膝关节稳定性及运动功能[6-7]。
Ⅰ、Ⅲ型胶原是韧带和肌腱主要组成成分，也是赋予韧带和肌腱力学特性的重要结构基础。ACL 具有大直径（≥90 nm）与小直径（<90 nm）胶原纤维双峰混合分布模式，大直径胶原纤维因胶原分子间高密度的交联而具有更高的抗张力强度[8-9]。结缔组织的最大载荷强度与胶原纤维的总体平均直径成正相关[10-12]，在 ACL 移植物进入塑形稳定期后（术后 9～36 个月后）移植物的组织学特点，尤其是胶原纤维类型、直径、分布等超微结构特点，是判定移植物最终转归结果的金标准[13]。
Mohawk（MKX）是三氨基酸循环超家族中，非典型的同源异型盒基因编码的调节肌肉、软骨、肌腱、骨骼等组织胶原蛋白合成代谢的关键转录因子[14-15]。我们前期研究发现，在自体肌腱重建 ACL 术后移植物塑形过程中，MKX 发挥至关重要的胶原调控作用，在移植物塑形稳定后，关节镜下评估为塑形良好的移植物较塑形一般的移植物其 MKX 及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达更接近正常 ACL[16]。目前缺少 ACL 移植物 MKX 及胶原纤维超微结构相关性研究。因此，本研究拟对塑形稳定期 ACL 移植物 MKX 表达水平进行观察，分析其与移植物胶原纤维直径的相关性，为研究 MKX 调控 ACL 移植物塑形的相关机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 韧带标本来源
以 2018 年 1 月—8 月于我院行关节镜下自体腘绳肌腱单束重建 ACL 术后 48 个月以上、因移除胫骨端内固定物行二次关节镜探查患者的移植物为研究对象。患者纳入标准：① 关节镜下应用自体腘绳肌腱单束解剖重建 ACL 术后 48 个月以上；重建手术由同一组医生完成，术中腘绳肌腱编织成 4～8 股，移植物直径 7.5～9.0 mm、长 6.5～10.0 cm；股骨端带袢钛板（Smith & Nephew 公司，美国）悬吊固定，胫骨端骨道内固定翼系统及界面螺钉（Smith & Nephew 公司，美国）加骨道外门形钉双重固定；术后采用相同康复计划。② 二次关节镜探查术前 Lachman 试验阴性、轴移试验阴性，KT-2000（MED metric 公司，美国）检查双侧膝关节胫骨前向位移差值≤5 mm，膝关节 Lysholm 评分≥80 分。③ 患膝关节 MRI 检查证实移植物连续性完整，无移植物明显缺失、迂曲及高信号影，MRI 评分[17]≥75 分。④ 二次关节镜探查证实关节内移植物连续性完整、无容量缺损，关节镜下测量移植物直径较重建术时减少比例≤30%。排除标准：① ACL 翻修；② 联合同种异体肌腱重建 ACL；③ 合并膝关节其他慢性代谢或传染性关节病变。
1.2 移植物关节镜下评分
两位未参与 ACL 重建术的高年资医生分别对 ACL 移植物进行关节镜下评估，取均值。根据关节镜下移植物质量评估标准[18-19]进行评分，包括移植物滑膜及血管覆盖、移植物张力、移植物容量及纤维再撕裂情况。其中，移植物关节镜下评分 5～6 分为塑形良好，3～4 分为塑形一般，0～2 分为塑形不良。
1.3 关节镜下取材
关节镜下行移植物探查及关节清理后，使用探钩及射频纵形切开移植物中央表面滑膜，探查确认移植物纤维胫骨端与股骨端完整后，使用自制的 ACL 取样针从移植物中央区域纵向钳取厚 2 mm、长 6 mm 标本，注意避免钳取滑膜组织及避开移植物撕裂或磨损区域。
移植物样本取出后于无菌环境下分为 3 份，其中 2 份进行透射电镜观察，纵切面与横切面各 1 份，大小分别厚 1 mm、长 2 mm 以及厚 2 mm、长 1 mm，标本置于预冷的 4℃ 电镜固定液（2.5% 中性戊二醛）中保存。另外 1 份样本（厚 2 mm、长 3 mm）行实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）检查，标本取出后立即置于液氮罐中保存，然后转移至−80℃ 冰箱冻存。
1.4 透射电镜观察
样本于 2.5% 中性戊二醛固定 2 h 后取出，0.1 mol/L PBS 漂洗 6 次，每次 30 min；1% 锇酸固定 1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 10 min；梯度乙醇脱水，Epon812 树脂包埋；电热鼓风干燥箱中加热聚合固化。超薄切片机（Leica 公司，德国）半薄切片（层厚 1 μm），光镜（OLYMPUS 公司，日本）下定位目标观察区域后行超薄切片，厚度 60 nm。2% 醋酸双氧铀染色 30 min，柠檬酸铅染色 15 min，双蒸水冲洗切片，烤灯下烤 15 min，使切片彻底干燥。
于透射电镜（JEOL 公司，日本）下观察样本胶原纤维超微结构特点，采用自带 RADIUS 采图测量软件进行观察，用 2 160 行/nm 的复制光栅进行放大检查。在横切面样本上测量胶原纤维直径及不同类型纤维比值，每个切片至少测量 5 个视野，取均值。测量指标：移植物胶原纤维直径（Dc）、大直径（≥90 nm）胶原纤维直径（DL）、小直径（< 90 nm）胶原纤维直径（DS）以及大、小直径胶原纤维数量比值（RL/S）。
1.5 qRT-PCR 检测 MKX 表达水平
每个样本取约 200 mg 组织，分离提取总 RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析和分光度测定 RNA 的完整性和浓度、纯度，然后逆转录合成 cDNA，反应体系如下：5×RT Master Mix 4 μL，RNA Template 2 μg，加入 Nuclease-free Water 至 20 mL。处理步骤：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃ 5 min，离心并−20℃ 保存。于荧光定量 PCR 仪（ABI 7900HT，Applied Biosystems 公司，美国）采用 Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix（Takara 公司，日本）进行检测，以 GAPDH 为内参基因。引物设计：MKX，上游 5′-GAAGGCAACTTTGTCTATCGCA-3′，下游 5′-TGATCTCCTTCCAATACGTGTC-3′；GAPDH，上游 5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。共 40 个循环，退火温度为 60℃。采用 2−ΔΔCt 方法计算目标基因表达，计算与内参基因 GAPDH 的比值作为 MKX 相对表达值。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，检验水准 α=0.05。首先，对 ACL 移植物 MKX 表达水平与 Dc、DL、Ds、RL/S 进行 Spearman 相关分析；若结果呈直线相关，则以 MKX 表达水平为自变量（x）、移植物胶原纤维直径为因变量（y）进一步进行线性回归，以获得二者之间的线性依存关系。
2 结果
2.1 纳入研究患者基本资料
共 26 例患者符合选择标准，其 ACL 移植物标本纳入研究。男 20 例，女 6 例；年龄 21～44 岁，平均 32.3 岁。ACL 重建术至二次关节镜探查时间为 52～128 个月，平均 78.6 个月。二次关节镜探查前，膝关节 Lysholm 评分为 83～96 分，平均 90.3 分。Lachman 试验及轴移试验均为阴性。KT-2000 检测双侧膝关节胫骨前向位移差值为 0～4 mm，平均 2.3 mm。MRI 检查所有移植物连续性完整，无移植物明显缺失、迂曲及高信号影；移植物评分为 78～89 分，平均 82.8 分。关节镜下移植物质量评分为 3～6 分，平均 4.8 分；塑形良好 17 例、塑形一般 9 例。
2.2 透射电镜观察
ACL 移植物均表现为大直径与小直径胶原纤维双峰混合排列，与正常 ACL 类似。与塑形一般的移植物相比，塑形良好的移植物可见更丰富的大直径胶原纤维，且大、小直径胶原纤维间隔交叉分布更均匀、有序（图 1）。
图1
移植物观察
从左至右分别为关节镜下以及纵切面、横切面透射电镜（×50 k）观察 L：大直径胶原纤维 S：小直径胶原纤维a. 塑形良好移植物；b. 塑形一般移植物
Figure1. Graft observationFrom left to right for arthroscopic observation and longitudinal and cross sections observations by transmission electron microscopy (×50 k) L: Large-diameter collagen fiber S: Small-diameter collagen fiber a. Excellent remodeling graft; b. Fair remodeling graft
移植物 Dc、DL、DS 及 RL/S 分别为（65.2±9.3）nm、（91.6±10.5）nm、（45.7±8.6）nm、0.73±0.12。
2.3 移植物 MKX 表达水平及其与移植物胶原纤维直径相关性分析
移植物 MKX 相对表达量为 1.42±0.11。相关分析显示，移植物 MKX 表达水平与 Dc、DL 及 RL/S 成正相关（r=0.809，P=0.000；r=0.861，P=0.000；r=0.942，P=0.000），与 DS 无相关（r=0.147，P=0.238）。进一步回归分析示，MKX 表达水平可以预测移植物 Dc、DL及 RL/S（P<0.05）。见表1。
表1
MKX 表达水平与移植物胶原纤维 DC、DL 及 RL/S 的线性回归分析
Table1.
Linear regression analysis of MKX expression level and DC, DL, and RL/S of graft collagen fiber
3 讨论
3.1 ACL 塑形阶段及塑形时间
自体腘绳肌腱是 ACL 重建常用移植物，在形态学、组织学及生物力学三方面均具有优势[1-3]。然而，移植物组织最终能否完全转化为超微结构类似正常 ACL 的组织，还是仅作为股骨与胫骨之间的纤维连接，目前尚无定论[5]。游离肌腱移植物植入膝关节后，在关节内通过一系列复杂的组织学生物学变化，转变为大体与正常 ACL 相似的组织[4-5]。移植物塑形过程分为塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形稳定期 4 个阶段，一般重建术后 9～18 个月达塑形稳定期[20-21]。但目前对于移植物塑形稳定期时间仍有争议，因为大部分塑形研究均未超过术后 15 个月[5]。Sánchez 等[22]提出 ACL 移植物塑形成熟需要 2 年左右，Rougraff 等[23]报道 ACL 重建术后 3 年仍然可以观察到移植物局部去血管化和细胞富集。为此，为保证移植物均达塑形稳定期，本研究选择 ACL 重建术后至少 4 年的移植物作为研究对象。
3.2 ACL 胶原纤维超微结构特点
自 Parry 等[12]报道成人成熟肌腱及韧带胶原纤维呈双峰分布之后，后续研究将 ACL 胶原纤维分成小直径（细）胶原纤维和大直径（粗）胶原纤维两大类，前者直径范围为 30～90 nm，占整个韧带纤维数量的 70%～80%；后者直径范围为 90～110 nm，占整个韧带纤维的 20%～30%[23-25]。研究发现，粗、细胶原纤维的超微结构不同，前者轮廓不规则、直径大小不统一；后者纤维轮廓规则、边缘平滑、直径统一，直径分布波峰在 45 nm 处[22]。有学者认为肌腱及韧带高抗拉强度与存在大直径胶原纤维相关，因为大直径胶原纤维分子间胶原交联密度更高。相关定量分析证实了这一假设[26]，研究发现在关节外环境中，大直径胶原纤维与猪屈肌腱和伸肌腱拉伸强度存在明显正相关。进一步研究发现，韧带的胶原纤维超微结构特点与韧带局部生物力学环境密切关系，不均匀的大直径胶原纤维有利于韧带抵抗高牵拉应力，而均匀一致的小直径胶原纤维则与韧带抗多向应力相关[27-28]。因此，研究不同塑形情况的移植物胶原纤维超微结构特点，可以掌握移植物的组织学及生物力学特点，进而为研究移植物塑形机制提供良好的评判标准及评估体系。
3.3 ACL 重建术后移植物超微结构变化
ACL 重建术后，肌腱移植物超微结构变化主要体现在胶原纤维数量及大、小直径胶原纤维比例的改变。既往研究发现肌腱移植物在塑形过程中，大直径胶原纤维逐步减少，塑形成熟后只有小直径胶原纤维的单峰分布。Shino 等[25]使用各种同种异体肌腱组织重建 ACL 并分析其胶原纤维构成，发现术后 6 个月内大直径胶原纤维比例下降，但仍呈单峰与双峰混合的双峰分布；6 个月后大直径胶原纤维消失，被小直径胶原纤维取代，呈典型单峰分布。Abe 等[21]发现骨-髌腱-骨移植物在术后 6～15 个月时呈统一的小直径胶原纤维分布，大直径胶原纤维通常在术后 9 个月内减少，术后约 1 年完全消失。Zaffagnini 等[20]研究评估了自体腘绳肌腱重建术后 10 年的超微结构变化特点，结果显示腘绳肌腱移植物胶原纤维数目和直径改变发生在术后 2 年内，表现为移植物胶原纤维直径分布范围小于正常肌腱，大部分胶原纤维直径<50 nm，2 年后移植物超微结构不再发生明显变化，小直径胶原纤维单峰分布一直维持到术后 10 年。这种超微结构变化现象在动物模型中出现更早，Jackson 等[29]报道了山羊 ACL 重建模型中，自体肌腱移植物大直径胶原纤维在术后 12 周即消失，52 周内移植物表面区域大直径胶原纤维完全消失。在其他动物模型中也观察到胶原纤维由双峰向单峰分布的类似变化，不能恢复完整 ACL 中存在的不同类型胶原纤维异质性组成[30-31]。
本研究发现不管是关节镜下评分表现为塑形良好还是塑形一般的 ACL 移植物，在术后 4～10 年均存在大直径胶原纤维的分布，关节镜下塑形成熟度越高的移植物组织，大直径胶原纤维含量越丰富且胶原纤维直径更大，与 Dong 等[32]、夏春等[33]研究结果一致，但是与之前的研究结果不同，分析可能有以下两方面原因：首先，本研究标本均来自取胫骨端内固定物而行二次关节镜探查的患者，其临床功能评分、影像学评分、关节镜评分均表现优良。临床工作中，我们对移植物塑形不良的患者往往采取进一步保守康复治疗，而对失败患者采取翻修手术（部分加强或重建），因此这部分塑形不良或塑形失败的患者未纳入研究。所以本研究只能说明 ACL 重建术后塑形成功的患者，其移植物超微结构特点可以表现为正常 ACL 结构的大、小直径胶原纤维双峰分布特征。其次，ACL 移植物会根据新的生物力学和生物环境进行组织学重建，影响移植物重建过程的因素很多，包括手术技术、移植物固定和康复方案[4]。移植物组织受力强度和持续时间可传导给调控硫酸葡萄糖胺糖合成的细胞，而硫酸葡萄糖胺糖最终决定胶原纤维直径，从而使组织更适应功能和力学需要。大直径胶原纤维占移植物的横截面积越大，移植物抗张力性能越强，反映移植物此时局部的生物力学特点接近正常 ACL。本研究采用的 ACL 解剖重建可能使得移植物在解剖结构特点上更接近正常 ACL，从而具有更类似的局部生物力学环境。同时，本研究纳入患者在术后 2 年内均采取保守的康复策略，以保护移植物在塑形成熟前免受过多外界应力刺激干扰，并防止移植物局部纤维的再撕裂；从术后 6 个月开始，每 3 个月行 MRI 检查，根据患者移植物 MRI 评分不断调整患者运动方式、运动量与运动频率，使得患者 MRI 评分稳步维持在优良水平，从而保证移植物在每个阶段都能有一个适合的力学刺激强度，最终逐步达到正常 ACL 局部生物力学状态，从而有助于移植物胶原纤维超微结构特点向正常 ACL 组织转变。
3.4 移植物 MKX 表达与 ACL 移植物塑形的关系
MKX 是三氨基酸循环超家族中非典型的同源异型盒基因，是肌腱调节胶原蛋白合成代谢的关键基因[14-15]。在损伤肌腱修复过程中，MKX 发挥着重要作用。在肌腱组织损伤早期 MKX 表达增加，可促进肌腱胶原纤维的合成，利于组织修复[32]。骨关节炎患者 ACL 胶原组织排列不规则、紊乱，成纤维细胞中 MKX 表达量明显降低[34]。我们前期研究对不同塑形程度 ACL 移植物的 MKX 及胶原表达进行了对比研究，发现正常 ACL 及塑形良好移植物中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量丰富，纤维排列有序，MKX 阳性细胞比例高；而塑形不良的移植物中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量明显降低，纤维排列较紊乱，MKX 阳性细胞比例减少[16]。
本次研究进一步探讨了移植物 MKX 表达水平与胶原纤维超微结构的相关性，结果表明移植物 MKX 表达水平与移植物大直径胶原纤维分布含量存在密切关系。其中，MKX 相对表达水平与 Dc、DL 及 RL/S 成正相关，与 DS 不相关。因此，在自体腘绳肌腱移植物塑形稳定后，MKX 表达水平可预测电镜下胶原纤维超微结构测量结果，可作为移植物胶原合成代谢水平的重要评估依据。这一研究成果表明在关节内局部生物学及生物力学环境因素的作用下，MKX 可能通过调控表达胶原代谢及硫酸葡萄糖胺糖等相关基因，影响移植物最终胶原构成。由于重建方式、康复方案、膝关节运动方式不同，导致个体 ACL 移植物局部生物力学环境也不同，组织为适应这种生物力学差异表现出了不一样的生物学特性，MKX 通过上调或下调与抗张力强度直接相关的大直径胶原纤维表达水平，从而适应移植物局部生物力学的环境。
本研究着眼于术后塑形稳定期 ACL 移植物的 MKX 与胶原纤维超微结构的相关性，主要存在以下不足：① 本研究是侵入性人体组织活体取材研究，由于伦理要求及限制，不能取韧带中央标本或整条韧带进行多处病理检查。因此，实验结果可能受取材部位的影响，比如移植物表面与移植物中央标本组织学结果可能不同。② 移植物胶原纤维超微结构评估指标还包括胶原纤维横截面面积，弹性纤维及耐酸纤维数量、比例、分布等指标[22]，需要在今后研究中进一步探讨。
作者贡献：陆伟、王大平负责科研设计，李瑛、吴冰、丘志河、梁达强、柳海峰、彭亮权负责实验实施及文章撰写，李皓、钟名金、陈康、冯文哲负责数据收集整理及统计分析，许鉴、欧阳侃、朱伟民负责论文审校。
利益冲突：本文所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。本研究来源的基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）医学伦理委员会批准（批号：20173357201819），患者均知情同意。
