引用本文： 程傲, 何鹏杰, 张俊宇, 郑伟伟, 杨民. 缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子 1α 与自噬相关分子的表达及相关性分析. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(3): 318-322. doi: 10.7507/1002-1892.201908088 复制
椎间盘是人体最早发生退变的组织之一[1]，也是一种无血管组织，其血供主要依靠纤维环途径和终板途径（主要途径）[2]。因此，椎间盘中心为低氧环境，导致髓核细胞主要通过糖酵解途径来提供能量。脊柱退行性病变及脊柱损伤时，髓核组织因受压或者血管损伤导致血供进一步减少，从而造成髓核细胞缺血缺氧。在缺血缺氧过程中，髓核细胞会启动一系列分子机制来提高对缺氧环境的耐受力，其中比较重要的分子调控机制为缺氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和自噬，二者的分子通路和作用已被证实[3-4]。HIF-1α 能通过 Beclin1 信号通路启动自噬[5]，且 HIF-1α 在大鼠髓核细胞中常规表达[6]。但是，大鼠髓核细胞在缺氧条件下是否存在自噬以及缺氧条件下 HIF-1α 与自噬的相关性，国内尚罕见相关报道。鉴于此，本实验拟通过体外细胞实验研究二者在缺氧条件下的表达量及其相关性，以期为髓核细胞缺血缺氧类疾病的治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，体质量 225～250 g，由皖南医学院附属弋矶山医院中心实验室提供。
DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Biosharp 公司，美国）；兔抗 HIF-1α 单克隆抗体、兔抗 LC3B 单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；兔抗 Beclin1 单克隆抗体、兔抗 β-actin 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；TRIzol（Invitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）。
Mannedorf 多功能酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；紫外分光光度计（Genova Nano 公司，英国）；DP70 倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Image J 软件（National Institutes of Health 公司，美国）；CO2 细胞培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）。
1.2 大鼠髓核细胞分离培养及鉴定
取 20 只健康成年 SD 大鼠，采用致死剂量的 CO2 处死后取其尾骨，用尖刀片剔除多余组织，暴露椎间盘，切开纤维环取出髓核组织。将髓核组织清洗干净后置于含 1% 青-链霉素的 DMEM/F12 培养液的 EP 管中，移至超净工作台；无菌条件下，用眼科剪将髓核组织剪成大小约 1 mm×1 mm×1 mm 碎片，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液；加入 0.1% Ⅱ型胶原酶和 2 U/mL 透明质酸酶消化 4 h，200 目无菌网过滤；将沉淀以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液；用吸管将离心后组织种植于 25 cm2培养瓶中，2 h 后翻转培养瓶，加入含 1×105 U/L 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 mg/L 链霉素的 DMEM/F12 培养基中。待培养瓶中细胞融合达 80% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，第 1、2 代细胞均用差速贴壁法进行分离纯化；将第 3 代细胞[7]以密度 3×105个/mL 接种于 6 孔板中爬片，待细胞贴壁后行 HE 染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定。
1.3 实验分组及方法
取第 3 代髓核细胞以每孔 2×105个/mL 密度接种至 4 块 6 孔板培养皿中，将 4 块 6 孔板随机分为 A、B、C、D 组。A、B 组细胞不作处理，C 组细胞转染 HIF-1α-小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）[8]，D 组加入自噬抑制剂 3-MA[9]。然后，将 A 组细胞置于正常氧含量培养环境（37℃、5%CO2、20%O2）培养，B、C、D 组细胞置于缺氧环境（37℃、5%CO2、1%O2）培养。培养 8 h 后取出各组细胞进行观测。
1.4 观测指标
1.4.1 Western blot 检测 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
各组细胞用无菌 PBS 冲洗 3 次，然后用蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟提取细胞总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度。然后将蛋白置于 100℃ 金属浴中加热 10 min，使其充分变性，–80℃ 保存备用。每次取适量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，5% 脱脂牛奶封闭，加入一抗兔抗 HIF-1α 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗 LC3B 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗 Beclin1 单克隆抗体（1∶1 000）及兔抗 β-actin 单克隆抗体（1∶5 000），4℃ 过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），室温孵育 2 h；常规 ECL 发光液显色。采用 Image J 软件分析蛋白条带，计算各蛋白相对表达量。其中自噬相关分子 LC3B 蛋白相对表达量以 LC3-Ⅱ与 LC3-Ⅰ的比值表示。
1.4.2 实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 表达
各组细胞用无菌 PBS 冲洗 3 次，每孔加入 200 μL 预冷 TRIzol 试剂以提取髓核细胞总 RNA，–80℃ 保存备用。取适量总 RNA，参照逆转录试剂盒说明进行 qRT-PCR 反应。反应条件：95℃、10 min 预变性；95℃、15 s，60℃、1 min，40 个循环；65℃、5 s；95℃、0.5 s。各引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成，见表 1。采用 2−ΔΔCt法检测各目的基因相对表达量，以 β-actin 作为内参，其中 LC3B mRNA 相对表达量以 LC3-Ⅱ表示。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠髓核细胞形态观察及鉴定
光镜观察示，培养 7 d 左右可见原代大鼠髓核细胞贴壁，细胞形态一致，呈圆形和多角形。经分离纯化的第 3 代大鼠髓核细胞 HE 染色后细胞质呈淡粉色，细胞核呈蓝黑色；Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性[10]。见图 1。
图1
大鼠髓核细胞形态学观察及鉴定
a. 原代髓核细胞（×100）；b. 第 3 代细胞 HE 染色观察（×40）；c. 第 3 代细胞Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色观察（荧光显微镜×40）
Figure1. Morphological observation and identification of rat nucleus pulposus cellsa. Primary nucleus pulposus cells (×100); b. HE staining of the 3rd generation cells (×40); c. Collagenase type Ⅱ immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence microscope×40)
2.2 Western blot 检测 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
B 组 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α、Beclin1 蛋白相对表达量均显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组各蛋白相对表达量均较 B 组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；D 组 HIF-1α 蛋白相对表达量与 B 组比较差异无统计学意义（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相对表达量较 B 组显著降低（P<0.05）。见图 2 及表 2。
图2
Western blot 检测各组大鼠髓核细胞中 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：B 组3：C 组 4：D 组
Figure2. HIF-1α and autophagy related molecules expressions in rat nucleus pulposus cells of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot 检测各组 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白相对表达量（n=3，
）
Table2.
The relative protein expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by Western blot (n=3, 
)
2.3 qRT-PCR 检测 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 表达
B 组 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相对表达量均显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相对表达量均较 B 组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；D 组 HIF-1α mRNA 相对表达量与 B 组比较差异无统计学意义（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ mRNA 相对表达量均较 B 组显著降低（P<0.05）。见表 3。
表3
qRT-PCR 检测各组 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 相对表达量（n=3，
）
Table3.
The relative mRNA expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
3 讨论
腰椎间盘突出症是临床常见病及多发病，严重影响患者日常生活质量，甚至致残[11]。导致腰椎间盘突出症的最主要原因是腰椎间盘退行性变，在退变过程中椎间盘血供会进一步减少，造成髓核细胞处于缺血缺氧状态。缺血缺氧的髓核细胞会启动一系列分子机制以提高对缺氧环境的耐受力，减少髓核细胞死亡。研究表明[12]，缺氧条件下肿瘤相关成纤维细胞的 HIF-1α 表达会上升，并通过 Beclin1 途径诱导自噬，从而保护细胞。而髓核细胞中是否存在相同分子机制，以及二者是否存在相关性尚未明确。
HIF-1α 是一种广泛存在于哺乳动物细胞内的转录因子，其功能包括红细胞和血管的生成、细胞的增殖和凋亡等多个方面[13]。当组织处于缺氧状态时，HIF-1α 能够发挥基因调控和转录作用，促进血管生成，以提高组织对于缺氧环境的耐受力。因此，本研究通过检测 HIF-1α 的表达来衡量髓核细胞的缺氧程度。
1962 年，Ashford 和 Porter 发现细胞内有“自己吃自己”的现象并提出“自噬”观点[14]，即从粗面内质网无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分细胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解所包裹的内容物，以实现细胞代谢需要和某些细胞器的更新过程。自噬相关分子主要有 Beclin1、LC3B，其中后者常作为衡量自噬发生的关键性指标[15]。
本研究中，首先在常氧和缺氧状态下分别培养正常髓核细胞 8 h，结果发现缺氧状态下大鼠髓核细胞中的 HIF-1α、Beclin1 表达量较常氧状态明显上升，且 LC3B 表达量明显增高。然后，利用 HIF-1α-siRNA 沉默大鼠髓核细胞 HIF-1α[16]，验证其是否参与缺氧条件下的自噬。C 组细胞在缺氧条件下培养 8 h 后，HIF-1α 表达量较 B 组明显下降，自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 表达量亦明显下降，提示 HIF-1α-siRNA 能够降低 HIF-1α 的表达，并且下调的 HIF-1α 能够降低自噬相关分子的表达，说明 HIF-1α 参与了缺氧条件下自噬的相关调控。为了验证自噬是否逆向参与调控 HIF-1α 的表达，进一步在正常髓核细胞中加入自噬抑制剂 3-MA，同样在缺氧条件下培养 8 h，发现 HIF-1α 正常表达且与 B 组缺氧条件下培养正常髓核细胞相当，而自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 的表达量较 B 组明显下降，可见自噬抑制剂能够明显降低自噬水平，且自噬相关分子表达的降低对于 HIF-1α 的表达无明显影响。
综上述，缺氧条件能够诱导大鼠髓核细胞中 HIF-1α 和自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 的表达，且 HIF-1α 与自噬相关分子的表达具有相关性，即 HIF-1α 下调能够降低自噬相关分子的表达。而缺氧条件下自噬水平的下调对 HIF-1α 的表达无明显影响。研究表明[17]，HIF-1α 能够通过促进血管新生，提高髓核细胞对缺氧环境的耐受能力；而细胞自噬是通过溶酶体分解衰老、受损或者死亡的细胞，从而为正常细胞的生存提供营养物质。结合本研究结果提示二者对缺氧状态下髓核细胞的保护具有协同作用。本研究在细胞水平验证了缺氧状态下，髓核细胞中 HIF-1α 与自噬相关分子表达明显上升，且二者具有相关性，为进一步探索二者对于髓核细胞保护中协同作用的分子机制，从而为脊髓损伤等造成髓核细胞缺血缺氧类疾病的治疗提供一定理论支持[18-19]。
作者贡献：程傲参与实验设计及实施、数据收集、统计分析和文章撰写；何鹏杰、张俊宇参与实验设计及数据统计分析；郑伟伟参与实验数据分析、文章修改；杨民参与实验设计、实验数据整理，文章的思路设计及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：实验方案经皖南医学院附属弋矶山医院实验动物伦理委员会批准。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2018-004。
椎间盘是人体最早发生退变的组织之一[1]，也是一种无血管组织，其血供主要依靠纤维环途径和终板途径（主要途径）[2]。因此，椎间盘中心为低氧环境，导致髓核细胞主要通过糖酵解途径来提供能量。脊柱退行性病变及脊柱损伤时，髓核组织因受压或者血管损伤导致血供进一步减少，从而造成髓核细胞缺血缺氧。在缺血缺氧过程中，髓核细胞会启动一系列分子机制来提高对缺氧环境的耐受力，其中比较重要的分子调控机制为缺氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和自噬，二者的分子通路和作用已被证实[3-4]。HIF-1α 能通过 Beclin1 信号通路启动自噬[5]，且 HIF-1α 在大鼠髓核细胞中常规表达[6]。但是，大鼠髓核细胞在缺氧条件下是否存在自噬以及缺氧条件下 HIF-1α 与自噬的相关性，国内尚罕见相关报道。鉴于此，本实验拟通过体外细胞实验研究二者在缺氧条件下的表达量及其相关性，以期为髓核细胞缺血缺氧类疾病的治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，体质量 225～250 g，由皖南医学院附属弋矶山医院中心实验室提供。
DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Biosharp 公司，美国）；兔抗 HIF-1α 单克隆抗体、兔抗 LC3B 单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；兔抗 Beclin1 单克隆抗体、兔抗 β-actin 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；TRIzol（Invitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）。
Mannedorf 多功能酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；紫外分光光度计（Genova Nano 公司，英国）；DP70 倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Image J 软件（National Institutes of Health 公司，美国）；CO2 细胞培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）。
1.2 大鼠髓核细胞分离培养及鉴定
取 20 只健康成年 SD 大鼠，采用致死剂量的 CO2 处死后取其尾骨，用尖刀片剔除多余组织，暴露椎间盘，切开纤维环取出髓核组织。将髓核组织清洗干净后置于含 1% 青-链霉素的 DMEM/F12 培养液的 EP 管中，移至超净工作台；无菌条件下，用眼科剪将髓核组织剪成大小约 1 mm×1 mm×1 mm 碎片，以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液；加入 0.1% Ⅱ型胶原酶和 2 U/mL 透明质酸酶消化 4 h，200 目无菌网过滤；将沉淀以离心半径 10 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液；用吸管将离心后组织种植于 25 cm2培养瓶中，2 h 后翻转培养瓶，加入含 1×105 U/L 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 mg/L 链霉素的 DMEM/F12 培养基中。待培养瓶中细胞融合达 80% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，第 1、2 代细胞均用差速贴壁法进行分离纯化；将第 3 代细胞[7]以密度 3×105个/mL 接种于 6 孔板中爬片，待细胞贴壁后行 HE 染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定。
1.3 实验分组及方法
取第 3 代髓核细胞以每孔 2×105个/mL 密度接种至 4 块 6 孔板培养皿中，将 4 块 6 孔板随机分为 A、B、C、D 组。A、B 组细胞不作处理，C 组细胞转染 HIF-1α-小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）[8]，D 组加入自噬抑制剂 3-MA[9]。然后，将 A 组细胞置于正常氧含量培养环境（37℃、5%CO2、20%O2）培养，B、C、D 组细胞置于缺氧环境（37℃、5%CO2、1%O2）培养。培养 8 h 后取出各组细胞进行观测。
1.4 观测指标
1.4.1 Western blot 检测 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
各组细胞用无菌 PBS 冲洗 3 次，然后用蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟提取细胞总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度。然后将蛋白置于 100℃ 金属浴中加热 10 min，使其充分变性，–80℃ 保存备用。每次取适量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，5% 脱脂牛奶封闭，加入一抗兔抗 HIF-1α 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗 LC3B 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗 Beclin1 单克隆抗体（1∶1 000）及兔抗 β-actin 单克隆抗体（1∶5 000），4℃ 过夜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），室温孵育 2 h；常规 ECL 发光液显色。采用 Image J 软件分析蛋白条带，计算各蛋白相对表达量。其中自噬相关分子 LC3B 蛋白相对表达量以 LC3-Ⅱ与 LC3-Ⅰ的比值表示。
1.4.2 实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 表达
各组细胞用无菌 PBS 冲洗 3 次，每孔加入 200 μL 预冷 TRIzol 试剂以提取髓核细胞总 RNA，–80℃ 保存备用。取适量总 RNA，参照逆转录试剂盒说明进行 qRT-PCR 反应。反应条件：95℃、10 min 预变性；95℃、15 s，60℃、1 min，40 个循环；65℃、5 s；95℃、0.5 s。各引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成，见表 1。采用 2−ΔΔCt法检测各目的基因相对表达量，以 β-actin 作为内参，其中 LC3B mRNA 相对表达量以 LC3-Ⅱ表示。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠髓核细胞形态观察及鉴定
光镜观察示，培养 7 d 左右可见原代大鼠髓核细胞贴壁，细胞形态一致，呈圆形和多角形。经分离纯化的第 3 代大鼠髓核细胞 HE 染色后细胞质呈淡粉色，细胞核呈蓝黑色；Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性[10]。见图 1。
图1
大鼠髓核细胞形态学观察及鉴定
a. 原代髓核细胞（×100）；b. 第 3 代细胞 HE 染色观察（×40）；c. 第 3 代细胞Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色观察（荧光显微镜×40）
Figure1. Morphological observation and identification of rat nucleus pulposus cellsa. Primary nucleus pulposus cells (×100); b. HE staining of the 3rd generation cells (×40); c. Collagenase type Ⅱ immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence microscope×40)
2.2 Western blot 检测 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
B 组 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α、Beclin1 蛋白相对表达量均显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组各蛋白相对表达量均较 B 组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；D 组 HIF-1α 蛋白相对表达量与 B 组比较差异无统计学意义（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相对表达量较 B 组显著降低（P<0.05）。见图 2 及表 2。
图2
Western blot 检测各组大鼠髓核细胞中 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：B 组3：C 组 4：D 组
Figure2. HIF-1α and autophagy related molecules expressions in rat nucleus pulposus cells of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot 检测各组 HIF-1α 与自噬相关分子蛋白相对表达量（n=3，）
Table2.
The relative protein expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by Western blot (n=3, )
2.3 qRT-PCR 检测 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 表达
B 组 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相对表达量均显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相对表达量均较 B 组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；D 组 HIF-1α mRNA 相对表达量与 B 组比较差异无统计学意义（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ mRNA 相对表达量均较 B 组显著降低（P<0.05）。见表 3。
表3
qRT-PCR 检测各组 HIF-1α 与自噬相关分子 mRNA 相对表达量（n=3，）
Table3.
The relative mRNA expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
3 讨论
腰椎间盘突出症是临床常见病及多发病，严重影响患者日常生活质量，甚至致残[11]。导致腰椎间盘突出症的最主要原因是腰椎间盘退行性变，在退变过程中椎间盘血供会进一步减少，造成髓核细胞处于缺血缺氧状态。缺血缺氧的髓核细胞会启动一系列分子机制以提高对缺氧环境的耐受力，减少髓核细胞死亡。研究表明[12]，缺氧条件下肿瘤相关成纤维细胞的 HIF-1α 表达会上升，并通过 Beclin1 途径诱导自噬，从而保护细胞。而髓核细胞中是否存在相同分子机制，以及二者是否存在相关性尚未明确。
HIF-1α 是一种广泛存在于哺乳动物细胞内的转录因子，其功能包括红细胞和血管的生成、细胞的增殖和凋亡等多个方面[13]。当组织处于缺氧状态时，HIF-1α 能够发挥基因调控和转录作用，促进血管生成，以提高组织对于缺氧环境的耐受力。因此，本研究通过检测 HIF-1α 的表达来衡量髓核细胞的缺氧程度。
1962 年，Ashford 和 Porter 发现细胞内有“自己吃自己”的现象并提出“自噬”观点[14]，即从粗面内质网无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分细胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解所包裹的内容物，以实现细胞代谢需要和某些细胞器的更新过程。自噬相关分子主要有 Beclin1、LC3B，其中后者常作为衡量自噬发生的关键性指标[15]。
本研究中，首先在常氧和缺氧状态下分别培养正常髓核细胞 8 h，结果发现缺氧状态下大鼠髓核细胞中的 HIF-1α、Beclin1 表达量较常氧状态明显上升，且 LC3B 表达量明显增高。然后，利用 HIF-1α-siRNA 沉默大鼠髓核细胞 HIF-1α[16]，验证其是否参与缺氧条件下的自噬。C 组细胞在缺氧条件下培养 8 h 后，HIF-1α 表达量较 B 组明显下降，自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 表达量亦明显下降，提示 HIF-1α-siRNA 能够降低 HIF-1α 的表达，并且下调的 HIF-1α 能够降低自噬相关分子的表达，说明 HIF-1α 参与了缺氧条件下自噬的相关调控。为了验证自噬是否逆向参与调控 HIF-1α 的表达，进一步在正常髓核细胞中加入自噬抑制剂 3-MA，同样在缺氧条件下培养 8 h，发现 HIF-1α 正常表达且与 B 组缺氧条件下培养正常髓核细胞相当，而自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 的表达量较 B 组明显下降，可见自噬抑制剂能够明显降低自噬水平，且自噬相关分子表达的降低对于 HIF-1α 的表达无明显影响。
综上述，缺氧条件能够诱导大鼠髓核细胞中 HIF-1α 和自噬相关分子 Beclin1 和 LC3B 的表达，且 HIF-1α 与自噬相关分子的表达具有相关性，即 HIF-1α 下调能够降低自噬相关分子的表达。而缺氧条件下自噬水平的下调对 HIF-1α 的表达无明显影响。研究表明[17]，HIF-1α 能够通过促进血管新生，提高髓核细胞对缺氧环境的耐受能力；而细胞自噬是通过溶酶体分解衰老、受损或者死亡的细胞，从而为正常细胞的生存提供营养物质。结合本研究结果提示二者对缺氧状态下髓核细胞的保护具有协同作用。本研究在细胞水平验证了缺氧状态下，髓核细胞中 HIF-1α 与自噬相关分子表达明显上升，且二者具有相关性，为进一步探索二者对于髓核细胞保护中协同作用的分子机制，从而为脊髓损伤等造成髓核细胞缺血缺氧类疾病的治疗提供一定理论支持[18-19]。
作者贡献：程傲参与实验设计及实施、数据收集、统计分析和文章撰写；何鹏杰、张俊宇参与实验设计及数据统计分析；郑伟伟参与实验数据分析、文章修改；杨民参与实验设计、实验数据整理，文章的思路设计及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：实验方案经皖南医学院附属弋矶山医院实验动物伦理委员会批准。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2018-004。
