引用本文： 连强强, 迟博婧, 张柳, 田发明. Wnt信号通路对软骨和软骨下骨双靶向调控及其在骨关节炎进展中的作用. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(6): 797-803. doi: 10.7507/1002-1892.201909088 复制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的退化性关节疾病之一，也是中老年人致残的主要原因之一[1-2]。结构性 OA 在 50 岁以上人群中女性比男性更常见，且无论男女患病率都会随年龄增长而急剧上升[3]。60 岁以上老年人患病率为 11%，且发病呈年轻化趋势，给社会及家庭造成沉重经济负担[4]。既往对 OA 的定义一直集中在关节软骨的变化，而现在其被认为是一种全关节疾病，伴随软组织及矿化组织的相互作用[5]，包括软骨丢失、骨赘形成，关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊和滑膜改变，最终导致关节功能衰竭[3-5]，其中软骨、软骨下骨及滑膜在 OA 病理改变的发生发展中扮演重要角色[6-7]。多年来国内外学者对 OA 发生发展的分子机制进行了研究，发现与 Wnt/β-catenin、TGF-β、JAK/STAT、NF-κB 等信号通路相关[8-11]，其中 Wnt 信号通路在骨、软骨发育中起到双重作用[12]，通过影响 Wnt 信号通路的活性可以对软骨下骨及关节软骨的代谢造成影响。本文通过整理近年文献，对 Wnt 信号通路在细胞功能调控和 OA 发生发展中其对软骨下骨、关节软骨的具体分子机制进行综述，探讨 Wnt 信号通路对软骨、软骨下骨双靶向调控在 OA 进展中的作用，为探索 OA 的有效治疗药物提供新的思路和靶点。
1 Wnt 信号通路的组成及细胞内调控机制
Wnt 信号通路分为依赖 β-catenin 的经典 Wnt 信号通路和不依赖 β-catenin 的非经典 Wnt 信号通路。见图 1。经典 Wnt 信号通路通过 Wnt 蛋白结合至 Frizzled 和低密度脂蛋白受体相关蛋白 5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[13-14]，通过下游复合体蛋白间的相互作用、构象变化及磷酸化状态的转变增加了 β-catenin 稳定性，从而被激活[14-16]。β-catenin 氨基酸末端磷酸化导致 β-catenin 核转位，并通过核效应因子 T 细胞因子/淋巴增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）转换因子激活下游靶基因的转录[15]，磷酸化的 β-catenin 被 β-转导素重复序列包含蛋白（β-TrCP）识别，经泛素蛋白酶体途径降解。非经典 Wnt 信号通路主要由 Wnt5a 激活，可分为 Wnt/Ca2+和平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）通路。Wnt/Ca2+信号通路通过蛋白激酶 C 和钙调蛋白激酶Ⅱ激活钙信号，并与 T 细胞相关转录因子结合转录，调控细胞骨架重排、细胞黏附和迁移。在 PCP 通路中，Wnt5a 激活 Rho/Rho 相关激酶和 Rac/c-Jun N-末端激酶信号通路，调控细胞中的肌动蛋白聚合[17]。细胞外分泌的 Dickkopf（DKK）蛋白可通过结合 LRP5/6 抑制 β-catenin 核转位，从而阻断 Wnt 信号通路调节细胞功能[16，18]。
图1
Wnt 信号通路传导示意图 a. 经典 Wnt 信号通路；b. 非经典 Wnt 信号通路
注：Dvl：Dishevelled；CK1：酪蛋白激酶 1；P：磷酸化；Ub：泛素；Proteasome：蛋白酶体；APC：腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白；PKC：蛋白激酶 C；TCF：T 细胞因子；CaMKⅡ：钙调蛋白激酶Ⅱ；NFAT：活化 T 细胞核因子；JNK：Jun N 端激酶；Rho：Ras homologous；Rac：Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Figure1. Schematic diagram of the Wnt signaling pathway transduction a. Classic Wnt signaling pathway; b. Non-classical Wnt signaling pathway2 Wnt 信号通路对软骨及软骨下骨发育的调控作用
2.1 对软骨细胞功能和软骨发育的调控作用
关节软骨是一种生理上非自我更新的无血管组织，具有独特的细胞类型——软骨细胞，软骨细胞的功能是产生和维持软骨细胞外基质。Wnt/β-catenin 信号通路是骨、软骨和关节发育及内稳态的关键调节器，它在许多生物学过程中发挥着重要作用，包括间充质细胞的凝聚和分化、成熟关节软骨表型的维持、软骨内成骨过程中肥厚组织的成熟等[19]。
Wnt 信号通路除了在软骨形成和软骨细胞成熟过程中发挥作用外，还参与维持完全分化的软骨细胞表型，因此可能在维持整个成年期的软骨稳态中发挥重要作用[20]。Chen 等[21]通过研究 Wnt 家族 mRNA 及蛋白在 C57BL/6 小鼠出生前及出生后下颌骨髁突软骨中的表达，发现在胚胎时期，Wnt9a 主要见于增生性和矿化性肥大软骨细胞，并在分化软骨细胞及未分化软骨细胞的细胞核中可见明显的 Lef1 表达；而在出生后阶段，肥厚和矿化的软骨细胞中 Wnt4a 表达逐渐降低。结果表明 Wnt 信号通路在不同时期可调控下颌髁突软骨细胞功能，并与软骨的发育状况息息相关。Zhang 等[22]研究发现，软骨细胞可经 Wnt/β-catenin 信号通路产生一种基质蛋白——富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine-rich protein 61，CCN1），在体外分离的胸骨软骨细胞、胚胎软骨和出生后软骨中均发现 β-catenin 信号转导可以增加 CCN1 表达并促进软骨细胞的成熟，而且过表达 CCN1 的转基因小鼠成年后出现发育异常和软骨变性。Huang 等[23]利用 Wnt 信号阻断剂 PKF118-310 和激动剂 6-溴联苯-3’-氧基（BIO）观察人 MSCs 的成软骨分化，随后建立球粒培养体系，进行 5 周的三维软骨分化。结果显示激活经典 Wnt 信号通路显著下调了软骨特异性基因 SRY-box 转录因子 9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）、Ⅱ型胶原 α1 链（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13 的表达，但增加了含凝血酶敏感素基序的整合素和金属蛋白酶 4、5（a sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4、5，ADAMTS-4、5）的表达；PKF118-310 对 Wnt 信号的抑制增加了 SOX9、COL2A1、AGG 和 MMP-9 的表达，但降低了 MMP-13 和 ADAMTS-4、5 的表达，表明 Wnt 信号的过表达或过抑制在一定程度上都会对软骨细胞分化产生影响。上述研究表明，生理状态下 Wnt 信号通路通过上调或下调关键分子表达，调控 MSCs 向软骨细胞方向分化、促进软骨细胞成熟、维持软骨细胞表型，并通过减少 MMP-1、3、9、13 的表达维持软骨的正常结构及生理功能。
2.2 对成骨细胞、破骨细胞及骨细胞功能和软骨下骨内环境稳态的调控作用
Wnt/β-catenin 信号通路在调控成骨细胞、破骨细胞及骨细胞的功能中发挥重要作用，并影响骨骼发育和内稳态，异常的 Wnt 信号可导致骨骼缺陷等疾病[24]。Yang 等[25]研究表明，BMSCs 通过 Wnt5a/Ror2 信号对破骨细胞的迁移与分化起到重要作用，并导致骨量减少，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞增加，最终表现为软骨下小梁骨丢失。Esen 等[26]研究发现，mTORC2-AKT 信号下游 Rac1 可调节 LRP5，并通过在体外实验中抑制 Wnt3a 诱导的代谢酶类表达影响成骨细胞分化，体内实验中敲除小鼠 LRP5 可致出生后骨量减少，表明了 Wnt 信号通路在调控成骨细胞分化与代谢方面有潜在作用。Heilmann 等[27]研究发现，非经典 Wnt 信号可通过 Frizzled 家族 Fzd9 受体调控成骨细胞，并正向促进膜内和软骨内的骨形成，而不参与软骨形成或破骨细胞对矿化基质的降解，表明 Wnt 信号通路在促进 BMSCs 成骨分化中具有重要作用，并且 Wnt 信号通路参与膜内成骨和软骨内成骨[28]。Zhang 等[29]研究发现，Wnt/β-catenin 信号活跃在各种成骨细胞或成骨细胞前体细胞系中，包括 MC3T3-E1、2T3、C2C12 及 C3H10T1/2 细胞系；此外，Wnt 信号通过与 BMP 通路的交联，影响 BMP 信号活性、成骨细胞分化和骨形成。成骨细胞内 Wnt 信号通路变化可引起骨量变化，成骨细胞来源的 Wnt5a 可以通过激活 Ror2 受体促进破骨细胞分化，正常的破骨细胞分化需要 β-catenin 的动态调节，表明 Wnt 配体在成骨过程中可能具有阶段性的特异性作用[30]。Roberts 等[31]应用条件性敲除成熟破骨细胞中 Wnt5a 的组织蛋白酶 K-cre（Ctsk-cre）小鼠进行研究，发现这些小鼠小梁骨和皮质骨减少，并且该低骨量表型并非破骨细胞介导的骨吸收增加，而是骨形成减少，表明破骨细胞来源的 Wnt5a 对维持骨内平衡有重要影响。Alam 等[32]用骨细胞中过表达人 Wnt16 的转基因小鼠进行研究，发现转基因小鼠骨形态计量学参数、骨密度及皮质骨厚度均显著高于野生型小鼠，表明 Wnt16 通过对骨细胞的调控，在皮质骨和小梁骨的质量和强度方面起着关键作用。
上述研究表明经典 Wnt 信号通路可激活成骨细胞活性，促进成骨细胞分化和膜内及软骨内的骨形成，并在骨量调节中起到关键作用，而不同来源的 Wnt5a 信号通路可促进破骨细胞分化及调控骨形成，不仅对破骨细胞形成有重要调控作用，还能维持正常骨量。因此，Wnt/β-catenin 信号通路对成骨细胞、破骨细胞及骨细胞功能调控的同时，维持了软骨及软骨下骨内环境稳态。
3 Wnt 信号通路在 OA 状态下对软骨及软骨下骨的影响
3.1 Wnt 信号异常对 OA 发生发展中软骨的作用
OA 关节的病理变化包括关节软骨退化、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症、韧带退化、膝关节半月板及关节囊肥大，这些病理改变导致 OA 或 OA 症状的发生[33]。OA 状态下基质蛋白和基质降解酶类的产生增加，软骨细胞稳态失衡，基质重塑及异常的肥大样成熟，导致软骨钙化。在 OA 中基质降解酶类包括聚集蛋白聚糖酶、胶原酶、MMP 家族成员以及多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。OA 早期的基质降解起因是可降解 AGG 的 MMP-3 和 ADAMTS-5 表达增加，随后是分解胶原的酶活性增加，尤其是 MMP-13，可高效降解Ⅱ型胶原蛋白，一旦胶原蛋白网络被降解，这种改变无法逆转[34]。
软骨细胞表达多种 Wnt 信号家族成员，Wnt 信号过度激活与 OA 严重程度成正相关。Hou 等[35]发现在 OA 软骨和 IL-1β 刺激的软骨细胞中 Wnt3a 表达增强，并且 Wnt3a 的过表达降低了软骨基质分子Ⅱ型胶原和 AGG 的表达，并增加了 MMP-13 和 ADAMTS-4 的表达。Liu 等[36]在 IL-1β 诱导的软骨 OA 模型中研究发现，软骨细胞中 β-catenin、Runx2 及 Wnt5a 的表达增加。Nalesso 等[37]研究发现，Wnt16 缺陷小鼠表现出更严重的 OA，表现为润滑素表达降低和软骨细胞凋亡增加，并且 Wnt16 降低了 Wnt3a 激活经典 Wnt 信号通路的能力。Monteagudo 等[38]研究发现，Wnt 信号通路被过度激活时会导致 OA，DOT1L（一种参与组蛋白甲基化的酶）通过抑制 Wnt 信号通路保护软骨，而 DOT1L 缺失破坏了体外正常的软骨细胞分子特征，并导致小鼠 OA。Klotho 是一种 Wnt/β-catenin 信号转导的内源性拮抗剂，Gu 等[39]研究发现与正常小鼠相比，OA 小鼠中 Klotho 表达显著降低，Wnt/β-catenin 的活性及其靶基因表达上调。在 OA 软骨中，Klotho 表达降低可激活 Wnt/β-catenin 信号转导，从而诱发软骨损伤。Deshmukh 等[40]研究发现应用新型小分子 Wnt 信号通路抑制剂 SM04690，可使人 BMSCs 分化为成熟有功能的软骨细胞，并使软骨分解代谢标志物水平降低，并且在啮齿类 OA 模型关节内注射 SM04690，可使软骨厚度增加，并观察到软骨再生，降低 MMP-1、3、13 和 ADAMTS-5 的表达，保护软骨免受分解代谢的影响。Yazici 等[41]的研究得出类似结论，应用 SM04690 对人膝关节中重度 OA 症状有缓解作用。van den Bosch 等[42]用腺病毒载体在 C57BL/6 小鼠滑膜中过表达 Wnt5a、Wnt8a、Wnt16 及 WISP1，其中过表达 Wnt8a 和 Wnt16 可导致软骨内经典 Wnt 信号传导，经典 Wnt 信号激活可增加蛋白酶活性进而导致软骨损伤，Wnt 信号通路下游蛋白 WISP1 的过表达能加重软骨损伤。用 DKK1 特异性阻断典型 Wnt 信号通路，可减轻 Wnt 信号导致的软骨损伤。上述研究表明，在 OA 状态下软骨中 Wnts 和 Wnt 相关分子表达增加参与了 OA 的发生发展，Wnt 过度激活和不足均可导致软骨降解，抑制 Wnt 信号通路可以减缓 OA 进展、增加软骨厚度、减少软骨细胞凋亡、促进软骨再生。
3.2 Wnt 信号异常对 OA 发生发展中软骨下骨的作用
Meo 等[43]对 HMW 转基因小鼠诱导的 OA 模型研究发现，关节中 DKK1、硬化蛋白（sclerostin，SOST）和 LRP6 的表达降低，Wnt5a、Wnt7b、LRP5、轴抑制蛋白 2（Axin2）、磷酸化的糖原合成激酶 3β（GSK3β）、LEF1 及核内 β-catenin 增加，并发现 FGF-23 中和抗体疗法能够部分改善软骨下骨中的 OA 病理改变，并减少关节中软骨降解和肥大性软骨形成标志物的表达。Chan 等[44]在手术诱导的绵羊和小鼠 OA 模型研究中，发现 Wnt 信号通路抑制剂 SOST 在软骨损伤区域中表达增加，而在与软骨损伤相对应的软骨下骨中表达减少，软骨中 MMP 和 ADAMTS 的表达降低，表明 SOST 通过抑制 Wnt 信号通路抑制了软骨降解，并同时促进了软骨下骨硬化。Martineau 等[45]的研究发现，人 OA 软骨下骨成骨细胞较正常成骨细胞 Wnt5a、骨钙素及 ALP 表达增加，表明 OA 成骨细胞的变化与非经典 Wnt 信号通路的转导有关。Weng 等[46]应用前交叉韧带横断术及胶原酶诱导大鼠膝关节 OA 模型，并用 DKK1 反义寡核苷酸（DKK1-AS）干预，研究结果显示 OA 组与对照组相比软骨下骨骨密度明显下降，软骨出现裂隙及炎症细胞浸润，应用 DKK1-AS 可减轻 OA 相关的软骨及软骨下骨丢失。Funck-Brentano 等[18]对骨组织特异性过表达 DKK 的转基因小鼠行内侧半月板切除术（destabilization of medial meniscus model，DMM）诱导膝关节 OA，发现 OA 状态中的 Wnt 信号活化影响整个关节的稳态，尤其是软骨下骨，结果表明通过过表达 DKK 可使关节国际骨关节炎研究会（OARSI）评分降低及骨赘形成减少，从而延缓 OA 发展。Frzb 和 Sfrp1 是内源性 Wnt 信号调节剂，Thysen 等[47]通过对 Frzb-/- 和 Sfrp1-/- 转基因小鼠行 DMM 术诱导 OA，发现 Frzb-/- 小鼠的胫骨平台 OARSI 评分与同窝野生型小鼠相比显著增高，而 Sfrp1-/- 小鼠与同窝野生型小鼠比较无明显变化；Frzb-/- 小鼠、Sfrp1-/- 小鼠及野生型小鼠与各自假手术组相比，DMM 模型导致软骨下骨厚度明显增加，但在 DMM 模型下，Frzb-/- 小鼠的软骨下骨厚度和同窝野生型小鼠相比无显著差异，相反，Sfrp1-/- 小鼠的软骨下骨厚度与野生型小鼠相比显著降低。结果表明 Frzb 可以调控软骨发育及代谢，Sfrp1 对软骨下骨发育及代谢有调控作用，并为内源性 Wnt 调节剂在 OA 中的关键作用提供了进一步证据。
上述结果表明在 OA 状态下，软骨下骨中 Wnt 信号通过 Frizzled 受体被激活，Wnt 信号激活增加了 β-catenin 活性并进一步促进 MMP 和 ADAMTS 等因子的表达，最终导致软骨基质的降解及软骨下骨硬化。应用内源性或外源性 Wnt 信号通路抑制剂抑制 Wnt 信号通路活性及相关蛋白表达，可以减轻 OA 的病理表现及临床症状。
3.3 Wnt 信号通路调控软骨及软骨下骨间信息交流的分子机制
OA 软骨退变是一种类似于生长板的软骨内骨化过程，关节软骨从静息状态转变为软骨的高转换状态，继而发生软骨不断钙化和钙化软骨不断骨化重塑，可能是导致 OA 发生发展的中心环节[48]。这一环节可能通过 Wnt 信号通路同时影响软骨和软骨下骨的病理改变，从而促进 OA 的进展。经典 Wnt 信号促进成骨细胞分化，这一过程由 Wnt 及其受体拮抗剂 SOST 相互调控，形成一个对机械负荷变化敏感的反馈回路，并依赖于成骨细胞和破骨细胞的活性调节骨重建周期[49]。
Carpintero-Fernandez 等[50]通过共培养体系培养软骨细胞、骨细胞和滑膜细胞，发现这些细胞通过建立缝隙连接直接交换有效的信号分子和代谢产物进行细胞间通讯。Prasadam 等[51]发现用 OA 软骨下骨的成骨细胞与正常软骨细胞共培养，可导致正常软骨细胞内 ADAMTS 及 MMP 表达增加，为软骨下骨及软骨间存在信息交流提供了间接证据。Chen 等[52]通过研究透明质酸钠与海藻酸钠支架联合小檗碱互穿聚合物网络系统对骨软骨修复的影响，发现通过激活 Wnt 信号通路可使软骨下骨得到部分修复，并通过自噬的增强防止软骨退化。Funck-Brentano 等[18]应用骨组织特异性过表达 DKK 的转基因小鼠行 DMM 造成小鼠膝关节 OA，体外实验表明过表达 DKK 小鼠的成骨细胞中 VEGF 表达降低，并且软骨细胞中 MMP 的 mRNA 表达降低，提示成骨细胞通过过表达 DKK 抑制 Wnt 信号通路活性，进而降低 VEGF 表达，最终对软骨细胞起保护作用，表明软骨下骨的成骨细胞可通过调控 Wnt 信号调控软骨细胞功能。Li 等[53]在手术诱导的 OA 小鼠模型中发现，破骨细胞活性与 OARSI 评分成正相关，应用动态膝关节负荷可显著降低 OARSI 评分，并且通过对膝关节进行动态负荷治疗，可完全抑制软骨下骨破骨细胞的骨吸收及骨髓来源的破骨细胞分化，并通过 Wnt 信号转导抑制破骨细胞生成，调节软骨下骨的重塑及软骨基质的降解，从而发挥对软骨的保护作用。
通过对共培养体系培养细胞、特异性过表达 Wnt 信号通路相关分子的转基因动物模型的研究，发现软骨与软骨下骨间存在直接或间接的信息交流，并且在 OA 状态下互相影响。
4 小结与展望
Wnt 信号在生理条件下通过调控软骨细胞、成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞的分化与代谢，影响软骨及软骨下骨的发育。同时，OA 的发生发展及病理改变受到 Wnt 信号通路及其相关配体的调控，也可与其他信号通路及其他关键分子发生关联，联合调控 OA 的发病机制及病理过程。但是，OA 的发生及发展是一个复杂的病理过程，Wnt 信号过度激活和抑制均可影响软骨及软骨下骨稳态，导致 OA 发生。并且在 OA 的不同病理阶段，Wnt 信号的活性及具体作用机制尚未明确，还需更进一步研究。更重要的是，近年研究表明，软骨及软骨下骨间的分子信息交流在 OA 发生发展中可能起到重要作用，为未来的 OA 发病机制研究提供了新思路和方向。因此，基于 Wnt 信号通路活性调控、软骨及软骨下骨间的分子信息交流研究，尤其是明确上述过程中的关键靶点和信号分子，是未来研究中应该着力解决的关键问题。
作者贡献：连强强、迟博婧负责文章撰写；张柳、田发明负责整体文章的观点形成及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的退化性关节疾病之一，也是中老年人致残的主要原因之一[1-2]。结构性 OA 在 50 岁以上人群中女性比男性更常见，且无论男女患病率都会随年龄增长而急剧上升[3]。60 岁以上老年人患病率为 11%，且发病呈年轻化趋势，给社会及家庭造成沉重经济负担[4]。既往对 OA 的定义一直集中在关节软骨的变化，而现在其被认为是一种全关节疾病，伴随软组织及矿化组织的相互作用[5]，包括软骨丢失、骨赘形成，关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊和滑膜改变，最终导致关节功能衰竭[3-5]，其中软骨、软骨下骨及滑膜在 OA 病理改变的发生发展中扮演重要角色[6-7]。多年来国内外学者对 OA 发生发展的分子机制进行了研究，发现与 Wnt/β-catenin、TGF-β、JAK/STAT、NF-κB 等信号通路相关[8-11]，其中 Wnt 信号通路在骨、软骨发育中起到双重作用[12]，通过影响 Wnt 信号通路的活性可以对软骨下骨及关节软骨的代谢造成影响。本文通过整理近年文献，对 Wnt 信号通路在细胞功能调控和 OA 发生发展中其对软骨下骨、关节软骨的具体分子机制进行综述，探讨 Wnt 信号通路对软骨、软骨下骨双靶向调控在 OA 进展中的作用，为探索 OA 的有效治疗药物提供新的思路和靶点。
1 Wnt 信号通路的组成及细胞内调控机制
Wnt 信号通路分为依赖 β-catenin 的经典 Wnt 信号通路和不依赖 β-catenin 的非经典 Wnt 信号通路。见图 1。经典 Wnt 信号通路通过 Wnt 蛋白结合至 Frizzled 和低密度脂蛋白受体相关蛋白 5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[13-14]，通过下游复合体蛋白间的相互作用、构象变化及磷酸化状态的转变增加了 β-catenin 稳定性，从而被激活[14-16]。β-catenin 氨基酸末端磷酸化导致 β-catenin 核转位，并通过核效应因子 T 细胞因子/淋巴增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）转换因子激活下游靶基因的转录[15]，磷酸化的 β-catenin 被 β-转导素重复序列包含蛋白（β-TrCP）识别，经泛素蛋白酶体途径降解。非经典 Wnt 信号通路主要由 Wnt5a 激活，可分为 Wnt/Ca2+和平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）通路。Wnt/Ca2+信号通路通过蛋白激酶 C 和钙调蛋白激酶Ⅱ激活钙信号，并与 T 细胞相关转录因子结合转录，调控细胞骨架重排、细胞黏附和迁移。在 PCP 通路中，Wnt5a 激活 Rho/Rho 相关激酶和 Rac/c-Jun N-末端激酶信号通路，调控细胞中的肌动蛋白聚合[17]。细胞外分泌的 Dickkopf（DKK）蛋白可通过结合 LRP5/6 抑制 β-catenin 核转位，从而阻断 Wnt 信号通路调节细胞功能[16，18]。
图1
Wnt 信号通路传导示意图 a. 经典 Wnt 信号通路；b. 非经典 Wnt 信号通路
注：Dvl：Dishevelled；CK1：酪蛋白激酶 1；P：磷酸化；Ub：泛素；Proteasome：蛋白酶体；APC：腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白；PKC：蛋白激酶 C；TCF：T 细胞因子；CaMKⅡ：钙调蛋白激酶Ⅱ；NFAT：活化 T 细胞核因子；JNK：Jun N 端激酶；Rho：Ras homologous；Rac：Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Figure1. Schematic diagram of the Wnt signaling pathway transduction a. Classic Wnt signaling pathway; b. Non-classical Wnt signaling pathway2 Wnt 信号通路对软骨及软骨下骨发育的调控作用
2.1 对软骨细胞功能和软骨发育的调控作用
关节软骨是一种生理上非自我更新的无血管组织，具有独特的细胞类型——软骨细胞，软骨细胞的功能是产生和维持软骨细胞外基质。Wnt/β-catenin 信号通路是骨、软骨和关节发育及内稳态的关键调节器，它在许多生物学过程中发挥着重要作用，包括间充质细胞的凝聚和分化、成熟关节软骨表型的维持、软骨内成骨过程中肥厚组织的成熟等[19]。
Wnt 信号通路除了在软骨形成和软骨细胞成熟过程中发挥作用外，还参与维持完全分化的软骨细胞表型，因此可能在维持整个成年期的软骨稳态中发挥重要作用[20]。Chen 等[21]通过研究 Wnt 家族 mRNA 及蛋白在 C57BL/6 小鼠出生前及出生后下颌骨髁突软骨中的表达，发现在胚胎时期，Wnt9a 主要见于增生性和矿化性肥大软骨细胞，并在分化软骨细胞及未分化软骨细胞的细胞核中可见明显的 Lef1 表达；而在出生后阶段，肥厚和矿化的软骨细胞中 Wnt4a 表达逐渐降低。结果表明 Wnt 信号通路在不同时期可调控下颌髁突软骨细胞功能，并与软骨的发育状况息息相关。Zhang 等[22]研究发现，软骨细胞可经 Wnt/β-catenin 信号通路产生一种基质蛋白——富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine-rich protein 61，CCN1），在体外分离的胸骨软骨细胞、胚胎软骨和出生后软骨中均发现 β-catenin 信号转导可以增加 CCN1 表达并促进软骨细胞的成熟，而且过表达 CCN1 的转基因小鼠成年后出现发育异常和软骨变性。Huang 等[23]利用 Wnt 信号阻断剂 PKF118-310 和激动剂 6-溴联苯-3’-氧基（BIO）观察人 MSCs 的成软骨分化，随后建立球粒培养体系，进行 5 周的三维软骨分化。结果显示激活经典 Wnt 信号通路显著下调了软骨特异性基因 SRY-box 转录因子 9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）、Ⅱ型胶原 α1 链（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13 的表达，但增加了含凝血酶敏感素基序的整合素和金属蛋白酶 4、5（a sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4、5，ADAMTS-4、5）的表达；PKF118-310 对 Wnt 信号的抑制增加了 SOX9、COL2A1、AGG 和 MMP-9 的表达，但降低了 MMP-13 和 ADAMTS-4、5 的表达，表明 Wnt 信号的过表达或过抑制在一定程度上都会对软骨细胞分化产生影响。上述研究表明，生理状态下 Wnt 信号通路通过上调或下调关键分子表达，调控 MSCs 向软骨细胞方向分化、促进软骨细胞成熟、维持软骨细胞表型，并通过减少 MMP-1、3、9、13 的表达维持软骨的正常结构及生理功能。
2.2 对成骨细胞、破骨细胞及骨细胞功能和软骨下骨内环境稳态的调控作用
Wnt/β-catenin 信号通路在调控成骨细胞、破骨细胞及骨细胞的功能中发挥重要作用，并影响骨骼发育和内稳态，异常的 Wnt 信号可导致骨骼缺陷等疾病[24]。Yang 等[25]研究表明，BMSCs 通过 Wnt5a/Ror2 信号对破骨细胞的迁移与分化起到重要作用，并导致骨量减少，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞增加，最终表现为软骨下小梁骨丢失。Esen 等[26]研究发现，mTORC2-AKT 信号下游 Rac1 可调节 LRP5，并通过在体外实验中抑制 Wnt3a 诱导的代谢酶类表达影响成骨细胞分化，体内实验中敲除小鼠 LRP5 可致出生后骨量减少，表明了 Wnt 信号通路在调控成骨细胞分化与代谢方面有潜在作用。Heilmann 等[27]研究发现，非经典 Wnt 信号可通过 Frizzled 家族 Fzd9 受体调控成骨细胞，并正向促进膜内和软骨内的骨形成，而不参与软骨形成或破骨细胞对矿化基质的降解，表明 Wnt 信号通路在促进 BMSCs 成骨分化中具有重要作用，并且 Wnt 信号通路参与膜内成骨和软骨内成骨[28]。Zhang 等[29]研究发现，Wnt/β-catenin 信号活跃在各种成骨细胞或成骨细胞前体细胞系中，包括 MC3T3-E1、2T3、C2C12 及 C3H10T1/2 细胞系；此外，Wnt 信号通过与 BMP 通路的交联，影响 BMP 信号活性、成骨细胞分化和骨形成。成骨细胞内 Wnt 信号通路变化可引起骨量变化，成骨细胞来源的 Wnt5a 可以通过激活 Ror2 受体促进破骨细胞分化，正常的破骨细胞分化需要 β-catenin 的动态调节，表明 Wnt 配体在成骨过程中可能具有阶段性的特异性作用[30]。Roberts 等[31]应用条件性敲除成熟破骨细胞中 Wnt5a 的组织蛋白酶 K-cre（Ctsk-cre）小鼠进行研究，发现这些小鼠小梁骨和皮质骨减少，并且该低骨量表型并非破骨细胞介导的骨吸收增加，而是骨形成减少，表明破骨细胞来源的 Wnt5a 对维持骨内平衡有重要影响。Alam 等[32]用骨细胞中过表达人 Wnt16 的转基因小鼠进行研究，发现转基因小鼠骨形态计量学参数、骨密度及皮质骨厚度均显著高于野生型小鼠，表明 Wnt16 通过对骨细胞的调控，在皮质骨和小梁骨的质量和强度方面起着关键作用。
上述研究表明经典 Wnt 信号通路可激活成骨细胞活性，促进成骨细胞分化和膜内及软骨内的骨形成，并在骨量调节中起到关键作用，而不同来源的 Wnt5a 信号通路可促进破骨细胞分化及调控骨形成，不仅对破骨细胞形成有重要调控作用，还能维持正常骨量。因此，Wnt/β-catenin 信号通路对成骨细胞、破骨细胞及骨细胞功能调控的同时，维持了软骨及软骨下骨内环境稳态。
3 Wnt 信号通路在 OA 状态下对软骨及软骨下骨的影响
3.1 Wnt 信号异常对 OA 发生发展中软骨的作用
OA 关节的病理变化包括关节软骨退化、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症、韧带退化、膝关节半月板及关节囊肥大，这些病理改变导致 OA 或 OA 症状的发生[33]。OA 状态下基质蛋白和基质降解酶类的产生增加，软骨细胞稳态失衡，基质重塑及异常的肥大样成熟，导致软骨钙化。在 OA 中基质降解酶类包括聚集蛋白聚糖酶、胶原酶、MMP 家族成员以及多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。OA 早期的基质降解起因是可降解 AGG 的 MMP-3 和 ADAMTS-5 表达增加，随后是分解胶原的酶活性增加，尤其是 MMP-13，可高效降解Ⅱ型胶原蛋白，一旦胶原蛋白网络被降解，这种改变无法逆转[34]。
软骨细胞表达多种 Wnt 信号家族成员，Wnt 信号过度激活与 OA 严重程度成正相关。Hou 等[35]发现在 OA 软骨和 IL-1β 刺激的软骨细胞中 Wnt3a 表达增强，并且 Wnt3a 的过表达降低了软骨基质分子Ⅱ型胶原和 AGG 的表达，并增加了 MMP-13 和 ADAMTS-4 的表达。Liu 等[36]在 IL-1β 诱导的软骨 OA 模型中研究发现，软骨细胞中 β-catenin、Runx2 及 Wnt5a 的表达增加。Nalesso 等[37]研究发现，Wnt16 缺陷小鼠表现出更严重的 OA，表现为润滑素表达降低和软骨细胞凋亡增加，并且 Wnt16 降低了 Wnt3a 激活经典 Wnt 信号通路的能力。Monteagudo 等[38]研究发现，Wnt 信号通路被过度激活时会导致 OA，DOT1L（一种参与组蛋白甲基化的酶）通过抑制 Wnt 信号通路保护软骨，而 DOT1L 缺失破坏了体外正常的软骨细胞分子特征，并导致小鼠 OA。Klotho 是一种 Wnt/β-catenin 信号转导的内源性拮抗剂，Gu 等[39]研究发现与正常小鼠相比，OA 小鼠中 Klotho 表达显著降低，Wnt/β-catenin 的活性及其靶基因表达上调。在 OA 软骨中，Klotho 表达降低可激活 Wnt/β-catenin 信号转导，从而诱发软骨损伤。Deshmukh 等[40]研究发现应用新型小分子 Wnt 信号通路抑制剂 SM04690，可使人 BMSCs 分化为成熟有功能的软骨细胞，并使软骨分解代谢标志物水平降低，并且在啮齿类 OA 模型关节内注射 SM04690，可使软骨厚度增加，并观察到软骨再生，降低 MMP-1、3、13 和 ADAMTS-5 的表达，保护软骨免受分解代谢的影响。Yazici 等[41]的研究得出类似结论，应用 SM04690 对人膝关节中重度 OA 症状有缓解作用。van den Bosch 等[42]用腺病毒载体在 C57BL/6 小鼠滑膜中过表达 Wnt5a、Wnt8a、Wnt16 及 WISP1，其中过表达 Wnt8a 和 Wnt16 可导致软骨内经典 Wnt 信号传导，经典 Wnt 信号激活可增加蛋白酶活性进而导致软骨损伤，Wnt 信号通路下游蛋白 WISP1 的过表达能加重软骨损伤。用 DKK1 特异性阻断典型 Wnt 信号通路，可减轻 Wnt 信号导致的软骨损伤。上述研究表明，在 OA 状态下软骨中 Wnts 和 Wnt 相关分子表达增加参与了 OA 的发生发展，Wnt 过度激活和不足均可导致软骨降解，抑制 Wnt 信号通路可以减缓 OA 进展、增加软骨厚度、减少软骨细胞凋亡、促进软骨再生。
3.2 Wnt 信号异常对 OA 发生发展中软骨下骨的作用
Meo 等[43]对 HMW 转基因小鼠诱导的 OA 模型研究发现，关节中 DKK1、硬化蛋白（sclerostin，SOST）和 LRP6 的表达降低，Wnt5a、Wnt7b、LRP5、轴抑制蛋白 2（Axin2）、磷酸化的糖原合成激酶 3β（GSK3β）、LEF1 及核内 β-catenin 增加，并发现 FGF-23 中和抗体疗法能够部分改善软骨下骨中的 OA 病理改变，并减少关节中软骨降解和肥大性软骨形成标志物的表达。Chan 等[44]在手术诱导的绵羊和小鼠 OA 模型研究中，发现 Wnt 信号通路抑制剂 SOST 在软骨损伤区域中表达增加，而在与软骨损伤相对应的软骨下骨中表达减少，软骨中 MMP 和 ADAMTS 的表达降低，表明 SOST 通过抑制 Wnt 信号通路抑制了软骨降解，并同时促进了软骨下骨硬化。Martineau 等[45]的研究发现，人 OA 软骨下骨成骨细胞较正常成骨细胞 Wnt5a、骨钙素及 ALP 表达增加，表明 OA 成骨细胞的变化与非经典 Wnt 信号通路的转导有关。Weng 等[46]应用前交叉韧带横断术及胶原酶诱导大鼠膝关节 OA 模型，并用 DKK1 反义寡核苷酸（DKK1-AS）干预，研究结果显示 OA 组与对照组相比软骨下骨骨密度明显下降，软骨出现裂隙及炎症细胞浸润，应用 DKK1-AS 可减轻 OA 相关的软骨及软骨下骨丢失。Funck-Brentano 等[18]对骨组织特异性过表达 DKK 的转基因小鼠行内侧半月板切除术（destabilization of medial meniscus model，DMM）诱导膝关节 OA，发现 OA 状态中的 Wnt 信号活化影响整个关节的稳态，尤其是软骨下骨，结果表明通过过表达 DKK 可使关节国际骨关节炎研究会（OARSI）评分降低及骨赘形成减少，从而延缓 OA 发展。Frzb 和 Sfrp1 是内源性 Wnt 信号调节剂，Thysen 等[47]通过对 Frzb-/- 和 Sfrp1-/- 转基因小鼠行 DMM 术诱导 OA，发现 Frzb-/- 小鼠的胫骨平台 OARSI 评分与同窝野生型小鼠相比显著增高，而 Sfrp1-/- 小鼠与同窝野生型小鼠比较无明显变化；Frzb-/- 小鼠、Sfrp1-/- 小鼠及野生型小鼠与各自假手术组相比，DMM 模型导致软骨下骨厚度明显增加，但在 DMM 模型下，Frzb-/- 小鼠的软骨下骨厚度和同窝野生型小鼠相比无显著差异，相反，Sfrp1-/- 小鼠的软骨下骨厚度与野生型小鼠相比显著降低。结果表明 Frzb 可以调控软骨发育及代谢，Sfrp1 对软骨下骨发育及代谢有调控作用，并为内源性 Wnt 调节剂在 OA 中的关键作用提供了进一步证据。
上述结果表明在 OA 状态下，软骨下骨中 Wnt 信号通过 Frizzled 受体被激活，Wnt 信号激活增加了 β-catenin 活性并进一步促进 MMP 和 ADAMTS 等因子的表达，最终导致软骨基质的降解及软骨下骨硬化。应用内源性或外源性 Wnt 信号通路抑制剂抑制 Wnt 信号通路活性及相关蛋白表达，可以减轻 OA 的病理表现及临床症状。
3.3 Wnt 信号通路调控软骨及软骨下骨间信息交流的分子机制
OA 软骨退变是一种类似于生长板的软骨内骨化过程，关节软骨从静息状态转变为软骨的高转换状态，继而发生软骨不断钙化和钙化软骨不断骨化重塑，可能是导致 OA 发生发展的中心环节[48]。这一环节可能通过 Wnt 信号通路同时影响软骨和软骨下骨的病理改变，从而促进 OA 的进展。经典 Wnt 信号促进成骨细胞分化，这一过程由 Wnt 及其受体拮抗剂 SOST 相互调控，形成一个对机械负荷变化敏感的反馈回路，并依赖于成骨细胞和破骨细胞的活性调节骨重建周期[49]。
Carpintero-Fernandez 等[50]通过共培养体系培养软骨细胞、骨细胞和滑膜细胞，发现这些细胞通过建立缝隙连接直接交换有效的信号分子和代谢产物进行细胞间通讯。Prasadam 等[51]发现用 OA 软骨下骨的成骨细胞与正常软骨细胞共培养，可导致正常软骨细胞内 ADAMTS 及 MMP 表达增加，为软骨下骨及软骨间存在信息交流提供了间接证据。Chen 等[52]通过研究透明质酸钠与海藻酸钠支架联合小檗碱互穿聚合物网络系统对骨软骨修复的影响，发现通过激活 Wnt 信号通路可使软骨下骨得到部分修复，并通过自噬的增强防止软骨退化。Funck-Brentano 等[18]应用骨组织特异性过表达 DKK 的转基因小鼠行 DMM 造成小鼠膝关节 OA，体外实验表明过表达 DKK 小鼠的成骨细胞中 VEGF 表达降低，并且软骨细胞中 MMP 的 mRNA 表达降低，提示成骨细胞通过过表达 DKK 抑制 Wnt 信号通路活性，进而降低 VEGF 表达，最终对软骨细胞起保护作用，表明软骨下骨的成骨细胞可通过调控 Wnt 信号调控软骨细胞功能。Li 等[53]在手术诱导的 OA 小鼠模型中发现，破骨细胞活性与 OARSI 评分成正相关，应用动态膝关节负荷可显著降低 OARSI 评分，并且通过对膝关节进行动态负荷治疗，可完全抑制软骨下骨破骨细胞的骨吸收及骨髓来源的破骨细胞分化，并通过 Wnt 信号转导抑制破骨细胞生成，调节软骨下骨的重塑及软骨基质的降解，从而发挥对软骨的保护作用。
通过对共培养体系培养细胞、特异性过表达 Wnt 信号通路相关分子的转基因动物模型的研究，发现软骨与软骨下骨间存在直接或间接的信息交流，并且在 OA 状态下互相影响。
4 小结与展望
Wnt 信号在生理条件下通过调控软骨细胞、成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞的分化与代谢，影响软骨及软骨下骨的发育。同时，OA 的发生发展及病理改变受到 Wnt 信号通路及其相关配体的调控，也可与其他信号通路及其他关键分子发生关联，联合调控 OA 的发病机制及病理过程。但是，OA 的发生及发展是一个复杂的病理过程，Wnt 信号过度激活和抑制均可影响软骨及软骨下骨稳态，导致 OA 发生。并且在 OA 的不同病理阶段，Wnt 信号的活性及具体作用机制尚未明确，还需更进一步研究。更重要的是，近年研究表明，软骨及软骨下骨间的分子信息交流在 OA 发生发展中可能起到重要作用，为未来的 OA 发病机制研究提供了新思路和方向。因此，基于 Wnt 信号通路活性调控、软骨及软骨下骨间的分子信息交流研究，尤其是明确上述过程中的关键靶点和信号分子，是未来研究中应该着力解决的关键问题。
作者贡献：连强强、迟博婧负责文章撰写；张柳、田发明负责整体文章的观点形成及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点。
