引用本文： 尚小可, 王辉辉, 李箭, 李棋. 前交叉韧带重建同种异体移植物灭菌及保存方法的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(9): 1102-1107. doi: 10.7507/1002-1892.201903078 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂临床常见，多为运动伤和交通事故伤[1]。随着关节镜技术发展，关节镜下重建已成为治疗 ACL 损伤的标准术式。移植物是影响手术效果重要因素，目前临床可选择自体、同种异体移植物和人工韧带[2]。其中，同种异体移植物优点突出，不仅具有与人工韧带相似的优点[3]，如无供区并发症、有多种规格可供选择等，生物结构和功能方面与自体肌腱相似，而且无自体移植物相关的供区并发症[4]。但医生对同种异体移植物灭菌及保存过程不了解，使其临床应用受到一定影响。美国一项调查研究显示，曾经选择同种异体移植物进行 ACL 重建的医生中，仅 34% 左右熟悉灭菌及保存过程，21% 不清楚选用的移植物是否接受过辐照处理，高达 57% 的医生不了解同种异体移植物的安全性和临床效果[5]。鉴于此，我们对 ACL 重建术中使用的同种异体移植物灭菌、保存方法以及相关研究进展进行总结分析，以供参考。
1 同种异体移植物灭菌
1.1 灭菌必要性
灭菌重点针对 ACL 重建术后可能发生的感染。与感染相关的病原微生物包括细菌和病毒两大类，细菌主要是在移植物取材、加工及保存过程中被污染，而病毒多直接来自于供体。因此，灭菌的目的是杀灭可能污染的病原微生物，同时避免病毒传播。
1.1.1 细菌污染
同种异体移植物存在细菌污染的可能，一方面由于条件限制，多数情况下不能达到无菌取材；另一方面尸体存放时间过久，引起腐败菌大量繁殖。文献报道，同种异体移植物植入人体前常规细菌培养阳性率为 4.8%～13.2%，尸体供体组织平均污染率为 6.5%～53%[6]。Díaz-de-Rada 等[6]对 210 例同种异体移植物进行术前常规细菌培养，10 例培养结果阳性，其中 6 例为凝固酶阴性葡萄球菌、1 例a-链球菌、1 例大肠杆菌、1 例梭状芽孢杆菌、1 例多细菌混合感染。然而，患者采用细菌培养阳性的移植物重建 ACL 后均未发生感染，相反 1 例采用阴性移植物重建后发生了金黄色葡萄球菌感染，提示术前移植物细菌培养阳性和术后患者发生感染间无直接相关性。但是由于 ACL 重建术后感染后果严重，有可能导致手术失败甚至翻修，因此为慎重起见，有必要进行灭菌处理。
1.1.2 病毒传播
同种异体移植物可能传播的病毒包括 HIV 病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒等[7]。目前报道的因植入同种异体移植物感染 HIV 病毒的患者有 3 例，首例报道于 1984 年，近 25 年来没有新发病例[8]，这与近年严格的捐赠者筛查和检测技术发展（如病毒核酸检测）等有关。2003 年，美国疾病控制与预防中心（CDC）报道了 1 例因使用同种异体移植物行 ACL 重建发生丙型肝炎病毒感染病例，追踪调查发现移植物来源于原始血清丙型肝炎病毒抗体检测阴性但经核酸检测呈阳性的患者，该病例提示仅采用标准血清酶学检查存在病毒感染风险[9]。因此，美国食品与药品管理局（FDA）和美国组织库协会（AATB）分别于 2005 年和 2007 年要求使用更加敏感的筛检方法筛查捐赠者。然而，即使严格筛选供体，文献报道风险小于 0.015%，但同种异体移植物仍存在传播疾病风险[10]，因此需要严格灭菌处理。
1.2 灭菌方法
美国 FDA 要求组织库无菌保障水平（sterility assurance level，SAL）为 1×10–3，此水平通常无菌获取移植物即可达到。而 AATB 要求组织库如需认证，SAL 必须达到 1×10–6，该阈值意味着微生物在移植物上存活的风险小于 1/100 万，除无菌获取移植物外，还需要进行灭菌才能达到。目前多数组织库建议移植物存贮 SAL 为 1×10–6，以最大限度降低术后感染风险[10]。为了达到该 SAL，可采用不同灭菌方法处理同种异体移植物，主要分为物理方法、化学方法和联合方法。
1.2.1 物理方法
① γ 射线辐照：γ 射线是由放射性同位素 60Co 产生的电子束，通过电离辐射作用到被辐照物体上，产生电离和激发作用并释放出轨道电子形成自由基，通过破坏微生物的 DNA 核酸分子、蛋白质以及细胞活性酶类起到灭菌作用[11]。γ 射线剂量单位有 kGy 和 Mrad（10 kGy=1 Mrad）。
γ 射线辐照对移植物的力学强度存在损害，超过 3 Mrad 辐照会破坏移植物胶原纤维，导致胶原纤维交联密度减小，进而影响移植物结构性能和生物力学特性。然而，目前对于安全的辐照剂量仍没有定论。2017 年，Lansdown 等[12]对不同剂量 γ 射线辐照后的移植物生物力学强度进行了 meta 分析，结果表明即使低剂量（≤20 kGy）辐照对移植物力学强度的影响也很复杂。当辐照剂量为 10～12 kGy 时，移植物刚度降低 20%；12～18 kGy 时，移植物生物力学强度无显著改变；而增加至 20 kGy 时，移植物最大失败载荷降低 20%。Yanke 等[13]也发现即使采用低剂量（1.0～1.2 Mrad）γ 射线辐照，移植物力学强度也会降低 20%。Fideler 等[14]报道采用 2.0 Mrad γ 射线照射新鲜冰冻同种异体骨-髌腱-骨后，其生物力学性能下降 15%。
如何平衡预防术后感染与减少辐照对移植物力学性能影响是学者们努力的方向。目前，用于抵消 γ 射线不良影响的措施包括低剂量 γ 射线结合化学处理方法、干冰内低温下辐照[15-18]和添加辐照保护剂[19-20]等。但这些措施仍处于探索阶段。
② 电子束（electronic beam，EB）：EB 灭菌法属于冷加工灭菌技术范畴，是利用电子加速器辐照装置产生高能 EB 进行辐照，使微生物 DNA 等发生不可逆变化，进而达到灭菌目的[21]。EB 灭菌法曾被认为是比 γ 射线辐照更有希望的方法，然而目前研究结果仍存在一些争议。Hoburg 等[22]研究了不同剂量（15、25、34 kGy）EB 辐照 10 mm 宽骨-髌腱-骨移植物（移植物放入干冰中），与未经辐照移植物相比，15 kGy 和 25 kGy 辐照剂量下移植物最大失败载荷和刚度无显著降低；34 kGy 辐照下移植物最大失败载荷下降约 20%。然而，Schmidt 等[21]采用 34 kGy EB 辐照绵羊趾浅屈肌腱，结果发现 EB 辐照会显著改变移植物重塑过程，随着时间推移移植物生物力学强度显著降低。因此，EB 灭菌法的有效性及安全性还需要进一步验证。
③ 巴氏消毒法、干热及湿热灭菌法：巴氏消毒法[23]、干热及湿热灭菌法是利用多数细菌不能耐受低温、高温、高压等特殊环境及温度来达到灭菌目的。巴氏消毒法不能杀灭所有微生物，一些耐热或者耐冷的细菌仍然可以存活。此外，经巴氏消毒法处理后的物品其保存期短，最长为 2 周，因此不适合用于同种异体移植物的灭菌处理。
湿热灭菌法常用于药物生产过程中，利用高温、高压蒸汽作为介质使细菌蛋白质变性坏死而达到灭菌目的。干热灭菌法要求温度更高，主要用于冻干产品的灭菌处理，但是温度过高容易导致胶原纤维脆性增加、弹性显著降低。因此，干热及湿热灭菌法也不适合用于同种异体移植物的灭菌处理。
1.2.2 化学方法
① 环氧乙烷（ethylene oxide，ETO）：ETO 是一种广谱高效的灭菌剂，常温下呈气态，可以与细菌、病毒等微生物的蛋白质、DNA 或 RNA 发生烷基化反应（非特异性），在常温下杀灭包括芽孢、病毒、真菌等在内的各种微生物，在医学及工业领域被广泛应用。但是，ETO 易燃、易爆、有毒，对人体有一定毒性，并且穿透能力有限，这些因素限制了 ETO 的应用[24]。另外，ETO 代谢产物可残留在物品或者材料上，例如氯乙醇乙烷以及乙二醇乙烷，这些残留物会引发关节内滑膜炎症，导致反复关节积液，损害移植物并造成手术失败风险增加[25]。Drez 等[26]的一项研究显示，与未处理的移植物相比，经 ETO 处理后的移植物最大应力下降 29%、刚度下降 43%。因此，AATB 不建议采用 ETO 对同种异体移植物进行灭菌处理。
② 药物浸泡法：药物浸泡法包括乙醇、过氧乙酸-乙醇、甲醇/氯仿等。乙醇浸泡法常用于医疗器械灭菌处理，较少用于同种异体移植物。同时乙醇浸泡灭菌能力有限，对病毒类微生物灭菌作用较弱。过氧乙酸-乙醇对于病毒等微生物具有较好的灭菌效果，但是其腐蚀性较强且具有强氧化性能，用于同种异体移植物等生物制品时风险极高。然而，Scheffler 等[27]发现过氧乙酸-乙醇处理同种异体跟腱、皮肤及软骨时未对这些组织产生不利影响。因此，关于过氧乙酸-乙醇的处理效果还需要更多研究进行验证。
1.2.3 联合方法
物理方法与化学方法的综合灭菌方法主要有 4 种。① BioCleanse®方法：BioCleanse®灭菌首先需要对移植物进行超声洗浴处理，彻底清除在固定阶段残留的清洗剂、H2O2、乙醇等，然后反复进行真空-压力循环促进基质渗透，破坏细菌细胞壁达到灭菌目的[28-29]。目前报道的采用 BioCleanse®方法对同种异体移植物进行灭菌处理效果差异较大，仍然存在争议。Schimizzi 等[30]的生物力学测试结果显示，BioCleanse®处理的同种异体移植物生物力学性能与 γ 射线辐照（20～26 kGy）处理的移植物以及新鲜冰冻肌腱相当。2017 年，Maletis 等[28]进行了一项包含 14 015 例患者的队列研究，发现经 BioCleanse®灭菌处理的同种异体移植物重建后，翻修率比自体骨-髌腱-骨移植物重建高 4.67 倍；采用 BioCleanse®处理的同种异体移植物重建 ACL 后 2.5 年内，每 17 例患者就有 1 例面临翻修风险。Tejwani 等[29]也报道采用 BioCleanse®处理的同种异体移植物重建 ACL 的失败风险为 0～31%，并且将 BioCleanse®处理的同种异体移植物作为术后失败独立危险因素。
② Allowash、Allowash XG 和 AlloTrue 方法：Allowash 和 Allowash XG 两种方法均包括了一系列冲洗、离心、低渗和超声强化过程，区别是 Allowash 整个过程中不需要再辐照处理，而 Allowash XG 在灭菌最后阶段需要低剂量（<2.0 Mrad）γ 射线辐照[28]。AlloTrue 有别于前两种方法，除非移植物是在无菌条件下获取的，否则大多数情况下需要低剂量（1～1.3 Mrad）γ 射线辐照。Tejwani 等[29]研究发现，相比于 BioCleanse®处理方法，使用 AlloWash 或 AlloTrue 未显著增加患者术后翻修风险。但是由于目前研究比较少，还需要更多的临床结果来验证，以得出更确切结论。
③ MTF 和 Tutoplast：MTF 是美国肌肉骨骼移植基金会早年采用的一项灭菌技术，灭菌过程包括抗生素浸泡、搅拌、控制和纯净水冲洗，整个过程不使用 H2O2，40%～65% 移植物在冷冻状态下接受预先辐照处理，辐照剂量通常选择低剂量（1.2～1.8 Mrad）[31]。而 Tutoplast 灭菌法需要使用 H2O2，其次还包括超声强化、丙酮、高渗溶液、NaOH 等，与 MTF 一样最终需低剂量 γ 射线（1.78～2.01 Mrad）辐照处理。根据文献报道采用 Tutoplast 处理的移植物重建 ACL 后，6 年内失败率达 45%[32]，因此目前已经很少使用。
④ 超临界 CO2 消毒（super critical CO2，SCCO2）：SCCO2 既往多应用于化学工业、分离工程和材料制备等领域[33]，近年来有学者将其用于同种异体移植物的灭菌处理[34]。移植物密封后置于充满 CO2 的舱内进行升压，直到 CO2 由气态变为液态，利用 SCCO2 对物体的超强渗透能力作用于微生物，改变微生物生长环境，影响新陈代谢，最终起到杀菌作用。有研究比较了 SCCO2 消毒方法、γ 射线辐照（2.0～2.8 Mrad）和未处理的同种异体肌腱，结果发现 SCCO2 灭菌没有显著降低同种异体肌腱强度，在循环测试的生物力学试验中显示了良好的力学性能[35]。SCCO2 灭菌法的原理及效果目前尚缺乏更多研究数据，同时由于移植物需要在 CO2 舱内进行升压，是否会影响移植物的胶原纤维特性还需要更多研究。
2 同种异体移植物保存
同种异体移植物保存方法主要有冷冻保存、玻璃化法保存和冻干保存 3 类，其中冷冻保存可进一步分为普通低温保存、深低温保存和超深低温保存。
2.1 冷冻保存
普通低温保存、深低温保存和超深低温保存的区别是保存温度不同[36]。普通低温保存通常保存于−20℃ 冰箱中；超深低温保存保存于−196℃ 液氮中；深低温保存通常采用缓慢梯度降温后，将肌腱存储于−80℃ 环境中[37]。
移植物冷冻保存过程中细胞内外容易形成大量冰晶，冰晶对移植物的损害作用主要有两点，一是引起细胞机械性破坏，二是因胞内水分结冰电解质浓缩导致细胞中毒死亡[38-39]。为了减少冰晶引起的细胞损害，移植物冻融过程采取“缓慢降温、快速复温”原则[40]。冷冻保存的同种异体移植物复温时细胞外冰晶先溶解，因此吸收了细胞周围大量热能，导致细胞内冰晶进一步形成，缓慢融冻加剧了这一恶性循环。然而，快速复温由于短期温度较高，除了满足细胞外冰晶融化的需要外，细胞内的冰晶融化也得以满足，因此对组织破坏小，相对起到保护作用。
2.2 玻璃化法保存
玻璃化法又称为无冰晶技术或少冰晶技术，采用高浓度溶液单相快速降温技术，使溶液直接进入玻璃化状态，减少冰晶形成，避免移植物内部因冰晶形成而造成挤压损伤和冻融效应，有效保存了组织及细胞的活性。有研究比较了冷冻保存和玻璃化法对肌腱细胞活性的影响，结果显示冷冻保存下肌腱细胞的存活率只有 49.63%、而玻璃化法为 78.49%[41]。冷冻保存时肌腱细胞皱缩变形，甚至变性坏死明显，胶原排列紊乱，细胞外基质不同程度损伤。而玻璃化法尽管对肌腱细胞也有损伤，但是损伤轻微，尤其对于胶原纤维及细胞外基质损伤较轻，有研究报道玻璃化法保存后 45%～80% 肌腱细胞能在低免疫原性状态下存活[42]。
2.3 冻干保存
冻干保存肌腱冻干前先经过低温冷冻 4 h，然后在低温真空负压下脱水升华消耗水分，使水分含量低于 5%，使用前生理盐水中充分水化至少 30 min。冻干保存最大优势是携带和保存方便，室温下可保存 5 年左右[43]。
学者们对于冻干移植物重建 ACL 的效果进行了大量研究，但是总体结果不理想，尤其是冻干处理结合环氧乙烷消毒或者 γ 射线辐照时术后失败率较高[44-45]。Sterling 等[46]随访了 36 例采用冻干处理骨-髌腱-骨重建 ACL 患者临床效果，移植物在植入前同时接受了环氧乙烷消毒，术后 2 年随访发现 8 例患者发生了移植物溶解失效。Gut 等[47]发现即使是相同剂量的 γ 射线辐照，冻干同种异体移植物的生物力学强度下降幅度是新鲜冷冻移植物的 2 倍；35 kGy γ 射线辐照下，冻干同种异体移植物的最大失败载荷相较新鲜自体移植物下降 40%。
3 总结
合理选择同种异体移植物是 ACL 重建手术成功的关键。同种异体移植物在取材、加工及保存过程中可能存在细菌污染以及来源供体存在病毒的风险，因此有必要进行灭菌处理。目前最常用的灭菌方法是 γ 射线辐照，但是最佳辐照剂量仍不清楚。EB 辐照也是可供选择灭菌方法之一，但辐照剂量过大对移植物改造塑形有明显影响。物理与化学方法结合的联合方法仍处于探索阶段。对于同种异体移植物的保存，深低温冷冻是目前最常用的一种方法。采用深低温冷冻移植物时，应坚持“缓慢降温，快速复温”的原则，以减少冰晶对移植物的影响。冻干保存结合辐照处理对移植物生物学性能有明显影响，因此不宜用于同种异体移植物的处理。临床医生选择重建 ACL 的同种异体移植物时，应该综合考虑上述因素。
作者贡献：尚小可查阅文献、搜集和整理文献，并撰写文章；王辉辉查阅并整理文献；李箭审校文章；李棋整理文献并审校文章。
利益冲突：所有作者声明，在文章撰写过程中不存在任何利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂临床常见，多为运动伤和交通事故伤[1]。随着关节镜技术发展，关节镜下重建已成为治疗 ACL 损伤的标准术式。移植物是影响手术效果重要因素，目前临床可选择自体、同种异体移植物和人工韧带[2]。其中，同种异体移植物优点突出，不仅具有与人工韧带相似的优点[3]，如无供区并发症、有多种规格可供选择等，生物结构和功能方面与自体肌腱相似，而且无自体移植物相关的供区并发症[4]。但医生对同种异体移植物灭菌及保存过程不了解，使其临床应用受到一定影响。美国一项调查研究显示，曾经选择同种异体移植物进行 ACL 重建的医生中，仅 34% 左右熟悉灭菌及保存过程，21% 不清楚选用的移植物是否接受过辐照处理，高达 57% 的医生不了解同种异体移植物的安全性和临床效果[5]。鉴于此，我们对 ACL 重建术中使用的同种异体移植物灭菌、保存方法以及相关研究进展进行总结分析，以供参考。
1 同种异体移植物灭菌
1.1 灭菌必要性
灭菌重点针对 ACL 重建术后可能发生的感染。与感染相关的病原微生物包括细菌和病毒两大类，细菌主要是在移植物取材、加工及保存过程中被污染，而病毒多直接来自于供体。因此，灭菌的目的是杀灭可能污染的病原微生物，同时避免病毒传播。
1.1.1 细菌污染
同种异体移植物存在细菌污染的可能，一方面由于条件限制，多数情况下不能达到无菌取材；另一方面尸体存放时间过久，引起腐败菌大量繁殖。文献报道，同种异体移植物植入人体前常规细菌培养阳性率为 4.8%～13.2%，尸体供体组织平均污染率为 6.5%～53%[6]。Díaz-de-Rada 等[6]对 210 例同种异体移植物进行术前常规细菌培养，10 例培养结果阳性，其中 6 例为凝固酶阴性葡萄球菌、1 例a-链球菌、1 例大肠杆菌、1 例梭状芽孢杆菌、1 例多细菌混合感染。然而，患者采用细菌培养阳性的移植物重建 ACL 后均未发生感染，相反 1 例采用阴性移植物重建后发生了金黄色葡萄球菌感染，提示术前移植物细菌培养阳性和术后患者发生感染间无直接相关性。但是由于 ACL 重建术后感染后果严重，有可能导致手术失败甚至翻修，因此为慎重起见，有必要进行灭菌处理。
1.1.2 病毒传播
同种异体移植物可能传播的病毒包括 HIV 病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒等[7]。目前报道的因植入同种异体移植物感染 HIV 病毒的患者有 3 例，首例报道于 1984 年，近 25 年来没有新发病例[8]，这与近年严格的捐赠者筛查和检测技术发展（如病毒核酸检测）等有关。2003 年，美国疾病控制与预防中心（CDC）报道了 1 例因使用同种异体移植物行 ACL 重建发生丙型肝炎病毒感染病例，追踪调查发现移植物来源于原始血清丙型肝炎病毒抗体检测阴性但经核酸检测呈阳性的患者，该病例提示仅采用标准血清酶学检查存在病毒感染风险[9]。因此，美国食品与药品管理局（FDA）和美国组织库协会（AATB）分别于 2005 年和 2007 年要求使用更加敏感的筛检方法筛查捐赠者。然而，即使严格筛选供体，文献报道风险小于 0.015%，但同种异体移植物仍存在传播疾病风险[10]，因此需要严格灭菌处理。
1.2 灭菌方法
美国 FDA 要求组织库无菌保障水平（sterility assurance level，SAL）为 1×10–3，此水平通常无菌获取移植物即可达到。而 AATB 要求组织库如需认证，SAL 必须达到 1×10–6，该阈值意味着微生物在移植物上存活的风险小于 1/100 万，除无菌获取移植物外，还需要进行灭菌才能达到。目前多数组织库建议移植物存贮 SAL 为 1×10–6，以最大限度降低术后感染风险[10]。为了达到该 SAL，可采用不同灭菌方法处理同种异体移植物，主要分为物理方法、化学方法和联合方法。
1.2.1 物理方法
① γ 射线辐照：γ 射线是由放射性同位素 60Co 产生的电子束，通过电离辐射作用到被辐照物体上，产生电离和激发作用并释放出轨道电子形成自由基，通过破坏微生物的 DNA 核酸分子、蛋白质以及细胞活性酶类起到灭菌作用[11]。γ 射线剂量单位有 kGy 和 Mrad（10 kGy=1 Mrad）。
γ 射线辐照对移植物的力学强度存在损害，超过 3 Mrad 辐照会破坏移植物胶原纤维，导致胶原纤维交联密度减小，进而影响移植物结构性能和生物力学特性。然而，目前对于安全的辐照剂量仍没有定论。2017 年，Lansdown 等[12]对不同剂量 γ 射线辐照后的移植物生物力学强度进行了 meta 分析，结果表明即使低剂量（≤20 kGy）辐照对移植物力学强度的影响也很复杂。当辐照剂量为 10～12 kGy 时，移植物刚度降低 20%；12～18 kGy 时，移植物生物力学强度无显著改变；而增加至 20 kGy 时，移植物最大失败载荷降低 20%。Yanke 等[13]也发现即使采用低剂量（1.0～1.2 Mrad）γ 射线辐照，移植物力学强度也会降低 20%。Fideler 等[14]报道采用 2.0 Mrad γ 射线照射新鲜冰冻同种异体骨-髌腱-骨后，其生物力学性能下降 15%。
如何平衡预防术后感染与减少辐照对移植物力学性能影响是学者们努力的方向。目前，用于抵消 γ 射线不良影响的措施包括低剂量 γ 射线结合化学处理方法、干冰内低温下辐照[15-18]和添加辐照保护剂[19-20]等。但这些措施仍处于探索阶段。
② 电子束（electronic beam，EB）：EB 灭菌法属于冷加工灭菌技术范畴，是利用电子加速器辐照装置产生高能 EB 进行辐照，使微生物 DNA 等发生不可逆变化，进而达到灭菌目的[21]。EB 灭菌法曾被认为是比 γ 射线辐照更有希望的方法，然而目前研究结果仍存在一些争议。Hoburg 等[22]研究了不同剂量（15、25、34 kGy）EB 辐照 10 mm 宽骨-髌腱-骨移植物（移植物放入干冰中），与未经辐照移植物相比，15 kGy 和 25 kGy 辐照剂量下移植物最大失败载荷和刚度无显著降低；34 kGy 辐照下移植物最大失败载荷下降约 20%。然而，Schmidt 等[21]采用 34 kGy EB 辐照绵羊趾浅屈肌腱，结果发现 EB 辐照会显著改变移植物重塑过程，随着时间推移移植物生物力学强度显著降低。因此，EB 灭菌法的有效性及安全性还需要进一步验证。
③ 巴氏消毒法、干热及湿热灭菌法：巴氏消毒法[23]、干热及湿热灭菌法是利用多数细菌不能耐受低温、高温、高压等特殊环境及温度来达到灭菌目的。巴氏消毒法不能杀灭所有微生物，一些耐热或者耐冷的细菌仍然可以存活。此外，经巴氏消毒法处理后的物品其保存期短，最长为 2 周，因此不适合用于同种异体移植物的灭菌处理。
湿热灭菌法常用于药物生产过程中，利用高温、高压蒸汽作为介质使细菌蛋白质变性坏死而达到灭菌目的。干热灭菌法要求温度更高，主要用于冻干产品的灭菌处理，但是温度过高容易导致胶原纤维脆性增加、弹性显著降低。因此，干热及湿热灭菌法也不适合用于同种异体移植物的灭菌处理。
1.2.2 化学方法
① 环氧乙烷（ethylene oxide，ETO）：ETO 是一种广谱高效的灭菌剂，常温下呈气态，可以与细菌、病毒等微生物的蛋白质、DNA 或 RNA 发生烷基化反应（非特异性），在常温下杀灭包括芽孢、病毒、真菌等在内的各种微生物，在医学及工业领域被广泛应用。但是，ETO 易燃、易爆、有毒，对人体有一定毒性，并且穿透能力有限，这些因素限制了 ETO 的应用[24]。另外，ETO 代谢产物可残留在物品或者材料上，例如氯乙醇乙烷以及乙二醇乙烷，这些残留物会引发关节内滑膜炎症，导致反复关节积液，损害移植物并造成手术失败风险增加[25]。Drez 等[26]的一项研究显示，与未处理的移植物相比，经 ETO 处理后的移植物最大应力下降 29%、刚度下降 43%。因此，AATB 不建议采用 ETO 对同种异体移植物进行灭菌处理。
② 药物浸泡法：药物浸泡法包括乙醇、过氧乙酸-乙醇、甲醇/氯仿等。乙醇浸泡法常用于医疗器械灭菌处理，较少用于同种异体移植物。同时乙醇浸泡灭菌能力有限，对病毒类微生物灭菌作用较弱。过氧乙酸-乙醇对于病毒等微生物具有较好的灭菌效果，但是其腐蚀性较强且具有强氧化性能，用于同种异体移植物等生物制品时风险极高。然而，Scheffler 等[27]发现过氧乙酸-乙醇处理同种异体跟腱、皮肤及软骨时未对这些组织产生不利影响。因此，关于过氧乙酸-乙醇的处理效果还需要更多研究进行验证。
1.2.3 联合方法
物理方法与化学方法的综合灭菌方法主要有 4 种。① BioCleanse®方法：BioCleanse®灭菌首先需要对移植物进行超声洗浴处理，彻底清除在固定阶段残留的清洗剂、H2O2、乙醇等，然后反复进行真空-压力循环促进基质渗透，破坏细菌细胞壁达到灭菌目的[28-29]。目前报道的采用 BioCleanse®方法对同种异体移植物进行灭菌处理效果差异较大，仍然存在争议。Schimizzi 等[30]的生物力学测试结果显示，BioCleanse®处理的同种异体移植物生物力学性能与 γ 射线辐照（20～26 kGy）处理的移植物以及新鲜冰冻肌腱相当。2017 年，Maletis 等[28]进行了一项包含 14 015 例患者的队列研究，发现经 BioCleanse®灭菌处理的同种异体移植物重建后，翻修率比自体骨-髌腱-骨移植物重建高 4.67 倍；采用 BioCleanse®处理的同种异体移植物重建 ACL 后 2.5 年内，每 17 例患者就有 1 例面临翻修风险。Tejwani 等[29]也报道采用 BioCleanse®处理的同种异体移植物重建 ACL 的失败风险为 0～31%，并且将 BioCleanse®处理的同种异体移植物作为术后失败独立危险因素。
② Allowash、Allowash XG 和 AlloTrue 方法：Allowash 和 Allowash XG 两种方法均包括了一系列冲洗、离心、低渗和超声强化过程，区别是 Allowash 整个过程中不需要再辐照处理，而 Allowash XG 在灭菌最后阶段需要低剂量（<2.0 Mrad）γ 射线辐照[28]。AlloTrue 有别于前两种方法，除非移植物是在无菌条件下获取的，否则大多数情况下需要低剂量（1～1.3 Mrad）γ 射线辐照。Tejwani 等[29]研究发现，相比于 BioCleanse®处理方法，使用 AlloWash 或 AlloTrue 未显著增加患者术后翻修风险。但是由于目前研究比较少，还需要更多的临床结果来验证，以得出更确切结论。
③ MTF 和 Tutoplast：MTF 是美国肌肉骨骼移植基金会早年采用的一项灭菌技术，灭菌过程包括抗生素浸泡、搅拌、控制和纯净水冲洗，整个过程不使用 H2O2，40%～65% 移植物在冷冻状态下接受预先辐照处理，辐照剂量通常选择低剂量（1.2～1.8 Mrad）[31]。而 Tutoplast 灭菌法需要使用 H2O2，其次还包括超声强化、丙酮、高渗溶液、NaOH 等，与 MTF 一样最终需低剂量 γ 射线（1.78～2.01 Mrad）辐照处理。根据文献报道采用 Tutoplast 处理的移植物重建 ACL 后，6 年内失败率达 45%[32]，因此目前已经很少使用。
④ 超临界 CO2 消毒（super critical CO2，SCCO2）：SCCO2 既往多应用于化学工业、分离工程和材料制备等领域[33]，近年来有学者将其用于同种异体移植物的灭菌处理[34]。移植物密封后置于充满 CO2 的舱内进行升压，直到 CO2 由气态变为液态，利用 SCCO2 对物体的超强渗透能力作用于微生物，改变微生物生长环境，影响新陈代谢，最终起到杀菌作用。有研究比较了 SCCO2 消毒方法、γ 射线辐照（2.0～2.8 Mrad）和未处理的同种异体肌腱，结果发现 SCCO2 灭菌没有显著降低同种异体肌腱强度，在循环测试的生物力学试验中显示了良好的力学性能[35]。SCCO2 灭菌法的原理及效果目前尚缺乏更多研究数据，同时由于移植物需要在 CO2 舱内进行升压，是否会影响移植物的胶原纤维特性还需要更多研究。
2 同种异体移植物保存
同种异体移植物保存方法主要有冷冻保存、玻璃化法保存和冻干保存 3 类，其中冷冻保存可进一步分为普通低温保存、深低温保存和超深低温保存。
2.1 冷冻保存
普通低温保存、深低温保存和超深低温保存的区别是保存温度不同[36]。普通低温保存通常保存于−20℃ 冰箱中；超深低温保存保存于−196℃ 液氮中；深低温保存通常采用缓慢梯度降温后，将肌腱存储于−80℃ 环境中[37]。
移植物冷冻保存过程中细胞内外容易形成大量冰晶，冰晶对移植物的损害作用主要有两点，一是引起细胞机械性破坏，二是因胞内水分结冰电解质浓缩导致细胞中毒死亡[38-39]。为了减少冰晶引起的细胞损害，移植物冻融过程采取“缓慢降温、快速复温”原则[40]。冷冻保存的同种异体移植物复温时细胞外冰晶先溶解，因此吸收了细胞周围大量热能，导致细胞内冰晶进一步形成，缓慢融冻加剧了这一恶性循环。然而，快速复温由于短期温度较高，除了满足细胞外冰晶融化的需要外，细胞内的冰晶融化也得以满足，因此对组织破坏小，相对起到保护作用。
2.2 玻璃化法保存
玻璃化法又称为无冰晶技术或少冰晶技术，采用高浓度溶液单相快速降温技术，使溶液直接进入玻璃化状态，减少冰晶形成，避免移植物内部因冰晶形成而造成挤压损伤和冻融效应，有效保存了组织及细胞的活性。有研究比较了冷冻保存和玻璃化法对肌腱细胞活性的影响，结果显示冷冻保存下肌腱细胞的存活率只有 49.63%、而玻璃化法为 78.49%[41]。冷冻保存时肌腱细胞皱缩变形，甚至变性坏死明显，胶原排列紊乱，细胞外基质不同程度损伤。而玻璃化法尽管对肌腱细胞也有损伤，但是损伤轻微，尤其对于胶原纤维及细胞外基质损伤较轻，有研究报道玻璃化法保存后 45%～80% 肌腱细胞能在低免疫原性状态下存活[42]。
2.3 冻干保存
冻干保存肌腱冻干前先经过低温冷冻 4 h，然后在低温真空负压下脱水升华消耗水分，使水分含量低于 5%，使用前生理盐水中充分水化至少 30 min。冻干保存最大优势是携带和保存方便，室温下可保存 5 年左右[43]。
学者们对于冻干移植物重建 ACL 的效果进行了大量研究，但是总体结果不理想，尤其是冻干处理结合环氧乙烷消毒或者 γ 射线辐照时术后失败率较高[44-45]。Sterling 等[46]随访了 36 例采用冻干处理骨-髌腱-骨重建 ACL 患者临床效果，移植物在植入前同时接受了环氧乙烷消毒，术后 2 年随访发现 8 例患者发生了移植物溶解失效。Gut 等[47]发现即使是相同剂量的 γ 射线辐照，冻干同种异体移植物的生物力学强度下降幅度是新鲜冷冻移植物的 2 倍；35 kGy γ 射线辐照下，冻干同种异体移植物的最大失败载荷相较新鲜自体移植物下降 40%。
3 总结
合理选择同种异体移植物是 ACL 重建手术成功的关键。同种异体移植物在取材、加工及保存过程中可能存在细菌污染以及来源供体存在病毒的风险，因此有必要进行灭菌处理。目前最常用的灭菌方法是 γ 射线辐照，但是最佳辐照剂量仍不清楚。EB 辐照也是可供选择灭菌方法之一，但辐照剂量过大对移植物改造塑形有明显影响。物理与化学方法结合的联合方法仍处于探索阶段。对于同种异体移植物的保存，深低温冷冻是目前最常用的一种方法。采用深低温冷冻移植物时，应坚持“缓慢降温，快速复温”的原则，以减少冰晶对移植物的影响。冻干保存结合辐照处理对移植物生物学性能有明显影响，因此不宜用于同种异体移植物的处理。临床医生选择重建 ACL 的同种异体移植物时，应该综合考虑上述因素。
作者贡献：尚小可查阅文献、搜集和整理文献，并撰写文章；王辉辉查阅并整理文献；李箭审校文章；李棋整理文献并审校文章。
利益冲突：所有作者声明，在文章撰写过程中不存在任何利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点。