引用本文： 张洋, 郭海, 马莉, 朱锦宇, 郭安运, 何勇. 长链非编码 RNA MALAT1 吸附微小 RNA-124 调控 MSCs 成骨分化的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(2): 240-245. doi: 10.7507/1002-1892.201906025 复制
骨质疏松症是多发于中老年人的一种骨退行性疾病，随着我国人口老龄化进程，其发病率日趋升高，已成为治疗研究的热点[1]。BMSCs 是一种具有自我增殖和多向分化潜能的成体干细胞，可分化为神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等[2]。体内成骨细胞主要来自 BMSCs 的成骨分化，促进 BMSCs 向成骨分化可作为治疗骨退行性疾病的有效方法[3]。
研究发现长链非编码 RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）可以直接参与 BMSCs 成骨分化，也可通过调节微小 RNA（microRNA，miRNA）表达来调节 BMSCs 成骨分化进程[4]。肺腺癌转移相关转录因子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是首次在肺腺癌中发现的一种 lncRNA，可介导多种骨肿瘤的发生与发展，通过下调磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）通路抑制成骨细胞的增殖[5]，还可介导核因子 κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子 κB 受体活化因子配体（RANK ligand，RANKL）/骨保护素通路，促使破骨细胞活化[6]。
研究发现 PI3K/Akt 通路在 BMSCs 迁移及分化过程中起重要作用，下调通路活性可抑制 BMSCs 成骨分化[7]，因而推测 lncRNA MALAT1 可能通过调控 PI3K/Akt 信号介导 MSCs 成骨分化。研究发现，lncRNA MALAT1 可下调 miR-124 表达，促进乳腺癌发生发展[8]；而上调 miR-124 可介导 BMSCs 分化，还可抑制 PI3K/Akt 信号通路表达[9-10]。因而推测 lncRNA MALAT1 可能通过调节 miR-124 表达来调控 MSCs 成骨分化。本研究通过过表达或敲减体外培养的小鼠胚胎来源 MSCs C3H10T1/2 细胞株中的 lncRNA MALAT1 基因，对 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
C3H10T1/2 细胞株（上海冠导生物工程有限公司）；293T 细胞株（南京科佰生物科技有限公司）；miR-124、lncRNA MALAT1、Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、小细胞核 RNA（small nuclear RNA，U6）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MALAT1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）、MALAT1 siRNA 阴性对照、lncRNA MALAT1 过表达质粒、lncRNA MALAT1 空载质粒、lncRNA MALAT1 模拟物和阴性对照（NC）模拟物、双荧光素报告 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）基因载体由上海吉玛基因有限公司构建合成；H-DMEM 培养基（上海微科生物技术有限公司）；FBS、PBS 缓冲液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；Opti-MEM 培养基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国）；ALP 染色试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）；茜素红染色液（上海联硕生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（Takara 公司，日本）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（上海群己生物科技有限公司）；96 孔板、25 cm2培养瓶、60 mm 培养皿等（上海碧云天生物技术有限公司）。
CKX41-F32F 光学显微镜（Olympus 公司，日本）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）；3900 型高通量 DNA 合成仪（美国应用生物系统公司）；Centrifuge 5424R 低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；XB-70 制冰机（GRANT 公司，美国）；恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）；双人单面超净工作台、CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）。
1.2 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用
1.2.1 细胞培养
取 C3H10T1/2 细胞株，放入 39℃ 水浴中快速融化，室温下以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 5 min；向细胞沉淀中加入完全培养基（500 mL H-DMEM 培养基中含 10%FBS、100 U/mL 青链霉素）重悬，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养，当细胞融合率达 85% 左右时采用胰蛋白酶-EDTA 消化，然后以 1∶3 比例进行传代培养。
1.2.2 实验分组及方法
当细胞融合率达 85% 左右时采用胰蛋白酶-EDTA 消化，室温下以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 5 min；向细胞沉淀中加入完全培养基重悬，混匀后计数，以 5×105个/mL 密度接种于 3 个 24 孔板中。每板分别分组为对照组（A 组）、lncRNA MALAT1 空载质粒组（B 组）、lncRNA MALAT1 过表达质粒组（C 组）、lncRNA MALAT1 siRNA 组（D 组）和 lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组（E 组）并做好标记，每组 4 孔。24 h 后更换为 Opti-MEM 减血清培养基培养。
参照 LipofectamineTM2000 说明书步骤转染质粒及 siRNA。将 1 μL LipofectamineTM2000、质粒（ lncRNA MALAT1 空载质粒和 lncRNA MALAT1 过表达质粒）、siRNA（ MALAT1 siRNA 和 MALAT1 siRNA 阴性对照）分别溶于 50 μL Opti-MEM 减血清培养基中并轻轻混匀，静置 20 min 后，将加有 1 μL LipofectamineTM 2000 的 50 μL Opti-MEM 减血清培养基分别与加有质粒或 siRNA 的 50 μL Opti-MEM 减血清培养基混匀，分别加入 B、C、D、E 组培养孔中处理细胞，A 组细胞加入 1 μL LipofectamineTM2000。6 h 后将培养基更换为成骨诱导分化培养基[11]（500 mL 完全培养基中加入 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 维生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠），诱导 1 周后收集细胞进行以下观测。
1.2.3 ALP 染色观察
取 1 个培养板，弃培养基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，各组细胞行 ALP 染色，光镜下观察。于 200 倍镜下随机取 5 个视野计数 ALP 阳性细胞，按以下公式计算 ALP 阳性细胞相对含量：实验组 ALP 阳性细胞数/对照组 ALP 阳性细胞数×100%。
1.2.4 茜素红染色观察
取 1 个培养板，弃培养基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，加入茜素红染色液室温孵育 30 min；弃染色液，PBS 漂洗 2 次，光镜下观察矿化结节染色情况。200 倍镜下随机取 5 个视野计数矿化结节，按以下公式计算细胞矿化结节相对含量：实验组矿化结节个数/对照组矿化结节个数×100%。
1.2.5 qRT-PCR 检测 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相关基因表达
取 1 个培养板，加入 RNAiso Plus，参照说明书步骤提取总 RNA，以逆转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒将其逆转录成 cDNA 后进行定量 PCR 反应。lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 以 GAPDH 为内参基因，miR-124 以 U6 为内参基因；反应条件的设定、反应体系的配制按照说明书进行，qRT-PCR 引物序列见表 1。采用 2−ΔΔCt 法分析各目的基因相对表达量。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.3 双荧光素酶报告基因检测实验
以 mirTargets 1.2 靶基因预测软件预测 lncRNA MALAT1 与 miR-124 的结合位点，并构建 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）荧光素酶报告载体。体外培养 293T 细胞，胰蛋白酶-EDTA 消化后以 5×105 个/mL 密度接种于 24 孔板中；将 lncRNA MALAT1 模拟物和阴性对照（NC）模拟物分别和 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）荧光素酶报告载体共转染至 293T 细胞中，以萤火虫荧光素酶报告基因为内参，24 h 后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞中双荧光素酶的相对活性，具体步骤参照说明书。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用
2.1.1 ALP 染色观察
A、B、C、D、E 组 ALP 阳性细胞相对含量分别为 100.00%±0.00%、98.90%±14.30%、152.90%±17.80%、28.30%±6.30%、97.90%±14.60%，C 组显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
各组细胞 ALP 染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. ALP staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.2 茜素红染色观察
A、B、C、D、E 组细胞矿化结节相对含量分别为 100.00%±0.00%、99.23%±14.01%、169.31%±19.20%、45.20%±8.10%、101.58%±15.20%，C 组显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
各组细胞茜素红染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. Alizarin red staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.3 qRT-PCR 检测 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相关基因表达
C 组细胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN mRNA 相对表达量显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C 组细胞 miR-124 相对表达量显著低于其余各组，D 组显著高于其余各组，差异亦有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间各基因相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
qRT-PCR 检测各组细胞 miR-124、lncRNA MALAT1 及 成骨分化相关基因的表达
Figure3.
The relative mRNA expressions of miR-124, lncRNA MALAT1, and osteogenic differentiation related genes detected by qRT-PCR
2.2 双荧光素酶报告基因检测
靶基因预测软件预测显示，MALAT1 和 miR-124 之间有相似的结合位点，提示 MALAT1 可靶向调控 miR-124 表达。双荧光素酶报告基因检测示，与共转染 NC 模拟物的 293T 细胞相比，共转染 lncRNA MALAT1 模拟物的 293T 细胞，miR-124 WT 报告基因的荧光素酶相对活性显著降低（0.99±0.01 & 0.47±0.01，t=82.219，P=0.000），miR-124 MUT 报告基因的荧光素酶相对活性无明显变化（1.00±0.01 & 0.99±0.01，t=1.581，P=0.153）。见图 4、5。
图4
靶基因预测软件预测结果
Figure4.
Prediction results of target gene prediction software
图5
双荧光素酶报告基因检测报告基因的荧光素酶相对活性
Figure5.
Relative activity of luciferase detected by double luci ferase reporter gene
3 讨论
骨质疏松症是骨骼内骨代谢动态平衡失衡，导致单位结构内骨量下降、骨微结构被破坏的一种慢性疾病，患者骨生物力学减弱，易引起骨折，给患者造成极大痛苦[12]。骨代谢动态平衡是由成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收之间的动态平衡，当破骨细胞活性大于成骨细胞活性时，就会导致骨质疏松症等骨退行性疾病[13]。BMSCs 作为具有多向分化潜能的干细胞，促进其向成骨细胞分化可促进骨形成，修正骨代谢失衡，对治疗骨退行性疾病有重要作用[14]。MALAT1 是一种 lncRNA，没有蛋白编码功能，但可介导转录调控及蛋白翻译后修饰等过程，表达缺乏将会导致蛋白质编码能力缺失[15]，可调控多种基因影响骨代谢，比如上调 Osterix 蛋白表达促进成骨细胞增殖及分化，亦下调 RANKL 抑制破骨细胞活化[16-17]，由此可推测 MALAT1 可能促进 BMSCs 成骨分化。本研究采用 MALAT1 过表达质粒及 MALAT1 siRNA 调节 BMSCs 细胞株 C3H10T1/2 中 lncRNA MALAT1 的表达，结果显示，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 lncRNA MALAT 基因表达高于对照组，lncRNA MALAT1 siRNA 组低于对照组，表明以 MALAT1 过表达质粒及 MALAT1 siRNA 处理 BMSCs 可调控 lncRNA MALAT 表达，为后续研究奠定了良好基础。实验结果显示，与对照组比较，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 基因表达及 ALP 阳性细胞相对含量、矿化结节相对含量均明显升高，lncRNA MALAT1 siRNA 组均明显降低，lncRNA MALAT1 空载质粒组、lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组各指标无明显变化。表明上调 lncRNA MALAT1，可上调成骨相关基因表达，促进 BMSCs 向成骨细胞分化；下调 lncRNA MALAT1，可下调成骨相关基因表达，抑制 BMSCs 向成骨细胞分化。提示 lncRNA MALAT1 可调控 BMSCs 成骨分化。
研究表明，MALAT1 可结合并下调 miR-124 的表达，促进舌癌的发展[18]；miR-124 表达降低可激活 PI3K/Akt 通路，而激活 PI3K/Akt 通路可促进 BMSCs 成骨分化[19-20]。因此，调节 miR-124 表达可能是 lncRNA MALAT1 调控 MSCs 成骨分化的作用机制。本研究结果显示，与对照组比较，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 miR-124 基因表达明显降低，lncRNA MALAT1 siRNA 组细胞 miR-124 基因表达明显升高，lncRNA MALAT1 空载质粒组、lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组无明显变化。双荧光素酶报告基因检测结果显示 lncRNA MALAT1 靶向下调 miR-124 表达，表明 lncRNA MALAT1 靶向结合并下调 miR-124 表达，可能是 lncRNA MALAT1 调控 MSCs 成骨分化的作用机制。
综上述，lncRNA MALAT1 可能通过靶向结合并下调 miR-124 表达来调控 BMSCs 成骨分化。上调 lncRNA MALAT1 可促进 BMSCs 成骨分化，下调 lncRNA MALAT1 则对 BMSCs 成骨分化有抑制作用，提示 lncRNA MALAT1 是治疗骨质疏松症的一个新靶点，这为临床治疗提供了新思路。但 lncRNA MALAT1 靶向下调 miR-124 表达后，具体通过下游什么信号通路介导 BMSCs 成骨分化尚不清楚，还需进一步深入研究。
作者贡献：张洋、郭海负责实验设计及实施；马莉、郭安运负责数据收集整理；何勇负责统计分析；张洋负责文章撰写；朱锦宇负责对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
骨质疏松症是多发于中老年人的一种骨退行性疾病，随着我国人口老龄化进程，其发病率日趋升高，已成为治疗研究的热点[1]。BMSCs 是一种具有自我增殖和多向分化潜能的成体干细胞，可分化为神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等[2]。体内成骨细胞主要来自 BMSCs 的成骨分化，促进 BMSCs 向成骨分化可作为治疗骨退行性疾病的有效方法[3]。
研究发现长链非编码 RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）可以直接参与 BMSCs 成骨分化，也可通过调节微小 RNA（microRNA，miRNA）表达来调节 BMSCs 成骨分化进程[4]。肺腺癌转移相关转录因子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是首次在肺腺癌中发现的一种 lncRNA，可介导多种骨肿瘤的发生与发展，通过下调磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）通路抑制成骨细胞的增殖[5]，还可介导核因子 κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子 κB 受体活化因子配体（RANK ligand，RANKL）/骨保护素通路，促使破骨细胞活化[6]。
研究发现 PI3K/Akt 通路在 BMSCs 迁移及分化过程中起重要作用，下调通路活性可抑制 BMSCs 成骨分化[7]，因而推测 lncRNA MALAT1 可能通过调控 PI3K/Akt 信号介导 MSCs 成骨分化。研究发现，lncRNA MALAT1 可下调 miR-124 表达，促进乳腺癌发生发展[8]；而上调 miR-124 可介导 BMSCs 分化，还可抑制 PI3K/Akt 信号通路表达[9-10]。因而推测 lncRNA MALAT1 可能通过调节 miR-124 表达来调控 MSCs 成骨分化。本研究通过过表达或敲减体外培养的小鼠胚胎来源 MSCs C3H10T1/2 细胞株中的 lncRNA MALAT1 基因，对 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
C3H10T1/2 细胞株（上海冠导生物工程有限公司）；293T 细胞株（南京科佰生物科技有限公司）；miR-124、lncRNA MALAT1、Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、小细胞核 RNA（small nuclear RNA，U6）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MALAT1 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）、MALAT1 siRNA 阴性对照、lncRNA MALAT1 过表达质粒、lncRNA MALAT1 空载质粒、lncRNA MALAT1 模拟物和阴性对照（NC）模拟物、双荧光素报告 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）基因载体由上海吉玛基因有限公司构建合成；H-DMEM 培养基（上海微科生物技术有限公司）；FBS、PBS 缓冲液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；Opti-MEM 培养基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国）；ALP 染色试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）；茜素红染色液（上海联硕生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（Takara 公司，日本）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（上海群己生物科技有限公司）；96 孔板、25 cm2培养瓶、60 mm 培养皿等（上海碧云天生物技术有限公司）。
CKX41-F32F 光学显微镜（Olympus 公司，日本）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）；3900 型高通量 DNA 合成仪（美国应用生物系统公司）；Centrifuge 5424R 低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；XB-70 制冰机（GRANT 公司，美国）；恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）；双人单面超净工作台、CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）。
1.2 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用
1.2.1 细胞培养
取 C3H10T1/2 细胞株，放入 39℃ 水浴中快速融化，室温下以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 5 min；向细胞沉淀中加入完全培养基（500 mL H-DMEM 培养基中含 10%FBS、100 U/mL 青链霉素）重悬，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养，当细胞融合率达 85% 左右时采用胰蛋白酶-EDTA 消化，然后以 1∶3 比例进行传代培养。
1.2.2 实验分组及方法
当细胞融合率达 85% 左右时采用胰蛋白酶-EDTA 消化，室温下以离心半径 10 cm、3 000 r/min 离心 5 min；向细胞沉淀中加入完全培养基重悬，混匀后计数，以 5×105个/mL 密度接种于 3 个 24 孔板中。每板分别分组为对照组（A 组）、lncRNA MALAT1 空载质粒组（B 组）、lncRNA MALAT1 过表达质粒组（C 组）、lncRNA MALAT1 siRNA 组（D 组）和 lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组（E 组）并做好标记，每组 4 孔。24 h 后更换为 Opti-MEM 减血清培养基培养。
参照 LipofectamineTM2000 说明书步骤转染质粒及 siRNA。将 1 μL LipofectamineTM2000、质粒（ lncRNA MALAT1 空载质粒和 lncRNA MALAT1 过表达质粒）、siRNA（ MALAT1 siRNA 和 MALAT1 siRNA 阴性对照）分别溶于 50 μL Opti-MEM 减血清培养基中并轻轻混匀，静置 20 min 后，将加有 1 μL LipofectamineTM 2000 的 50 μL Opti-MEM 减血清培养基分别与加有质粒或 siRNA 的 50 μL Opti-MEM 减血清培养基混匀，分别加入 B、C、D、E 组培养孔中处理细胞，A 组细胞加入 1 μL LipofectamineTM2000。6 h 后将培养基更换为成骨诱导分化培养基[11]（500 mL 完全培养基中加入 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 维生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠），诱导 1 周后收集细胞进行以下观测。
1.2.3 ALP 染色观察
取 1 个培养板，弃培养基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，各组细胞行 ALP 染色，光镜下观察。于 200 倍镜下随机取 5 个视野计数 ALP 阳性细胞，按以下公式计算 ALP 阳性细胞相对含量：实验组 ALP 阳性细胞数/对照组 ALP 阳性细胞数×100%。
1.2.4 茜素红染色观察
取 1 个培养板，弃培养基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，加入茜素红染色液室温孵育 30 min；弃染色液，PBS 漂洗 2 次，光镜下观察矿化结节染色情况。200 倍镜下随机取 5 个视野计数矿化结节，按以下公式计算细胞矿化结节相对含量：实验组矿化结节个数/对照组矿化结节个数×100%。
1.2.5 qRT-PCR 检测 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相关基因表达
取 1 个培养板，加入 RNAiso Plus，参照说明书步骤提取总 RNA，以逆转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒将其逆转录成 cDNA 后进行定量 PCR 反应。lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 以 GAPDH 为内参基因，miR-124 以 U6 为内参基因；反应条件的设定、反应体系的配制按照说明书进行，qRT-PCR 引物序列见表 1。采用 2−ΔΔCt 法分析各目的基因相对表达量。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.3 双荧光素酶报告基因检测实验
以 mirTargets 1.2 靶基因预测软件预测 lncRNA MALAT1 与 miR-124 的结合位点，并构建 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）荧光素酶报告载体。体外培养 293T 细胞，胰蛋白酶-EDTA 消化后以 5×105 个/mL 密度接种于 24 孔板中；将 lncRNA MALAT1 模拟物和阴性对照（NC）模拟物分别和 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突变型（MUT）荧光素酶报告载体共转染至 293T 细胞中，以萤火虫荧光素酶报告基因为内参，24 h 后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞中双荧光素酶的相对活性，具体步骤参照说明书。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 对 MSCs 成骨分化的调控作用
2.1.1 ALP 染色观察
A、B、C、D、E 组 ALP 阳性细胞相对含量分别为 100.00%±0.00%、98.90%±14.30%、152.90%±17.80%、28.30%±6.30%、97.90%±14.60%，C 组显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
各组细胞 ALP 染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. ALP staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.2 茜素红染色观察
A、B、C、D、E 组细胞矿化结节相对含量分别为 100.00%±0.00%、99.23%±14.01%、169.31%±19.20%、45.20%±8.10%、101.58%±15.20%，C 组显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
各组细胞茜素红染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. Alizarin red staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.3 qRT-PCR 检测 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相关基因表达
C 组细胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN mRNA 相对表达量显著高于其余各组，D 组显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C 组细胞 miR-124 相对表达量显著低于其余各组，D 组显著高于其余各组，差异亦有统计学意义（P<0.05）；A、B、E 组间各基因相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
qRT-PCR 检测各组细胞 miR-124、lncRNA MALAT1 及 成骨分化相关基因的表达
Figure3.
The relative mRNA expressions of miR-124, lncRNA MALAT1, and osteogenic differentiation related genes detected by qRT-PCR
2.2 双荧光素酶报告基因检测
靶基因预测软件预测显示，MALAT1 和 miR-124 之间有相似的结合位点，提示 MALAT1 可靶向调控 miR-124 表达。双荧光素酶报告基因检测示，与共转染 NC 模拟物的 293T 细胞相比，共转染 lncRNA MALAT1 模拟物的 293T 细胞，miR-124 WT 报告基因的荧光素酶相对活性显著降低（0.99±0.01 & 0.47±0.01，t=82.219，P=0.000），miR-124 MUT 报告基因的荧光素酶相对活性无明显变化（1.00±0.01 & 0.99±0.01，t=1.581，P=0.153）。见图 4、5。
图4
靶基因预测软件预测结果
Figure4.
Prediction results of target gene prediction software
图5
双荧光素酶报告基因检测报告基因的荧光素酶相对活性
Figure5.
Relative activity of luciferase detected by double luci ferase reporter gene
3 讨论
骨质疏松症是骨骼内骨代谢动态平衡失衡，导致单位结构内骨量下降、骨微结构被破坏的一种慢性疾病，患者骨生物力学减弱，易引起骨折，给患者造成极大痛苦[12]。骨代谢动态平衡是由成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收之间的动态平衡，当破骨细胞活性大于成骨细胞活性时，就会导致骨质疏松症等骨退行性疾病[13]。BMSCs 作为具有多向分化潜能的干细胞，促进其向成骨细胞分化可促进骨形成，修正骨代谢失衡，对治疗骨退行性疾病有重要作用[14]。MALAT1 是一种 lncRNA，没有蛋白编码功能，但可介导转录调控及蛋白翻译后修饰等过程，表达缺乏将会导致蛋白质编码能力缺失[15]，可调控多种基因影响骨代谢，比如上调 Osterix 蛋白表达促进成骨细胞增殖及分化，亦下调 RANKL 抑制破骨细胞活化[16-17]，由此可推测 MALAT1 可能促进 BMSCs 成骨分化。本研究采用 MALAT1 过表达质粒及 MALAT1 siRNA 调节 BMSCs 细胞株 C3H10T1/2 中 lncRNA MALAT1 的表达，结果显示，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 lncRNA MALAT 基因表达高于对照组，lncRNA MALAT1 siRNA 组低于对照组，表明以 MALAT1 过表达质粒及 MALAT1 siRNA 处理 BMSCs 可调控 lncRNA MALAT 表达，为后续研究奠定了良好基础。实验结果显示，与对照组比较，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 基因表达及 ALP 阳性细胞相对含量、矿化结节相对含量均明显升高，lncRNA MALAT1 siRNA 组均明显降低，lncRNA MALAT1 空载质粒组、lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组各指标无明显变化。表明上调 lncRNA MALAT1，可上调成骨相关基因表达，促进 BMSCs 向成骨细胞分化；下调 lncRNA MALAT1，可下调成骨相关基因表达，抑制 BMSCs 向成骨细胞分化。提示 lncRNA MALAT1 可调控 BMSCs 成骨分化。
研究表明，MALAT1 可结合并下调 miR-124 的表达，促进舌癌的发展[18]；miR-124 表达降低可激活 PI3K/Akt 通路，而激活 PI3K/Akt 通路可促进 BMSCs 成骨分化[19-20]。因此，调节 miR-124 表达可能是 lncRNA MALAT1 调控 MSCs 成骨分化的作用机制。本研究结果显示，与对照组比较，lncRNA MALAT1 过表达质粒组细胞 miR-124 基因表达明显降低，lncRNA MALAT1 siRNA 组细胞 miR-124 基因表达明显升高，lncRNA MALAT1 空载质粒组、lncRNA MALAT1 siRNA 阴性对照组无明显变化。双荧光素酶报告基因检测结果显示 lncRNA MALAT1 靶向下调 miR-124 表达，表明 lncRNA MALAT1 靶向结合并下调 miR-124 表达，可能是 lncRNA MALAT1 调控 MSCs 成骨分化的作用机制。
综上述，lncRNA MALAT1 可能通过靶向结合并下调 miR-124 表达来调控 BMSCs 成骨分化。上调 lncRNA MALAT1 可促进 BMSCs 成骨分化，下调 lncRNA MALAT1 则对 BMSCs 成骨分化有抑制作用，提示 lncRNA MALAT1 是治疗骨质疏松症的一个新靶点，这为临床治疗提供了新思路。但 lncRNA MALAT1 靶向下调 miR-124 表达后，具体通过下游什么信号通路介导 BMSCs 成骨分化尚不清楚，还需进一步深入研究。
作者贡献：张洋、郭海负责实验设计及实施；马莉、郭安运负责数据收集整理；何勇负责统计分析；张洋负责文章撰写；朱锦宇负责对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
