引用本文： 许刚, 张长春, 朱坤, 叶雨辰, 鲍正齐. 慢病毒介导的 IGF-1 与 PDGF 基因对人退变椎间盘髓核组织的影响. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(7): 907-914. doi: 10.7507/1002-1892.201910101 复制
腰椎间盘退变性疾病是引起腰腿痛的主要原因，严重影响人们日常生活。研究发现，退变的椎间盘组织内髓核细胞大量凋亡并且功能下降，表现为水分及糖蛋白、Ⅱ型胶原蛋白等细胞外基质合成减少[1-2]。目前对于椎间盘退变性疾病的临床治疗，无论是保守治疗、开放手术还是微创手术，都仅仅从改善临床症状入手，并未着眼于椎间盘本身的病理变化，故治疗效果往往有限[3-5]。本实验从髓核入手，通过多种实验方法比较退变与正常髓核组织在细胞形态、生化成分等方面的不同，并利用基因工程技术将 IGF-1 和 PDGF 基因转染至退变的髓核细胞，就两种细胞因子如何逆转髓核的退变作深入研究。
1 材料与方法
1.1 研究标本
退变髓核组织（退变组）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因腰椎间盘退变突出需行髓核摘除术的 15 例患者，其中男 10 例，女 5 例；年龄 48～76 岁，平均 62.8 岁。纳入标准：MRI 示腰椎间盘严重退变，不合并黄韧带、后纵韧带钙化者；不合并腰椎感染、肿瘤及其他严重躯体疾病者。
正常髓核组织（正常组）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因外伤致腰椎爆裂性骨折需行椎间盘髓核摘除术的 15 例患者，其中男 9 例，女 6 例；年龄 16～38 岁，平均 23.4 岁。纳入标准：年龄<40 岁；无脊柱外伤及脊柱手术病史；术前影像学检查无腰椎间盘退变及其他病变者。
1.2 主要试剂及仪器
H-DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）；澳洲血源 FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白抗体一抗，山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 二抗，山羊抗小鼠二抗免疫组织化学试剂盒，兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，FITC 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（Chemicon 公司，美国）；小鼠抗人 B 淋巴细胞瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体一抗、小鼠抗人 Bcl-2 相关 X（Bcl-2 associate X，Bax）抗体一抗、浓缩型 DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Western blot 及 IP 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；预染蛋白 Marker（Fermentas 公司，立陶宛）；聚偏二氟乙烯（poluvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美国）；抗 β-actin 抗体（Sigma 公司，美国）。CO2 恒温细胞培养箱（SANYO 公司，日本）；倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）；流式细胞仪（Beckman 公司，美国）。
1.3 正常和退变髓核细胞学观察
1.3.1 HE 染色观察
取部分退变组及正常组髓核组织，经漂洗、乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（片厚 5 μm）、贴片处理后，常规行 HE 染色观察。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
取上述部分切片行Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Bcl-2、Bax 免疫组织化学染色。主要步骤：先将切片脱蜡、乙醇水化后，进行抗原修复，阻断过氧化物酶活性；然后依次滴加一抗（小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白及 Bcl-2、Bax 单克隆抗体）、山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 二抗；最后 DAB 溶液显色，中性树胶盖玻片封闭。倒置显微镜下观察，Ⅰ、Ⅱ型胶原及 Bcl-2、Bax 阳性结果为髓核细胞质内可见棕黄色颗粒状阳性产物。每个样本随机观察 10 个高倍（×400）视野并计数阳性细胞数和总细胞数，计算各蛋白阳性细胞百分比。
1.3.3 髓核细胞形态观察
取部分退变组及正常组髓核组织，分别用 75%乙醇浸泡消毒、PBS 冲洗后，组织剪除周围肌肉韧带，眼科剪剪去周围纤维环组织，并将髓核剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小；再将髓核组织消化、离心（半径 6 cm、1 000 r/min 离心 5 min）后，在含 15%FBS 的 H-DMEM 培养基上进行原代和传代培养，倒置显微镜下观察髓核细胞形态。
1.3.4 Western blot 检测
取两组髓核细胞，根据 Western blot 检测试剂盒说明进行总蛋白提取、蛋白定量、Ⅱ型胶原及内参 β-actin 蛋白电泳、转膜、封闭和孵育、PVDF 膜化学发光、显影及定影。显影条带使用 Image-Pro Plus 软件分析并扫描条带吸光度（A）值，以目的条带与 β-actin 的 A 值比值作为各蛋白相对表达量。
1.4 基因转染退变髓核细胞相关研究
1.4.1 实验分组及基因转染
利用慢病毒载体系统构建 IGF-1 基因慢病毒颗粒、PDGF 基因慢病毒颗粒及携带 IGF-1 和 PDGF 双基因的慢病毒颗粒（IGF-1-P2A-PDGF）。实验分为 4 组，A 组为退变髓核细胞对照组；B、C、D 组分别用 IGF-1、PDGF 和 IGF-1-P2A-PDGF 基因慢病毒颗粒转染退变髓核细胞。具体转染方法：分别将 0.2 μg 上述基因慢病毒质粒稀释到 25 μL Reduced Serum Medium（一种可减少血清补充的改良培养基）中，另将 0.5 μL Lipofectamin2000 稀释到 25 μL Reduced Serum Medium 中，将两种溶液轻轻混匀后静置，再分别加入 4 组细胞培养孔中培养。
1.4.2 细胞形态观察
转染后 21 d 取出各组细胞，胰蛋白酶消化后离心（半径 6 cm、1 000 r/min、离心 5 min），收集沉淀细胞，PBS 清洗后取其中一部分加入含有 H-DMEM 培养基的细胞培养瓶中进行传代培养，倒置显微镜下观察转染后各组细胞形态变化。剩余部分调整为浓度 1×106个/mL 的细胞悬液进行后续实验。
1.4.3 流式细胞仪检测
将各组细胞悬液分别加入兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，室温孵育 30 min；PBS 洗 2 次，加入 FITC 标记的山羊抗兔 IgG 二抗，避光孵育 15 min；PBS 洗 2 次，混匀后上流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1、PDGF 阳性率。实验重复 6 次取均值。
1.4.4 免疫组织化学染色观察
转染后 21 d 取出各组细胞分别放在 6 孔板内爬片，多聚甲醛固定，3%H2O2 室温孵育 15 min；0.2%Triton X-100 溶液透化固定后的细胞，山羊血清封闭，室温孵育 10 min；加入小鼠抗人Ⅱ型胶原抗体，4℃ 孵育过夜，再加山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 15 min；滴加 DAB 显色液，封片，倒置荧光显微镜下观察。
1.4.5 Western blot 检测
同 1.3.4 方法检测各组细胞Ⅱ型胶原蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和退变髓核细胞学观察
2.1.1 髓核细胞形态观察
正常组培养 24 h 后有髓核细胞贴壁，初贴壁细胞呈圆形或椭圆形，部分伸出伪足，似扇形；然后贴壁细胞不断增多，72 h 后细胞无明显增多，逐渐伸展为梭形或多角形，呈极性排列；传代后髓核细胞贴壁速度加快，2 h 后可见细胞排列紧密，铺满瓶底，呈长梭形或多角形，放射状或铺路石样外观。退变组髓核细胞随培养时间延长，形态逐渐变得极不规则且排列较疏松，胞体变长，细胞质内出现发亮的颗粒状物及空泡，并出现凋亡细胞。见图 1。
图1
退变组和正常组髓核细胞形态观察（倒置显微镜×200）
a. 培养 72 h 的退变髓核细胞（黄箭头示凋亡的髓核细胞，红箭头示细胞质内发亮的颗粒状物及空泡）；b. 培养 24 h 的正常髓核细胞；c. 培养 72 h 的正常髓核细胞；d. 第 2 代正常髓核细胞
Figure1. Morphological observation of NPCs in degeneration group and normal group (Inverted microscope×200)a. The degenerated NPCs cultured for 72 hours (Yellow arrow indicated the apoptotic NPCs, red arrow indicated the shiny granules and vacuoles in the cytoplasm); b. Normal NPCs cultured for 24 hours; c. Normal NPCs cultured for 72 hours; d. The 2nd generation of normal NPCs
2.1.2 HE 染色观察
退变组髓核细胞逐渐减少，髓核组织内可见大量纤维软骨组织；正常组中央髓核组织可见大量脊索细胞和少量类软骨细胞。见图 2。
图2
退变组和正常组 HE 染色观察
从左至右依次为×100、×400 a. 退变组 箭头示纤维软骨细胞；b. 正常组 箭头示脊索细胞
Figure2. HE staining observation in degeneration group and normal groupFrom left to right for ×100 and ×400, respectively a. Degeneration group Arrow indicated fibrochondrocytes; b. Normal group Arrow indicated notochord cells
2.1.3 免疫组织化学染色观察
退变组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白呈强阳性染色，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白呈弱阳性染色；而正常组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白呈弱阳性染色，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白呈强阳性染色。见图 3。退变组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白阳性细胞百分比显著高于正常组，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白阳性细胞百分比显著低于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
退变组与正常组髓核组织各蛋白阳性细胞百分比（n=15，
，%）
Table1.
Percentage of protein-positive cells in the NP tissue of the degeneration group and the normal group (n=15, 
, %)
图3
退变组和正常组髓核组织免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×400）
从左至右依次为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Bcl-2、Bax 蛋白a. 退变组；b. 正常组
Figure3. Immunohistochemical staining observation of NP tissue in degeneration group and normal group (Inverted microscope×400)From left to right for collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, Bcl-2, and Bax proteins, respectively a. Degeneration group; b. Normal group
2.1.4 Western blot 检测
两组在相对分子质量为 130×103附近均出现了蛋白条带，提示两组细胞均能表达Ⅱ型胶原蛋白。见图 4。退变组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量为 0.157 5±0.026 1，与正常组 0.870 3±0.033 1 比较差异有统计学意义（t=65.493，P=0.000）。
图4
Western blot 检测两组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：退变组 2：正常组
Figure4. Collagen type Ⅱ expression of the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Degeneration group 2: Normal group
2.2 基因转染退变髓核细胞相关研究
2.2.1 细胞形态观察
A 组细胞排列疏松且不规则，细胞质内出现发亮的颗粒状物及空泡，并出现大量凋亡细胞。转染后 21 d，B、C、D 组细胞经传代后形态变得较为规则，细胞质内发亮的颗粒状物及空泡消失，凋亡细胞明显减少，提示细胞活力已明显提高。B、C 组细胞形态差别不大，但 C 组细胞密度更大；D 组细胞形态最为规则，细胞密度最大且呈极性排列。见图 5。
图5
转染后 21 d 各组细胞形态观察（倒置显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure5. Cell morphology observation in each group at 21 days after transfection (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 流式细胞仪检测
与 A、C 组比较，B、D 组 IGF-1 阳性率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间 IGF-1 阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。与 A、B 组比较，C、D 组 PDGF 阳性率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间及 C、D 组间 PDGF 阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。见图 6，表 2。
表2
转染后 21 d 流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1 和 PDGF 阳性率（n=6，
，%）
Table2.
Percentages of IGF-1- and PDGF-positive cells detected by flow cytometry in each group at 21 days after transfection (n=6, 
, %)
图6
转染后 21 d 流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1、PDGF 阳性率
从左至右分别为 A、B、C、D 组 a. IGF-1；b. PDGF
Figure6. IGF-1 and PDGF positive rates detected by flow cytometry at 21 days after transfectionFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. IGF-1; b. PDGF
2.2.3 免疫组织化学染色观察
A、B、C、D 组Ⅱ型胶原蛋白阳性染色情况依次为（±）、（+）、（+）、（++）。A 组仅有很少一部分细胞呈淡棕色；B、C 组大多数细胞呈棕色；D 组细胞全部染色，且大部分为深棕色。见图 7。
图7
转染后 21 d 各组细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure7. Immunohistochemical staining observation in each group at 21 days after transfection (Inverted fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Western blot 检测
各组在相对分子质量为 130×103附近均出现了蛋白条带，提示各组细胞均能表达Ⅱ型胶原蛋白。见图 8。A、B、C、D 组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量分别为 0.141 8±0.012 9、0.334 6±0.029 5、0.415 2±0.032 9、0.530 9±0.028 4，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
图8
Western blot 检测各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure8. Collagen type Ⅱ protein expression of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
3.1 髓核的结构功能及椎间盘的退变过程
椎间盘是连接上下椎体的生物结构，由内层的髓核、外层的纤维环及上下软骨终板构成，其中纤维环主要由成纤维细胞及其合成的Ⅰ型胶原蛋白构成，而髓核是由类软骨细胞及其合成的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖构成[3]。髓核组织是一种弹性胶冻状无定型物质，具有吸收震荡、平衡应力的作用。椎间盘退变的过程十分复杂，在人们日常工作劳动中，椎间盘要承受垂直压力、旋转剪切力等多种应力，使得椎间盘细胞长期处于高压环境中，再加上低氧、低营养、高渗透压的内环境因素，使得椎间盘细胞极易发生退变。需要指出的是，椎间盘细胞的退变并不代表椎间盘退变，椎间盘细胞退变、凋亡都是正常生理过程，当以上这些损伤因素加快了细胞的退变，使得椎间盘细胞合成、增殖速度代偿不了细胞退变凋亡速度时，椎间盘才会发生退变。而椎间盘退变主要表现为髓核细胞凋亡和细胞活力下降，包括蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白等细胞外基质合成减少，髓核内水分含量下降，髓核组织变硬，髓核细胞从类软骨细胞变为类纤维细胞，而这些病理改变与腰椎间盘突出、腰椎管狭窄、腰椎滑脱等腰椎退行性疾病密切相关[4-6]。
3.2 椎间盘退变的再生组织工程
由于腰椎承受应力大，活动度高，故椎间盘退变大多发生在腰椎[7]。以往的手术治疗方法都是摘除退变的椎间盘，或者椎间植骨融合钉棒固定，但手术不仅创伤大，而且破坏了脊柱的结构和力学平衡，容易引起邻近节段退变，所以越来越多学者着眼于椎间盘细胞再生的组织工程研究。Naqvi 等[8]首先提取骨髓基质细胞，体外进行“微胶囊化”，在低温保存前与 TGF-β3 共培养 14 d，然后将这种微胶囊注射入牛退变的椎间盘髓核中，发现牛退变的椎间盘髓核细胞发生了逆转，产生了大量糖胺聚糖及胶原蛋白等细胞外基质成分，并且该方法比不进行“微胶囊化”而直接将 TGF-β3 诱导的骨髓基质细胞注射入牛髓核组织内，会产生更多的细胞外基质，说明“微胶囊化”能够有效避免外源细胞在体内的分解。Ishiguro 等[9]开发了一种脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）衍生的无支架组织工程构建物（tissue-engineered construct，TEC），并将 ADSC-TEC 植入髓核摘除术后的大鼠椎间盘内，获得了良好效果。Tao 等[10]提取并培养了髓核 MSCs，并将其在体外高渗透压环境下与髓核细胞共培养，发现髓核 MSCs 增殖能力强大，并且能促进蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白的合成。
3.3 基因工程技术
通过基因治疗椎间盘退变性疾病也是目前研究的热点，主要方法是通过病毒或非病毒载体携带外源性基因转染到退变椎间盘细胞中进行人工干预，达到治疗目的。Farhang 等[11]从手术室获取人退变椎间盘髓核细胞，再将慢病毒介导的规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）表观基因转染至髓核细胞并监测信号通路，发现重组细胞内 Cas9 蛋白失活，1 型 TNF 受体/1 型 IL1 受体信号转导中断，TNF-α 及 IL-1β 表达下调，退变的椎间盘得到修复。雷涛等[12]建立兔椎间盘退变模型，再将携带 BMP-2 及分化抑制因子 1（inhibitor 1 of differentiation，Id1）基因转染至兔退变椎间盘髓核细胞内，发现 BMP-2 和 Id1 基因可稳定表达相应的蛋白并增加细胞外基质的表达，抑制椎间盘的退变。基因转染过程中的载体包括非病毒载体和病毒载体，非病毒载体主要是细菌质粒，由于其转染效率很低，几乎很少使用；而病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒及慢病毒载体等，慢病毒载体相比其他病毒载体具有基因容量大、转染率高、能够整合到宿主细胞染色体基因组中长期稳定表达等优势[13-14]。本实验对椎间盘退变的研究已转向再生医学和基因治疗领域。直接向细胞注射生长因子促进细胞再生的方法，因生长因子半衰期太短，而椎间盘退变又是长期慢性过程，故局限性很大[15]。而基因治疗的出现打破了桎梏。本实验利用慢病毒作为载体，将外源性 IGF-1 和 PDGF 基因通过基因酶的切割、聚合，整合到退变髓核细胞的细胞核 DNA 基因组中，随着细胞分裂、DNA 复制，子代细胞长期稳定地表达这两种外源性蛋白。腺病毒等其他病毒载体只能将外源性基因整合到宿主的细胞质 DNA 中，故蛋白表达长久性不如慢病毒[13-14]。虽然研究表明慢病毒免疫原性很低[16]，但应用于临床治疗，大量病毒进入人体是否会引起毒性反应、病毒是否会变异等问题仍有待考证。
3.4 IGF-1 和 PDGF 的生物效应
IGF-1 是一种多功能细胞调控因子，化学结构是活性多肽，在人体中广泛存在，主要通过内分泌、自分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，具有提高细胞生物活性、促进分裂增殖、抑制细胞凋亡的作用[17]。An 等[18]通过体外培养鼠椎间盘细胞，发现维生素 D 能促进椎间盘细胞分裂增殖，有效预防椎间盘退变，究其原因是维生素 D 能提高椎间盘细胞 IGF-1 含量。李大鹏等[19]体外培养人退变椎间盘髓核细胞，然后用 IGF-1 刺激这些细胞，发现细胞合成的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白大量增加，进一步研究发现是由于 IGF-1 能够激活 P13K/Akt 信号通路。Zhang 等[20]利用腺病毒载体将 IGF-1 基因转染至家兔退变的腰椎间盘髓核细胞中，结果退变髓核细胞的凋亡率明显下降，证实 IGF-1 具有抑制髓核细胞凋亡的作用。
PDGF 也是一种活性多肽分子，且在人体内含量极少，甚至常规测量仪器难以检测出，但其作用广泛而强大。与 IGF-1 类似，PDGF 对于椎间盘细胞的作用是促进细胞增殖分裂，显著抑制细胞凋亡，同时也促进细胞外基质的合成。与 IGF-1 不同的是，PDGF 的作用更强大，并且它是一种促有丝分裂原，最主要的作用是促进细胞增殖分裂，抑制凋亡[21]。PDGF 与椎间盘细胞结合后，能激活磷脂酶 C，促进肌醇二磷酸和二酰基甘油的合成，提高细胞内 Ca2+ 浓度，促使椎间盘细胞从 G0/G1 期进入 S 期，按照碱基配对原则合成 DNA 新链，最后进入 G2 期完成有丝分裂[22]。Presciutti 等[21]体外培养人退变的椎间盘细胞，再将 PDGF 加入培养基中，发现 PDGF 能够显著抑制椎间盘细胞的凋亡，刺激其分裂增殖。Kuo 等[23]分别制作大鼠体内和体外椎间盘细胞退变模型，用 IGF-1 联合 PDGF 对退变的细胞进行人工干预，结果细胞凋亡被强烈抑制，得出 IGF-1 和 PDGF 有望应用于临床治疗椎间盘退变类疾病的结论。
本实验成功将外源性 IGF-1、PDGF 基因转染至体外培养的退变椎间盘细胞中，结果显示二者具有逆转椎间盘退变的生物效应；PDGF 促进细胞增殖、Ⅱ型胶原蛋白合成的作用稍强于 IGF-1，且 IGF-1 和 PDGF 共同作用效果更强。由于体内髓核细胞所处的环境和压力与体外完全不同，故 IGF-1 和 PDGF 对体内退变的髓核细胞能否达到与体外一样的作用，尚需进一步实验证实。
综上述，IGF-1、PDGF 均能促进髓核细胞增殖，抑制其凋亡；IGF-1、PDGF 还能促进髓核细胞的细胞外基质（Ⅱ型胶原蛋白）分泌，二者具有协同作用。
作者贡献：许刚负责实验设计及实施，起草文章；张长春参与实验设计、指导实验实施过程；朱坤参与实验设计，参与论文撰写并负责实验数据的收集及统计学分析；叶雨辰参与实验实施；鲍正齐对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经蚌埠医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（BYYFY-2018KY24）。
腰椎间盘退变性疾病是引起腰腿痛的主要原因，严重影响人们日常生活。研究发现，退变的椎间盘组织内髓核细胞大量凋亡并且功能下降，表现为水分及糖蛋白、Ⅱ型胶原蛋白等细胞外基质合成减少[1-2]。目前对于椎间盘退变性疾病的临床治疗，无论是保守治疗、开放手术还是微创手术，都仅仅从改善临床症状入手，并未着眼于椎间盘本身的病理变化，故治疗效果往往有限[3-5]。本实验从髓核入手，通过多种实验方法比较退变与正常髓核组织在细胞形态、生化成分等方面的不同，并利用基因工程技术将 IGF-1 和 PDGF 基因转染至退变的髓核细胞，就两种细胞因子如何逆转髓核的退变作深入研究。
1 材料与方法
1.1 研究标本
退变髓核组织（退变组）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因腰椎间盘退变突出需行髓核摘除术的 15 例患者，其中男 10 例，女 5 例；年龄 48～76 岁，平均 62.8 岁。纳入标准：MRI 示腰椎间盘严重退变，不合并黄韧带、后纵韧带钙化者；不合并腰椎感染、肿瘤及其他严重躯体疾病者。
正常髓核组织（正常组）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因外伤致腰椎爆裂性骨折需行椎间盘髓核摘除术的 15 例患者，其中男 9 例，女 6 例；年龄 16～38 岁，平均 23.4 岁。纳入标准：年龄<40 岁；无脊柱外伤及脊柱手术病史；术前影像学检查无腰椎间盘退变及其他病变者。
1.2 主要试剂及仪器
H-DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）；澳洲血源 FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白抗体一抗，山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 二抗，山羊抗小鼠二抗免疫组织化学试剂盒，兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，FITC 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（Chemicon 公司，美国）；小鼠抗人 B 淋巴细胞瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体一抗、小鼠抗人 Bcl-2 相关 X（Bcl-2 associate X，Bax）抗体一抗、浓缩型 DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Western blot 及 IP 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；预染蛋白 Marker（Fermentas 公司，立陶宛）；聚偏二氟乙烯（poluvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美国）；抗 β-actin 抗体（Sigma 公司，美国）。CO2 恒温细胞培养箱（SANYO 公司，日本）；倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）；流式细胞仪（Beckman 公司，美国）。
1.3 正常和退变髓核细胞学观察
1.3.1 HE 染色观察
取部分退变组及正常组髓核组织，经漂洗、乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（片厚 5 μm）、贴片处理后，常规行 HE 染色观察。
1.3.2 免疫组织化学染色观察
取上述部分切片行Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Bcl-2、Bax 免疫组织化学染色。主要步骤：先将切片脱蜡、乙醇水化后，进行抗原修复，阻断过氧化物酶活性；然后依次滴加一抗（小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白及 Bcl-2、Bax 单克隆抗体）、山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 二抗；最后 DAB 溶液显色，中性树胶盖玻片封闭。倒置显微镜下观察，Ⅰ、Ⅱ型胶原及 Bcl-2、Bax 阳性结果为髓核细胞质内可见棕黄色颗粒状阳性产物。每个样本随机观察 10 个高倍（×400）视野并计数阳性细胞数和总细胞数，计算各蛋白阳性细胞百分比。
1.3.3 髓核细胞形态观察
取部分退变组及正常组髓核组织，分别用 75%乙醇浸泡消毒、PBS 冲洗后，组织剪除周围肌肉韧带，眼科剪剪去周围纤维环组织，并将髓核剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小；再将髓核组织消化、离心（半径 6 cm、1 000 r/min 离心 5 min）后，在含 15%FBS 的 H-DMEM 培养基上进行原代和传代培养，倒置显微镜下观察髓核细胞形态。
1.3.4 Western blot 检测
取两组髓核细胞，根据 Western blot 检测试剂盒说明进行总蛋白提取、蛋白定量、Ⅱ型胶原及内参 β-actin 蛋白电泳、转膜、封闭和孵育、PVDF 膜化学发光、显影及定影。显影条带使用 Image-Pro Plus 软件分析并扫描条带吸光度（A）值，以目的条带与 β-actin 的 A 值比值作为各蛋白相对表达量。
1.4 基因转染退变髓核细胞相关研究
1.4.1 实验分组及基因转染
利用慢病毒载体系统构建 IGF-1 基因慢病毒颗粒、PDGF 基因慢病毒颗粒及携带 IGF-1 和 PDGF 双基因的慢病毒颗粒（IGF-1-P2A-PDGF）。实验分为 4 组，A 组为退变髓核细胞对照组；B、C、D 组分别用 IGF-1、PDGF 和 IGF-1-P2A-PDGF 基因慢病毒颗粒转染退变髓核细胞。具体转染方法：分别将 0.2 μg 上述基因慢病毒质粒稀释到 25 μL Reduced Serum Medium（一种可减少血清补充的改良培养基）中，另将 0.5 μL Lipofectamin2000 稀释到 25 μL Reduced Serum Medium 中，将两种溶液轻轻混匀后静置，再分别加入 4 组细胞培养孔中培养。
1.4.2 细胞形态观察
转染后 21 d 取出各组细胞，胰蛋白酶消化后离心（半径 6 cm、1 000 r/min、离心 5 min），收集沉淀细胞，PBS 清洗后取其中一部分加入含有 H-DMEM 培养基的细胞培养瓶中进行传代培养，倒置显微镜下观察转染后各组细胞形态变化。剩余部分调整为浓度 1×106个/mL 的细胞悬液进行后续实验。
1.4.3 流式细胞仪检测
将各组细胞悬液分别加入兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，室温孵育 30 min；PBS 洗 2 次，加入 FITC 标记的山羊抗兔 IgG 二抗，避光孵育 15 min；PBS 洗 2 次，混匀后上流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1、PDGF 阳性率。实验重复 6 次取均值。
1.4.4 免疫组织化学染色观察
转染后 21 d 取出各组细胞分别放在 6 孔板内爬片，多聚甲醛固定，3%H2O2 室温孵育 15 min；0.2%Triton X-100 溶液透化固定后的细胞，山羊血清封闭，室温孵育 10 min；加入小鼠抗人Ⅱ型胶原抗体，4℃ 孵育过夜，再加山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 15 min；滴加 DAB 显色液，封片，倒置荧光显微镜下观察。
1.4.5 Western blot 检测
同 1.3.4 方法检测各组细胞Ⅱ型胶原蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和退变髓核细胞学观察
2.1.1 髓核细胞形态观察
正常组培养 24 h 后有髓核细胞贴壁，初贴壁细胞呈圆形或椭圆形，部分伸出伪足，似扇形；然后贴壁细胞不断增多，72 h 后细胞无明显增多，逐渐伸展为梭形或多角形，呈极性排列；传代后髓核细胞贴壁速度加快，2 h 后可见细胞排列紧密，铺满瓶底，呈长梭形或多角形，放射状或铺路石样外观。退变组髓核细胞随培养时间延长，形态逐渐变得极不规则且排列较疏松，胞体变长，细胞质内出现发亮的颗粒状物及空泡，并出现凋亡细胞。见图 1。
图1
退变组和正常组髓核细胞形态观察（倒置显微镜×200）
a. 培养 72 h 的退变髓核细胞（黄箭头示凋亡的髓核细胞，红箭头示细胞质内发亮的颗粒状物及空泡）；b. 培养 24 h 的正常髓核细胞；c. 培养 72 h 的正常髓核细胞；d. 第 2 代正常髓核细胞
Figure1. Morphological observation of NPCs in degeneration group and normal group (Inverted microscope×200)a. The degenerated NPCs cultured for 72 hours (Yellow arrow indicated the apoptotic NPCs, red arrow indicated the shiny granules and vacuoles in the cytoplasm); b. Normal NPCs cultured for 24 hours; c. Normal NPCs cultured for 72 hours; d. The 2nd generation of normal NPCs
2.1.2 HE 染色观察
退变组髓核细胞逐渐减少，髓核组织内可见大量纤维软骨组织；正常组中央髓核组织可见大量脊索细胞和少量类软骨细胞。见图 2。
图2
退变组和正常组 HE 染色观察
从左至右依次为×100、×400 a. 退变组 箭头示纤维软骨细胞；b. 正常组 箭头示脊索细胞
Figure2. HE staining observation in degeneration group and normal groupFrom left to right for ×100 and ×400, respectively a. Degeneration group Arrow indicated fibrochondrocytes; b. Normal group Arrow indicated notochord cells
2.1.3 免疫组织化学染色观察
退变组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白呈强阳性染色，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白呈弱阳性染色；而正常组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白呈弱阳性染色，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白呈强阳性染色。见图 3。退变组Ⅰ型胶原、Bax 蛋白阳性细胞百分比显著高于正常组，Ⅱ型胶原、Bcl-2 蛋白阳性细胞百分比显著低于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
退变组与正常组髓核组织各蛋白阳性细胞百分比（n=15，，%）
Table1.
Percentage of protein-positive cells in the NP tissue of the degeneration group and the normal group (n=15, , %)
图3
退变组和正常组髓核组织免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×400）
从左至右依次为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Bcl-2、Bax 蛋白a. 退变组；b. 正常组
Figure3. Immunohistochemical staining observation of NP tissue in degeneration group and normal group (Inverted microscope×400)From left to right for collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, Bcl-2, and Bax proteins, respectively a. Degeneration group; b. Normal group
2.1.4 Western blot 检测
两组在相对分子质量为 130×103附近均出现了蛋白条带，提示两组细胞均能表达Ⅱ型胶原蛋白。见图 4。退变组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量为 0.157 5±0.026 1，与正常组 0.870 3±0.033 1 比较差异有统计学意义（t=65.493，P=0.000）。
图4
Western blot 检测两组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：退变组 2：正常组
Figure4. Collagen type Ⅱ expression of the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Degeneration group 2: Normal group
2.2 基因转染退变髓核细胞相关研究
2.2.1 细胞形态观察
A 组细胞排列疏松且不规则，细胞质内出现发亮的颗粒状物及空泡，并出现大量凋亡细胞。转染后 21 d，B、C、D 组细胞经传代后形态变得较为规则，细胞质内发亮的颗粒状物及空泡消失，凋亡细胞明显减少，提示细胞活力已明显提高。B、C 组细胞形态差别不大，但 C 组细胞密度更大；D 组细胞形态最为规则，细胞密度最大且呈极性排列。见图 5。
图5
转染后 21 d 各组细胞形态观察（倒置显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure5. Cell morphology observation in each group at 21 days after transfection (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 流式细胞仪检测
与 A、C 组比较，B、D 组 IGF-1 阳性率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间及 B、D 组间 IGF-1 阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。与 A、B 组比较，C、D 组 PDGF 阳性率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间及 C、D 组间 PDGF 阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。见图 6，表 2。
表2
转染后 21 d 流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1 和 PDGF 阳性率（n=6，，%）
Table2.
Percentages of IGF-1- and PDGF-positive cells detected by flow cytometry in each group at 21 days after transfection (n=6, , %)
图6
转染后 21 d 流式细胞仪检测各组细胞 IGF-1、PDGF 阳性率
从左至右分别为 A、B、C、D 组 a. IGF-1；b. PDGF
Figure6. IGF-1 and PDGF positive rates detected by flow cytometry at 21 days after transfectionFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. IGF-1; b. PDGF
2.2.3 免疫组织化学染色观察
A、B、C、D 组Ⅱ型胶原蛋白阳性染色情况依次为（±）、（+）、（+）、（++）。A 组仅有很少一部分细胞呈淡棕色；B、C 组大多数细胞呈棕色；D 组细胞全部染色，且大部分为深棕色。见图 7。
图7
转染后 21 d 各组细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure7. Immunohistochemical staining observation in each group at 21 days after transfection (Inverted fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Western blot 检测
各组在相对分子质量为 130×103附近均出现了蛋白条带，提示各组细胞均能表达Ⅱ型胶原蛋白。见图 8。A、B、C、D 组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量分别为 0.141 8±0.012 9、0.334 6±0.029 5、0.415 2±0.032 9、0.530 9±0.028 4，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
图8
Western blot 检测各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure8. Collagen type Ⅱ protein expression of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
3.1 髓核的结构功能及椎间盘的退变过程
椎间盘是连接上下椎体的生物结构，由内层的髓核、外层的纤维环及上下软骨终板构成，其中纤维环主要由成纤维细胞及其合成的Ⅰ型胶原蛋白构成，而髓核是由类软骨细胞及其合成的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖构成[3]。髓核组织是一种弹性胶冻状无定型物质，具有吸收震荡、平衡应力的作用。椎间盘退变的过程十分复杂，在人们日常工作劳动中，椎间盘要承受垂直压力、旋转剪切力等多种应力，使得椎间盘细胞长期处于高压环境中，再加上低氧、低营养、高渗透压的内环境因素，使得椎间盘细胞极易发生退变。需要指出的是，椎间盘细胞的退变并不代表椎间盘退变，椎间盘细胞退变、凋亡都是正常生理过程，当以上这些损伤因素加快了细胞的退变，使得椎间盘细胞合成、增殖速度代偿不了细胞退变凋亡速度时，椎间盘才会发生退变。而椎间盘退变主要表现为髓核细胞凋亡和细胞活力下降，包括蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白等细胞外基质合成减少，髓核内水分含量下降，髓核组织变硬，髓核细胞从类软骨细胞变为类纤维细胞，而这些病理改变与腰椎间盘突出、腰椎管狭窄、腰椎滑脱等腰椎退行性疾病密切相关[4-6]。
3.2 椎间盘退变的再生组织工程
由于腰椎承受应力大，活动度高，故椎间盘退变大多发生在腰椎[7]。以往的手术治疗方法都是摘除退变的椎间盘，或者椎间植骨融合钉棒固定，但手术不仅创伤大，而且破坏了脊柱的结构和力学平衡，容易引起邻近节段退变，所以越来越多学者着眼于椎间盘细胞再生的组织工程研究。Naqvi 等[8]首先提取骨髓基质细胞，体外进行“微胶囊化”，在低温保存前与 TGF-β3 共培养 14 d，然后将这种微胶囊注射入牛退变的椎间盘髓核中，发现牛退变的椎间盘髓核细胞发生了逆转，产生了大量糖胺聚糖及胶原蛋白等细胞外基质成分，并且该方法比不进行“微胶囊化”而直接将 TGF-β3 诱导的骨髓基质细胞注射入牛髓核组织内，会产生更多的细胞外基质，说明“微胶囊化”能够有效避免外源细胞在体内的分解。Ishiguro 等[9]开发了一种脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）衍生的无支架组织工程构建物（tissue-engineered construct，TEC），并将 ADSC-TEC 植入髓核摘除术后的大鼠椎间盘内，获得了良好效果。Tao 等[10]提取并培养了髓核 MSCs，并将其在体外高渗透压环境下与髓核细胞共培养，发现髓核 MSCs 增殖能力强大，并且能促进蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白的合成。
3.3 基因工程技术
通过基因治疗椎间盘退变性疾病也是目前研究的热点，主要方法是通过病毒或非病毒载体携带外源性基因转染到退变椎间盘细胞中进行人工干预，达到治疗目的。Farhang 等[11]从手术室获取人退变椎间盘髓核细胞，再将慢病毒介导的规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）表观基因转染至髓核细胞并监测信号通路，发现重组细胞内 Cas9 蛋白失活，1 型 TNF 受体/1 型 IL1 受体信号转导中断，TNF-α 及 IL-1β 表达下调，退变的椎间盘得到修复。雷涛等[12]建立兔椎间盘退变模型，再将携带 BMP-2 及分化抑制因子 1（inhibitor 1 of differentiation，Id1）基因转染至兔退变椎间盘髓核细胞内，发现 BMP-2 和 Id1 基因可稳定表达相应的蛋白并增加细胞外基质的表达，抑制椎间盘的退变。基因转染过程中的载体包括非病毒载体和病毒载体，非病毒载体主要是细菌质粒，由于其转染效率很低，几乎很少使用；而病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒及慢病毒载体等，慢病毒载体相比其他病毒载体具有基因容量大、转染率高、能够整合到宿主细胞染色体基因组中长期稳定表达等优势[13-14]。本实验对椎间盘退变的研究已转向再生医学和基因治疗领域。直接向细胞注射生长因子促进细胞再生的方法，因生长因子半衰期太短，而椎间盘退变又是长期慢性过程，故局限性很大[15]。而基因治疗的出现打破了桎梏。本实验利用慢病毒作为载体，将外源性 IGF-1 和 PDGF 基因通过基因酶的切割、聚合，整合到退变髓核细胞的细胞核 DNA 基因组中，随着细胞分裂、DNA 复制，子代细胞长期稳定地表达这两种外源性蛋白。腺病毒等其他病毒载体只能将外源性基因整合到宿主的细胞质 DNA 中，故蛋白表达长久性不如慢病毒[13-14]。虽然研究表明慢病毒免疫原性很低[16]，但应用于临床治疗，大量病毒进入人体是否会引起毒性反应、病毒是否会变异等问题仍有待考证。
3.4 IGF-1 和 PDGF 的生物效应
IGF-1 是一种多功能细胞调控因子，化学结构是活性多肽，在人体中广泛存在，主要通过内分泌、自分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，具有提高细胞生物活性、促进分裂增殖、抑制细胞凋亡的作用[17]。An 等[18]通过体外培养鼠椎间盘细胞，发现维生素 D 能促进椎间盘细胞分裂增殖，有效预防椎间盘退变，究其原因是维生素 D 能提高椎间盘细胞 IGF-1 含量。李大鹏等[19]体外培养人退变椎间盘髓核细胞，然后用 IGF-1 刺激这些细胞，发现细胞合成的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白大量增加，进一步研究发现是由于 IGF-1 能够激活 P13K/Akt 信号通路。Zhang 等[20]利用腺病毒载体将 IGF-1 基因转染至家兔退变的腰椎间盘髓核细胞中，结果退变髓核细胞的凋亡率明显下降，证实 IGF-1 具有抑制髓核细胞凋亡的作用。
PDGF 也是一种活性多肽分子，且在人体内含量极少，甚至常规测量仪器难以检测出，但其作用广泛而强大。与 IGF-1 类似，PDGF 对于椎间盘细胞的作用是促进细胞增殖分裂，显著抑制细胞凋亡，同时也促进细胞外基质的合成。与 IGF-1 不同的是，PDGF 的作用更强大，并且它是一种促有丝分裂原，最主要的作用是促进细胞增殖分裂，抑制凋亡[21]。PDGF 与椎间盘细胞结合后，能激活磷脂酶 C，促进肌醇二磷酸和二酰基甘油的合成，提高细胞内 Ca2+ 浓度，促使椎间盘细胞从 G0/G1 期进入 S 期，按照碱基配对原则合成 DNA 新链，最后进入 G2 期完成有丝分裂[22]。Presciutti 等[21]体外培养人退变的椎间盘细胞，再将 PDGF 加入培养基中，发现 PDGF 能够显著抑制椎间盘细胞的凋亡，刺激其分裂增殖。Kuo 等[23]分别制作大鼠体内和体外椎间盘细胞退变模型，用 IGF-1 联合 PDGF 对退变的细胞进行人工干预，结果细胞凋亡被强烈抑制，得出 IGF-1 和 PDGF 有望应用于临床治疗椎间盘退变类疾病的结论。
本实验成功将外源性 IGF-1、PDGF 基因转染至体外培养的退变椎间盘细胞中，结果显示二者具有逆转椎间盘退变的生物效应；PDGF 促进细胞增殖、Ⅱ型胶原蛋白合成的作用稍强于 IGF-1，且 IGF-1 和 PDGF 共同作用效果更强。由于体内髓核细胞所处的环境和压力与体外完全不同，故 IGF-1 和 PDGF 对体内退变的髓核细胞能否达到与体外一样的作用，尚需进一步实验证实。
综上述，IGF-1、PDGF 均能促进髓核细胞增殖，抑制其凋亡；IGF-1、PDGF 还能促进髓核细胞的细胞外基质（Ⅱ型胶原蛋白）分泌，二者具有协同作用。
作者贡献：许刚负责实验设计及实施，起草文章；张长春参与实验设计、指导实验实施过程；朱坤参与实验设计，参与论文撰写并负责实验数据的收集及统计学分析；叶雨辰参与实验实施；鲍正齐对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经蚌埠医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（BYYFY-2018KY24）。
