引用本文： 严玉勇, 潘新元, 林博杰, 林冠宇, 殷国前. 天然水蛭素对大鼠缺血皮瓣血管生成作用的 Micro-CT 观察. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(3): 382-386. doi: 10.7507/1002-1892.201907030 复制
创面修复是外科医生经常面临的挑战[1]，修复方法包括直接拉拢缝合、游离植皮、局部任意皮瓣、游离皮瓣移植、皮肤扩张器修复等[2]。局部任意皮瓣由于取材方便、颜色与创面周围更匹配、并发症较少，因而在创面修复中占据重要地位[3-4]。由于任意皮瓣不含知名动、静脉，仅有真皮层及真皮下层血管网，术后早期皮瓣血供主要来自蒂部，因缺血再灌注损伤、血管栓塞等原因，血流沿皮瓣向远端逐渐减少，所以皮瓣易发生缺血坏死，尤其是远端部分[5-8]，因而早期微循环的建立尤为重要。既往研究已证实，天然水蛭素是高效的凝血酶拮抗剂，通过对血管生成或抑制因子的调控，抑制炎症反应同时促进皮瓣组织毛细血管再生[9-12]，从而提高皮瓣成活面积。但这些实验均是从微观角度间接证明水蛭素对皮瓣微循环建立的促进作用，未能直观揭示皮瓣血管再生的整体情况。Micro-CT 又称显微 CT、微焦点 CT[13]，是利用微聚焦 X 射线源和光学显微镜技术，分辨率高达微米级[14]，结合血管灌注技术及三维成像技术可以清晰显示标本血管的三维影像，还可通过机器自带的分析软件将血管再生情况进行量化。因此，本研究利用 Micro-CT 及三维重建技术分析皮瓣术后血管再生情况，旨在直观揭示天然水蛭素在促进皮瓣术后微循环建立中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 32 只，雌雄不限，体质量（300±10）g，由广西医科大学实验动物中心提供。
天然水蛭素冻干粉（专利号：ZL03113566.8，编号：KK-001；南宁净雪皇生物工程有限公司）；肝素钠注射液（2 mL∶12 500 U；上海上药第一生化药业有限公司）；4% 组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司）；明胶（Sigma 公司，美国）；红色氧化铅（天津大茂化学试剂厂）。BRUKER SkyScan 1176 小动物活体 Micro-CT 成像系统（Bruker 公司，德国）；Image Pro-Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）。
1.2 大鼠缺血皮瓣模型制备及分组
取 32 只 SD 大鼠，经腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部设计一8.0 cm×1.8 cm 大小的超长随意皮瓣模拟缺血皮瓣[15]。无菌条件下，按设计线切开皮肤至深筋膜层，分离并掀起皮瓣，如有轴型血管将其切断并结扎，保证皮瓣不携带轴型血管，彻底止血后皮瓣原位缝合，所有手术操作均由同一人完成。将造模后大鼠按先后顺序编号，采用随机数字表法随机分为水蛭素组和对照组，每组 16 只。水蛭素组术后即刻及之后 3 d 内每天同一时间，于皮瓣中央距蒂部 2、4、6 cm 处皮下注射天然水蛭素，每处各 1 个点，每个点注射 0.1 mL，3 个点共注射天然水蛭素 6 ATU；对照组同法注射等量生理盐水。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
造模术后 6 d，观察两组大鼠皮瓣颜色，有无水肿、渗出、破溃以及皮瓣成活情况。每组随机取 8 只大鼠同上法麻醉后，数码相机摄背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 软件计算皮瓣成活率，公式为：皮瓣成活面积/皮瓣总面积×100%。
1.3.2 组织学观察
造模术后 6 d，两组取上述拍摄背部皮瓣照片后的大鼠，切取皮瓣中间处组织，置于 10% 甲醛固定 24 h，脱水、包埋、切片，片厚 3 μm，取部分切片行 HE 染色，光镜下观察皮瓣组织中微血管结构、炎性细胞数量及坏死情况。
1.3.3 Micro-CT 检测
造模术后 6 d，两组分别取剩余 8 只大鼠行心脏-主动脉穿刺术，之后依次用 10 U/mL 肝素钠注射液[16]200 mL、4% 多聚甲醛溶液 100 mL 及 5% 明胶氧化铅混合液 20 mL 灌注全身血管，灌注速度为 1 mL/s；以上液体均水浴加热并保持在 40℃，灌注完成后冲洗皮瓣周围造影剂，4℃ 冷藏 24 h。24 h 后切取皮瓣及其周围 1 cm 组织行 Micro-CT 三维重建，然后仅保留皮瓣组织再次行 Micro-CT 三维重建。Micro-CT 主要参数设置如下：电压 50 kV，电流 500 μA，曝光时间 880 ms，过滤片为 0.5 mm，图像像素为 8.75 μm。将原始数据重建后导入机器自带分析软件 CTAn 中，计算血管容积、长度及数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后两组大鼠均存活至实验完成，无感染发生。术后 6 d，两组皮瓣远端均出现坏死，呈灰黑色，组织质地变硬，部分皱缩，皮瓣出现明显坏死分界，对照组皮瓣坏死面积更大。见图 1。水蛭素组皮瓣成活率为 72.11%±8.97%，显著高于对照组的 58.94%±4.02%，组间比较差异有统计学意义（t=3.280，P=0.008）。
图1
术后 6 d 两组皮瓣大体观察
a. 水蛭素组；b. 对照组
Figure1. General observation of skin flap in each group at 6 days after operationa. Hirudin group; b. Control group
2.2 组织学观察
术后 6 d HE 染色示，水蛭素组和对照组均可见炎症细胞浸润，对照组部分细胞出现核皱缩和碎裂；水蛭素组炎症细胞浸润较轻，组织层次结构更清楚，且有较多微血管形成。见图 2。
图2
术后 6 d 两组 HE 染色观察
从左至右分别为×50、×100 a. 水蛭素组；b. 对照组
Figure2. HE staining observation of each group at 6 days after operationFrom left to right for ×50 and ×100, respectively a. Hirudin group; b. Control group
2.3 Micro-CT 检测
术后 6 d，皮瓣及其周围 1 cm 组织 Micro-CT 三维重建显示，两组皮瓣血管和周围组织血管均有部分连接，越靠近皮瓣蒂部连接越紧密，其中水蛭素组较对照组连接密度更大，切缘处形成了与四周组织血管方向大体一致的新生血管。仅保留皮瓣组织 Micro-CT 三维重建显示，水蛭素组皮瓣远端有较多新生血管形成，血管的分布密度及连续性均优于对照组。见图 3。水蛭素组血管容积、血管长度及血管数量均显著大于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
两组 Micro-CT 检测指标比较（n=8，
）
Table1.
Comparison of Micro-CT indexes between two groups (n=8, 
)
图3
两组 Micro-CT 三维重建
从左至右分别为对照组和水蛭素组 a. 皮瓣及周围组织；b. 皮瓣组织
Figure3. Micro-CT 3D reconstruction of the two groupsFrom left to right for control group and hirudin group, respectively a. Skin flap and the tissue around the skin flap; b. Skin flap
3 讨论
任意皮瓣具有取材丰富、操作简便等诸多优点，在整形外科应用广泛。当皮瓣长宽比超过 2∶1 时，皮瓣远端容易发生缺血坏死[17-18]。本研究采用了长宽比超过 4∶1 的超长任意皮瓣构建缺血皮瓣模型，通过水蛭素药物干预，以期进一步了解天然水蛭素对皮瓣成活的影响；同时明胶氧化铅灌注结合 Micro-CT 和三维重建技术，可在不破坏标本情况下直观显示皮瓣内部整体血管网结构，并进行相关血管参数计算[19]，为后期临床应用提供实验依据及参考。
皮瓣移植后，切口及周边组织会合成并释放大量凝血酶，并通过凝血酶受体诱导一系列病理生理反应，最终抑制血管生成[20]。天然水蛭素作为凝血酶的特异性拮抗剂，通过拮抗凝血酶的相关信号通路，对血管生成因子（如 VEGF）与抗血管生成因子（如血小板反应蛋白 1、内皮抑素）进行调节，进而促进皮瓣血管再生[21]。本研究中，水蛭素组术后皮瓣成活率及血管长度、容积和数量均显著大于对照组，与既往研究结果一致[9-10, 12]，说明天然水蛭素在改善皮瓣成活及促进血管再生方面效果显著。
皮瓣远端坏死常见原因有循环血供来源改变、血供不足导致的灌注压显著下降、炎症反应和氧化应激导致的微循环内血流淤滞、微血栓形成等[22-25]；而皮瓣成活有赖于血供及时恢复和重建以及皮瓣远端组织有效血液灌注[26]。有研究证实，任意皮瓣术后成活除通过蒂部供血外，还必须通过暴露的真皮下血管网及四周创缘吸取营养[27-28]。我们发现术后 6 d 皮瓣除最远端均有血管与周围组织血管连通外，还表现为皮瓣血管与周围组织血管走行一致，并跨过切缘，说明此处已有新生血管形成，或是原有闭塞的管腔被打通；同时水蛭素组和对照组均有连续性血管跨过切缘，这些血管走行方向与皮瓣周围血管方向大体一致。由于各种调节因子都需依赖功能性的血管网络运输到相关目的地才能最终发挥作用[29]，所以我们分析这种大体一致的方向性，可能与切缘两侧各种调节因子随血液循环能到达的最远处距离及血流方向有关。
皮瓣及其周围 1 cm 组织 Micro-CT 检测三维重建显示，水蛭素组形成的连通血管较对照组更多，说明天然水蛭素在皮瓣与周围组织的血管再通或血管再生中起关键作用。同时，水蛭素组不仅皮瓣组织血管较对照组多，皮瓣周围组织的血管也较对照组更密集，提示天然水蛭素不仅能促进局部血管再生，也能在一定程度上促进损伤部位周围（切缘两侧）组织血管再生。这可能是由于其抗凝水平的发挥依赖于血液循环及损伤部位[29]，但这一结论还需要进一步实验验证。由于天然水蛭素局部皮下注射生物利用度高[30]，本研究结论对后期缺血组织的临床处理具有一定指导意义。但本研究对灌注和取材的操作要求较高，若操作不熟练，会影响实验结果的可靠性。
综上述，局部皮下注射天然水蛭素能够减轻组织炎症，通过增加新生血管形成或促进闭塞血管再通，改善缺血区血供，从而提高皮瓣成活率。
作者贡献：严玉勇直接参与实验设计、实施及文章起草；潘新元参与实验设计与统计分析；林博杰参与实验设计；林冠宇参与数据收集整理；殷国前对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：动物实验均经广西医科大学（广西实验动物中心）实验动物伦理委员会批准（201803051），实验动物使用许可证批准号：SYXK桂2014-0003。
创面修复是外科医生经常面临的挑战[1]，修复方法包括直接拉拢缝合、游离植皮、局部任意皮瓣、游离皮瓣移植、皮肤扩张器修复等[2]。局部任意皮瓣由于取材方便、颜色与创面周围更匹配、并发症较少，因而在创面修复中占据重要地位[3-4]。由于任意皮瓣不含知名动、静脉，仅有真皮层及真皮下层血管网，术后早期皮瓣血供主要来自蒂部，因缺血再灌注损伤、血管栓塞等原因，血流沿皮瓣向远端逐渐减少，所以皮瓣易发生缺血坏死，尤其是远端部分[5-8]，因而早期微循环的建立尤为重要。既往研究已证实，天然水蛭素是高效的凝血酶拮抗剂，通过对血管生成或抑制因子的调控，抑制炎症反应同时促进皮瓣组织毛细血管再生[9-12]，从而提高皮瓣成活面积。但这些实验均是从微观角度间接证明水蛭素对皮瓣微循环建立的促进作用，未能直观揭示皮瓣血管再生的整体情况。Micro-CT 又称显微 CT、微焦点 CT[13]，是利用微聚焦 X 射线源和光学显微镜技术，分辨率高达微米级[14]，结合血管灌注技术及三维成像技术可以清晰显示标本血管的三维影像，还可通过机器自带的分析软件将血管再生情况进行量化。因此，本研究利用 Micro-CT 及三维重建技术分析皮瓣术后血管再生情况，旨在直观揭示天然水蛭素在促进皮瓣术后微循环建立中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 32 只，雌雄不限，体质量（300±10）g，由广西医科大学实验动物中心提供。
天然水蛭素冻干粉（专利号：ZL03113566.8，编号：KK-001；南宁净雪皇生物工程有限公司）；肝素钠注射液（2 mL∶12 500 U；上海上药第一生化药业有限公司）；4% 组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司）；明胶（Sigma 公司，美国）；红色氧化铅（天津大茂化学试剂厂）。BRUKER SkyScan 1176 小动物活体 Micro-CT 成像系统（Bruker 公司，德国）；Image Pro-Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）。
1.2 大鼠缺血皮瓣模型制备及分组
取 32 只 SD 大鼠，经腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部设计一8.0 cm×1.8 cm 大小的超长随意皮瓣模拟缺血皮瓣[15]。无菌条件下，按设计线切开皮肤至深筋膜层，分离并掀起皮瓣，如有轴型血管将其切断并结扎，保证皮瓣不携带轴型血管，彻底止血后皮瓣原位缝合，所有手术操作均由同一人完成。将造模后大鼠按先后顺序编号，采用随机数字表法随机分为水蛭素组和对照组，每组 16 只。水蛭素组术后即刻及之后 3 d 内每天同一时间，于皮瓣中央距蒂部 2、4、6 cm 处皮下注射天然水蛭素，每处各 1 个点，每个点注射 0.1 mL，3 个点共注射天然水蛭素 6 ATU；对照组同法注射等量生理盐水。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
造模术后 6 d，观察两组大鼠皮瓣颜色，有无水肿、渗出、破溃以及皮瓣成活情况。每组随机取 8 只大鼠同上法麻醉后，数码相机摄背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 软件计算皮瓣成活率，公式为：皮瓣成活面积/皮瓣总面积×100%。
1.3.2 组织学观察
造模术后 6 d，两组取上述拍摄背部皮瓣照片后的大鼠，切取皮瓣中间处组织，置于 10% 甲醛固定 24 h，脱水、包埋、切片，片厚 3 μm，取部分切片行 HE 染色，光镜下观察皮瓣组织中微血管结构、炎性细胞数量及坏死情况。
1.3.3 Micro-CT 检测
造模术后 6 d，两组分别取剩余 8 只大鼠行心脏-主动脉穿刺术，之后依次用 10 U/mL 肝素钠注射液[16]200 mL、4% 多聚甲醛溶液 100 mL 及 5% 明胶氧化铅混合液 20 mL 灌注全身血管，灌注速度为 1 mL/s；以上液体均水浴加热并保持在 40℃，灌注完成后冲洗皮瓣周围造影剂，4℃ 冷藏 24 h。24 h 后切取皮瓣及其周围 1 cm 组织行 Micro-CT 三维重建，然后仅保留皮瓣组织再次行 Micro-CT 三维重建。Micro-CT 主要参数设置如下：电压 50 kV，电流 500 μA，曝光时间 880 ms，过滤片为 0.5 mm，图像像素为 8.75 μm。将原始数据重建后导入机器自带分析软件 CTAn 中，计算血管容积、长度及数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
术后两组大鼠均存活至实验完成，无感染发生。术后 6 d，两组皮瓣远端均出现坏死，呈灰黑色，组织质地变硬，部分皱缩，皮瓣出现明显坏死分界，对照组皮瓣坏死面积更大。见图 1。水蛭素组皮瓣成活率为 72.11%±8.97%，显著高于对照组的 58.94%±4.02%，组间比较差异有统计学意义（t=3.280，P=0.008）。
图1
术后 6 d 两组皮瓣大体观察
a. 水蛭素组；b. 对照组
Figure1. General observation of skin flap in each group at 6 days after operationa. Hirudin group; b. Control group
2.2 组织学观察
术后 6 d HE 染色示，水蛭素组和对照组均可见炎症细胞浸润，对照组部分细胞出现核皱缩和碎裂；水蛭素组炎症细胞浸润较轻，组织层次结构更清楚，且有较多微血管形成。见图 2。
图2
术后 6 d 两组 HE 染色观察
从左至右分别为×50、×100 a. 水蛭素组；b. 对照组
Figure2. HE staining observation of each group at 6 days after operationFrom left to right for ×50 and ×100, respectively a. Hirudin group; b. Control group
2.3 Micro-CT 检测
术后 6 d，皮瓣及其周围 1 cm 组织 Micro-CT 三维重建显示，两组皮瓣血管和周围组织血管均有部分连接，越靠近皮瓣蒂部连接越紧密，其中水蛭素组较对照组连接密度更大，切缘处形成了与四周组织血管方向大体一致的新生血管。仅保留皮瓣组织 Micro-CT 三维重建显示，水蛭素组皮瓣远端有较多新生血管形成，血管的分布密度及连续性均优于对照组。见图 3。水蛭素组血管容积、血管长度及血管数量均显著大于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
两组 Micro-CT 检测指标比较（n=8，）
Table1.
Comparison of Micro-CT indexes between two groups (n=8, )
图3
两组 Micro-CT 三维重建
从左至右分别为对照组和水蛭素组 a. 皮瓣及周围组织；b. 皮瓣组织
Figure3. Micro-CT 3D reconstruction of the two groupsFrom left to right for control group and hirudin group, respectively a. Skin flap and the tissue around the skin flap; b. Skin flap
3 讨论
任意皮瓣具有取材丰富、操作简便等诸多优点，在整形外科应用广泛。当皮瓣长宽比超过 2∶1 时，皮瓣远端容易发生缺血坏死[17-18]。本研究采用了长宽比超过 4∶1 的超长任意皮瓣构建缺血皮瓣模型，通过水蛭素药物干预，以期进一步了解天然水蛭素对皮瓣成活的影响；同时明胶氧化铅灌注结合 Micro-CT 和三维重建技术，可在不破坏标本情况下直观显示皮瓣内部整体血管网结构，并进行相关血管参数计算[19]，为后期临床应用提供实验依据及参考。
皮瓣移植后，切口及周边组织会合成并释放大量凝血酶，并通过凝血酶受体诱导一系列病理生理反应，最终抑制血管生成[20]。天然水蛭素作为凝血酶的特异性拮抗剂，通过拮抗凝血酶的相关信号通路，对血管生成因子（如 VEGF）与抗血管生成因子（如血小板反应蛋白 1、内皮抑素）进行调节，进而促进皮瓣血管再生[21]。本研究中，水蛭素组术后皮瓣成活率及血管长度、容积和数量均显著大于对照组，与既往研究结果一致[9-10, 12]，说明天然水蛭素在改善皮瓣成活及促进血管再生方面效果显著。
皮瓣远端坏死常见原因有循环血供来源改变、血供不足导致的灌注压显著下降、炎症反应和氧化应激导致的微循环内血流淤滞、微血栓形成等[22-25]；而皮瓣成活有赖于血供及时恢复和重建以及皮瓣远端组织有效血液灌注[26]。有研究证实，任意皮瓣术后成活除通过蒂部供血外，还必须通过暴露的真皮下血管网及四周创缘吸取营养[27-28]。我们发现术后 6 d 皮瓣除最远端均有血管与周围组织血管连通外，还表现为皮瓣血管与周围组织血管走行一致，并跨过切缘，说明此处已有新生血管形成，或是原有闭塞的管腔被打通；同时水蛭素组和对照组均有连续性血管跨过切缘，这些血管走行方向与皮瓣周围血管方向大体一致。由于各种调节因子都需依赖功能性的血管网络运输到相关目的地才能最终发挥作用[29]，所以我们分析这种大体一致的方向性，可能与切缘两侧各种调节因子随血液循环能到达的最远处距离及血流方向有关。
皮瓣及其周围 1 cm 组织 Micro-CT 检测三维重建显示，水蛭素组形成的连通血管较对照组更多，说明天然水蛭素在皮瓣与周围组织的血管再通或血管再生中起关键作用。同时，水蛭素组不仅皮瓣组织血管较对照组多，皮瓣周围组织的血管也较对照组更密集，提示天然水蛭素不仅能促进局部血管再生，也能在一定程度上促进损伤部位周围（切缘两侧）组织血管再生。这可能是由于其抗凝水平的发挥依赖于血液循环及损伤部位[29]，但这一结论还需要进一步实验验证。由于天然水蛭素局部皮下注射生物利用度高[30]，本研究结论对后期缺血组织的临床处理具有一定指导意义。但本研究对灌注和取材的操作要求较高，若操作不熟练，会影响实验结果的可靠性。
综上述，局部皮下注射天然水蛭素能够减轻组织炎症，通过增加新生血管形成或促进闭塞血管再通，改善缺血区血供，从而提高皮瓣成活率。
作者贡献：严玉勇直接参与实验设计、实施及文章起草；潘新元参与实验设计与统计分析；林博杰参与实验设计；林冠宇参与数据收集整理；殷国前对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：动物实验均经广西医科大学（广西实验动物中心）实验动物伦理委员会批准（201803051），实验动物使用许可证批准号：SYXK桂2014-0003。
