引用本文： 王宁, 陈俊毅, 陈西淼, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 慢病毒介导沉默 P75 神经生长因子受体基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(8): 1052-1058. doi: 10.7507/1002-1892.201912086 复制
P75 神经生长因子受体（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）是一种神经营养因子的低亲和力受体，属于Ⅰ型糖蛋白，在多种正常与非正常组织、细胞中均有表达[1]。P75NTR 具有复杂的生物学功能，可以介导细胞增殖与分化，在不同的细胞、细胞发育阶段以及局部环境中发挥不同的功能[2]。研究表明，P75NTR 在骨折局部组织中持续高表达，进而影响骨折愈合[3-5]，甚至造成骨缺损[6]。而骨缺损修复主要是由 BMSCs 定向成骨分化形成新的骨组织来完成，这一过程中 P75NTR 发挥的作用尚未明确。小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）是在转录水平上调节基因表达的双链 RNA[7-9]，本研究利用 siRNA 慢病毒介导沉默大鼠 BMSCs 的 P75NTR 基因表达，观察细胞成骨分化能力的变化，探讨通过沉默 P75NTR 基因治疗骨缺损的可行性，以期为临床修复骨缺损提供新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
病毒感染增强液聚凝胺（Polybrene）、RNA 引物（苏州吉玛基因股份有限公司）；L-DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；FBS、30% 丙烯酰胺、Tris、RIPA 裂解液、细胞冻存液、聚偏二氟乙烯膜、免疫组织化学染色试剂盒、MTT 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；一抗稀释液、二抗稀释液、增强型 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG、兔抗 P75NTR 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）单克隆抗体、兔抗鼠 Runx 相关转录因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；超敏发光液（北京 Bridgen 桥生物公司）；Trizol 试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；ALP 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；茜红素 S 染色液、成骨分化诱导培养液及诱导分化专用血清、青-链霉素、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松 [Cyagen 赛业（苏州）生物科技有限公司]。
CO2 培养箱、冷冻高速离心机（Thermo 公司，美国）；光学显微镜（Zeiss 公司，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；滤光片型酶标仪、光栅型连续波长酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；PCR 仪、图像分析系统（B&D 公司，美国）；凝胶成像分析系统、垂直电泳-转膜系统（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 P75NTR 基因慢病毒载体构建及筛选
1.2.1 慢病毒载体构建
针对 P75NTR 目标基因序列，按照 RNA 干扰序列设计原则，设计 3 条 P75NTR-siRNA 序列，分别为 5'-GGCTGATGCTGAATGCGAAGA-3'（P75NTR-siRNA-1）、5'-GCAAGACCTTGTACCCAGTAC-3'（P75NTR-siRNA-2）、5'-GGGTTACCAGCCTGAACATAT-3'（P75NTR-siRNA-3）。同时设计阴性对照（negative control，NC）siRNA 序列为 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（NC-siRNA）。以上 siRNA 序列的设计、慢病毒载体构建、包装及滴度检测均由苏州吉玛基因股份有限公司完成。
1.2.2 慢病毒载体筛选
取本课题组前期研究培养、鉴定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，分别采用 P75NTR-siRNA-1、P75NTR-siRNA-2、P75NTR-siRNA-3 进行转染（siRNA-1 组、siRNA-2 组及 siRNA-3 组）；以 NC-siRNA 转染的 BMSCs 作为阴性对照组，正常培养 BMSCs 作为空白对照组。转染方法：转染前 1 d 待 BMSCs 融合至 80%～90% 时，EDTA-胰蛋白酶消化并重悬细胞，以 10%FBS 调整细胞密度为 5×103 个/L 后接种至 6 孔板，每孔 2 mL。转染当天取出 6 孔板，吸弃培养液，每孔加入 1 mL 常规培养液后，按照分组对应加入 4 μL 慢病毒载体（感染复数为 80）、5 μL Polybrene，震荡摇匀。转染 4 d 后吸弃培养基，无菌 PBS 洗 3 次，加入含 10%FBS 的完全培养基继续培养。
检测方法：① 细胞形态观察。转染后 3 d 倒置显微镜下观察各组细胞形态变化。
② 实时荧光定量 PCR 检测 P75NTR 基因表达。取转染后 4 d 各组细胞，按试剂盒说明书提取总 RNA 并逆转录合成 cDNA。采用 Primer 5.0 设计软件设计引物，引物序列见表 1。反应体系：10×buffer1 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）0.8 μL、Taq Polymerase 0.2 μL、上下游引物各 0.4 μL、Template 1 μL，加入双蒸水至 20 μL。反应条件：94℃、30 s；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，72℃、6 min，循环 30 次。采用 2△△Ct法计算 P75NTR mRNA 相对表达量，计算 siRNA-1 组、siRNA-2 组及 siRNA-3 组的抑制率，观察沉默效果；抑制率=（空白对照组测量值−siRNA 组测量值）/空白对照组测量值×100%。
表1
实时荧光定量 PCR 基因引物序列及产物大小
Table1.
Gene primer sequence and product size in real-time fluorescent quatitative PCR
③ Western blot 检测 P75NTR 蛋白表达。取转染后 6 d 各组细胞，提取蛋白样品，BCA 法测定蛋白浓度；配置 10% 丙烯酰胺凝胶，上样；电泳液中电泳后转膜，置于 5% 牛奶中封闭；加入 P75NTR 一抗工作液（1∶1 000），4℃ 孵育过夜；加入二抗（1∶8 000）室温孵育 1 h；洗膜 3 次后加入发光工作液，凝胶成像仪中显像；用 Image J 灰度分析软件分析条带灰度值，以与内参（GAPDH）灰度值比值作为 P75NTR 蛋白表达相对量。同上法计算 siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组的抑制率，观察沉默效果。
结合上述两项检测结果，选取沉默效果最佳 P75NTR-siRNA 进行后续实验。
1.3 沉默 P75NTR 基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响
1.3.1 实验分组
取本课题组前期研究培养、鉴定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，随机分为 3 组，分别为慢病毒介导 P75NTR 沉默组（实验组）、阴性对照组、空白对照组。空白对照组为正常培养 BMSCs；阴性对照组及实验组分别采用 NC-siRNA 及筛选的 P75NTR-siRNA 慢病毒载体转染 BMSCs，转染方法同 1.2.2，取转染 4 d 细胞进行以下观测。
1.3.2 MTT 法检测细胞增殖情况
将各组 BMSCs 接种于 96 孔板中，每孔 5×103个细胞，每组 3 个复孔。用含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培养基培养细胞，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。培养 1～8 d 各组取 3 孔，继续培养 4 h 后弃上清，每孔加入 DMSO 震荡 10 min，采用酶标仪于 490 nm 波长处检测吸光度（A）值，绘制细胞增殖曲线。
1.3.3 BMSCs 成骨诱导分化培养及检测
① 成骨诱导分化培养：取各组 BMSCs 采用 EDTA-胰蛋白酶消化后，以 2×104个/L 密度接种于 6 孔板，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培养基 1 mL，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。待细胞生长融合达 60%～70% 后吸弃培养液，加入含地塞米松 0.1 μmol/L、维生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸钠 10 mmol/L 的成骨诱导分化完全培养基继续培养，每 3 天更换 1 次培养基。
② Western blot 检测 OCN 及 Runx2 蛋白表达：诱导培养 3 d，参照 1.2.2 方法检测各组细胞 OCN、Runx2 蛋白相对表达量。
③ 免疫组织化学染色观察：诱导培养 7 d，将各组细胞接种于预置盖玻片的培养皿进行细胞爬片，每个培养皿接种 4×104 个细胞，3 d 后行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。倒置显微镜下观察细胞质内有棕黄色颗粒为阳性染色，随机选取 5 个视野，用 Image-Pro Plus 图像采集分析系统计算Ⅰ型胶原蛋白灰度值，即Ⅰ型胶原蛋白表达量。
④ ALP 检测成骨分化情况：诱导培养 7、10、14 d，分别取各组细胞上清液，参照 ALP 检测试剂盒说明书检测 ALP 活力。
⑤ 茜素红染色检测矿化结节形成情况：诱导培养 7、14 d，取各组细胞吸弃成骨诱导分化培养基，PBS 冲洗 2 次，每孔加入 2 mL 4%多聚甲醛溶液，固定 30 min；吸弃多聚甲醛溶液， PBS 冲洗 2 次，每孔加入茜素红 S 染色液 1 mL，染色 5 min；吸弃染液，PBS 冲洗 3 次。倒置显微镜下观察染色效果。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒载体筛选
2.1.1 细胞形态观察
倒置显微镜下见各组细胞形态无明显差异，呈长梭形贴壁生长，排列成辐射状。见图 1。
图1
倒置显微镜下观察各组细胞形态（×100）
a. siRNA-1 组；b. siRNA-2 组；c. siRNA-3 组；d. 阴性对照组；e. 空白对照组
Figure1. Cell morphology observation of each group under inverted microscope (×100)a. siRNA-1 group; b. siRNA-2 group; c. siRNA-3 group;d. Negative control group; e. Blank control group
2.1.2 实时荧光定量 PCR 检测
siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组、阴性对照组及空白对照组 P75NTR mRNA 相对表达量分别为 0.613±0.067、0.445±0.133、0.091±0.028、0.970±0.089、0.991±0.071。其中，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组与空白对照组、阴性对照组比较，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组抑制率分别为 38.1%±5.2%、55.1%±7.9%、90.8%±4.1%。
2.1.3 Western blot 检测
siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组、阴性对照组及空白对照组 P75NTR 蛋白相对表达量分别为 0.244±0.028、0.192±0.017、0.040±0.012、0.391±0.023、0.412±0.013。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组与空白对照组、阴性对照组比较，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组抑制率分别为 40.8%±5.7%、53.4%±4.3%、90.3%±4.6%。见图 2。
图2
Western blot 检测各组 P75NTR 蛋白表达水平
Mr：相对分子质量 1：空白对照组 2：阴性对照组 3：siRNA-1 组 4：siRNA-2 组 5：siRNA-3 组
Figure2. Expression of P75NTR protein in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: siRNA-1 group 4: siRNA-2 group 5: siRNA-3 group
结合实时荧光定量 PCR 及 Western blot 检测结果，P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳，选择其进行后续实验。
2.2 沉默 P75NTR 基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响
2.2.1 MTT 法检测细胞增殖情况
随培养时间延长，3 组 BMSCs 数量均逐渐增加。与阴性对照组和空白对照组相比，实验组细胞增殖明显加快；从 3 d 开始实验组 A 值明显高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
MTT 法检测各组细胞增殖
Figure3.
Cell proliferation of each group detected by MTT assay
2.2.2 Western blot 检测细胞 OCN 及 Runx2 蛋白表达
实验组、阴性对照组及空白对照组 OCN 蛋白相对表达量分别为 1.113±0.204、0.611±0.181、0.605±0.113，Runx2 蛋白相对表达量分别为 1.793±0.190、0.967±0.314、0.918±0.261。实验组 OCN 及 Runx2 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组及空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测各组细胞 OCN 及 Runx2 蛋白表达水平 Mr：相对分子质量 1：空白对照组 2：阴性对照组 3：实验组
Figure4.
Expressions of OCN and Runx2 proteins in cells of each group detected by Western blot
Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: Experimental group
2.2.3 免疫组织化学染色观察 Ⅰ 型胶原表达
镜下观察各组细胞质内均可见棕黄色颗粒，实验组染色程度强于空白对照组及阴性对照组，空白对照组与阴性对照组无明显差异。见图 5。Ⅰ 型胶原蛋白表达量空白对照组为 18.64±3.12、阳性对照组为 19.12±4.09、实验组为 39.78±7.34。实验组明显高于其他两组，差异有统计学意义（P<0.05）；阳性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图5
各组免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×200）
a. 空白对照组；b. 阴性对照组；c. 实验组
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Negative control group; c. Experimental group
2.2.4 ALP 活力检测
随时间延长，各组细胞 ALP 活力均逐渐升高，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。各时间点，实验组 ALP 活力均较空白对照组和阴性对照组增高，差异有统计学意义（P<0.05）；空白对照组和阳性对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各时间点各组 ALP 活力比较（n=3，
）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=3, 
)
2.2.5 茜素红染色
成骨诱导培养 7 d，空白对照组及阴性对照组仅有极少红色结节形成，实验组可见较多红色结节。14 d 时，空白对照组及阳性对照组仍为少量红色结节，而实验组出现大量红色结节。见图 6。
图6
各组茜素红染色观察（倒置显微镜×100）
从左至右分别为空白对照组、阴性对照组、实验组 a. 成骨诱导 7 d；b. 成骨诱导 14 d
Figure6. Alizarin red staining observation of each group (Inverted microscope×100)From left to right for blank control group, negative control group, and experimental group, respectively a. Osteogenic induction for 7 days; b. Osteogenic induction for 14 days
3 讨论
本课题组前期 P75NTR 与骨缺损相关性研究发现，P75NTR 在骨折不愈合处明显高表达[4]。为了进一步研究 P75NTR 在骨缺损中的作用，本次研究采用大鼠 BMSCs，以 siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因后，观察细胞成骨分化能力的变化。结果显示，P75NTR 基因沉默后，大鼠 BMSCs 中的Ⅰ型胶原蛋白形成、ALP 活力、矿化结节形成能力均明显提高，说明 P75NTR 基因沉默可增强大鼠 BMSCs 成骨分化能力。据此反向推理，P75NTR 基因表达上调可能使 BMSCs 增殖及成骨分化能力减弱，这可能是骨缺损发生的分子机制之一。
研究表明，NGF 的前体物质 pro-NGF 通过与 P75NTR 结合可以诱导细胞凋亡、抑制分化，但 NGF 与 P75NTR 结合可以发挥完全相反作用，诱导细胞增殖与分化，从而挽救受损的细胞[13-14]。目前，有关研究报道 P75NTR 参与的信号通路主要包括神经酰胺通路、JNK-p53-Bax 凋亡通路及 NF-κB 通路。结合本次研究结果，我们认为在神经酰胺通路中，沉默 P75NTR 基因后使得位于浆膜内表面的神经鞘磷脂、神经鞘磷脂酶不能被激活，从而不能生成足够的神经酰胺，进而阻断 JNK 通路引起的 BMSCs 凋亡，细胞增殖与凋亡的微环境失衡使 BMSCs 显示较强的增殖活性。另一方面，沉默 P75NTR 基因后启动核因子 NF-κB 通路，促进 BMSCs 增殖与分化。NGF 可以通过 P75NTR 与细胞内近端的 TRAF6 蛋白结合，启动 IKK（IkB kinases）和 ERK 的降解，激活 NF-κB 通路。本研究中沉默 P75NTR 基因促进 BMSCs 增殖分化，可能是存在竞争性抑制的结果，即表达量的不同可产生不同的竞争效应（pro-NGF 与 NGF 竞争性结合不同表达量 P75NTR 引起不同效应）。正常水平的 P75NTR 与 pro-NGF 结合占优势；P75NTR 水平下调后，则与 NGF 结合占优势，从而使 BMSCs 增殖分化。此外，由于在 NF-κB 通路中 P75NTR 和 TrkA 有共同作用，TrkA 与 She 相结合也能启动 IKK 和 ERK 通路激活 NF-κB 通路[15-16]，所以下调 P75NTR 水平后，TrkA 是否有可能由于代偿性作用直接与 NGF 存在联系，促进 BMSCs 的增殖与分化，有待进一步实验验证。
P75NTR 的复杂空间结构决定了其在细胞中具有独特而重要的生物学效应。结合本次研究结果，我们认为下一步可以通过沉默 P75NTR 基因并联合 NGF 过表达转染 BMSCs 后植入骨缺损处，提高 NGF 水平，关闭 P75NTR 凋亡通道，从而修复骨缺损，这可能为骨组织工程修复骨缺损提供新思路。值得注意的是，本研究沉默 P75NTR 基因表达可促进大鼠 BMSCs 的成骨分化仅是体外细胞实验，而骨缺损的形成是一个多因素参与过程，对于不同动物细胞、细胞种类、甚至细胞状态等混杂因素都需要进一步实验论证。对于 P75NTR 在骨组织修复方面所表现的双重作用通路机制[1]，也需要更深入研究。
作者贡献：贝朝涌负责实验设计；王宁、陈俊毅负责实验实施；陈西淼、朱伦井、段江涛负责文献查询及实验评价；王烨负责实验结果收集整理；王宁负责实验结果统计分析及文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准（GLMC201805018）。
P75 神经生长因子受体（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）是一种神经营养因子的低亲和力受体，属于Ⅰ型糖蛋白，在多种正常与非正常组织、细胞中均有表达[1]。P75NTR 具有复杂的生物学功能，可以介导细胞增殖与分化，在不同的细胞、细胞发育阶段以及局部环境中发挥不同的功能[2]。研究表明，P75NTR 在骨折局部组织中持续高表达，进而影响骨折愈合[3-5]，甚至造成骨缺损[6]。而骨缺损修复主要是由 BMSCs 定向成骨分化形成新的骨组织来完成，这一过程中 P75NTR 发挥的作用尚未明确。小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）是在转录水平上调节基因表达的双链 RNA[7-9]，本研究利用 siRNA 慢病毒介导沉默大鼠 BMSCs 的 P75NTR 基因表达，观察细胞成骨分化能力的变化，探讨通过沉默 P75NTR 基因治疗骨缺损的可行性，以期为临床修复骨缺损提供新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
病毒感染增强液聚凝胺（Polybrene）、RNA 引物（苏州吉玛基因股份有限公司）；L-DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；FBS、30% 丙烯酰胺、Tris、RIPA 裂解液、细胞冻存液、聚偏二氟乙烯膜、免疫组织化学染色试剂盒、MTT 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；一抗稀释液、二抗稀释液、增强型 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG、兔抗 P75NTR 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）单克隆抗体、兔抗鼠 Runx 相关转录因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；超敏发光液（北京 Bridgen 桥生物公司）；Trizol 试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；ALP 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；茜红素 S 染色液、成骨分化诱导培养液及诱导分化专用血清、青-链霉素、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松 [Cyagen 赛业（苏州）生物科技有限公司]。
CO2 培养箱、冷冻高速离心机（Thermo 公司，美国）；光学显微镜（Zeiss 公司，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；滤光片型酶标仪、光栅型连续波长酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；PCR 仪、图像分析系统（B&D 公司，美国）；凝胶成像分析系统、垂直电泳-转膜系统（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 P75NTR 基因慢病毒载体构建及筛选
1.2.1 慢病毒载体构建
针对 P75NTR 目标基因序列，按照 RNA 干扰序列设计原则，设计 3 条 P75NTR-siRNA 序列，分别为 5'-GGCTGATGCTGAATGCGAAGA-3'（P75NTR-siRNA-1）、5'-GCAAGACCTTGTACCCAGTAC-3'（P75NTR-siRNA-2）、5'-GGGTTACCAGCCTGAACATAT-3'（P75NTR-siRNA-3）。同时设计阴性对照（negative control，NC）siRNA 序列为 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（NC-siRNA）。以上 siRNA 序列的设计、慢病毒载体构建、包装及滴度检测均由苏州吉玛基因股份有限公司完成。
1.2.2 慢病毒载体筛选
取本课题组前期研究培养、鉴定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，分别采用 P75NTR-siRNA-1、P75NTR-siRNA-2、P75NTR-siRNA-3 进行转染（siRNA-1 组、siRNA-2 组及 siRNA-3 组）；以 NC-siRNA 转染的 BMSCs 作为阴性对照组，正常培养 BMSCs 作为空白对照组。转染方法：转染前 1 d 待 BMSCs 融合至 80%～90% 时，EDTA-胰蛋白酶消化并重悬细胞，以 10%FBS 调整细胞密度为 5×103 个/L 后接种至 6 孔板，每孔 2 mL。转染当天取出 6 孔板，吸弃培养液，每孔加入 1 mL 常规培养液后，按照分组对应加入 4 μL 慢病毒载体（感染复数为 80）、5 μL Polybrene，震荡摇匀。转染 4 d 后吸弃培养基，无菌 PBS 洗 3 次，加入含 10%FBS 的完全培养基继续培养。
检测方法：① 细胞形态观察。转染后 3 d 倒置显微镜下观察各组细胞形态变化。
② 实时荧光定量 PCR 检测 P75NTR 基因表达。取转染后 4 d 各组细胞，按试剂盒说明书提取总 RNA 并逆转录合成 cDNA。采用 Primer 5.0 设计软件设计引物，引物序列见表 1。反应体系：10×buffer1 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）0.8 μL、Taq Polymerase 0.2 μL、上下游引物各 0.4 μL、Template 1 μL，加入双蒸水至 20 μL。反应条件：94℃、30 s；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，72℃、6 min，循环 30 次。采用 2△△Ct法计算 P75NTR mRNA 相对表达量，计算 siRNA-1 组、siRNA-2 组及 siRNA-3 组的抑制率，观察沉默效果；抑制率=（空白对照组测量值−siRNA 组测量值）/空白对照组测量值×100%。
表1
实时荧光定量 PCR 基因引物序列及产物大小
Table1.
Gene primer sequence and product size in real-time fluorescent quatitative PCR
③ Western blot 检测 P75NTR 蛋白表达。取转染后 6 d 各组细胞，提取蛋白样品，BCA 法测定蛋白浓度；配置 10% 丙烯酰胺凝胶，上样；电泳液中电泳后转膜，置于 5% 牛奶中封闭；加入 P75NTR 一抗工作液（1∶1 000），4℃ 孵育过夜；加入二抗（1∶8 000）室温孵育 1 h；洗膜 3 次后加入发光工作液，凝胶成像仪中显像；用 Image J 灰度分析软件分析条带灰度值，以与内参（GAPDH）灰度值比值作为 P75NTR 蛋白表达相对量。同上法计算 siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组的抑制率，观察沉默效果。
结合上述两项检测结果，选取沉默效果最佳 P75NTR-siRNA 进行后续实验。
1.3 沉默 P75NTR 基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响
1.3.1 实验分组
取本课题组前期研究培养、鉴定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，随机分为 3 组，分别为慢病毒介导 P75NTR 沉默组（实验组）、阴性对照组、空白对照组。空白对照组为正常培养 BMSCs；阴性对照组及实验组分别采用 NC-siRNA 及筛选的 P75NTR-siRNA 慢病毒载体转染 BMSCs，转染方法同 1.2.2，取转染 4 d 细胞进行以下观测。
1.3.2 MTT 法检测细胞增殖情况
将各组 BMSCs 接种于 96 孔板中，每孔 5×103个细胞，每组 3 个复孔。用含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培养基培养细胞，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。培养 1～8 d 各组取 3 孔，继续培养 4 h 后弃上清，每孔加入 DMSO 震荡 10 min，采用酶标仪于 490 nm 波长处检测吸光度（A）值，绘制细胞增殖曲线。
1.3.3 BMSCs 成骨诱导分化培养及检测
① 成骨诱导分化培养：取各组 BMSCs 采用 EDTA-胰蛋白酶消化后，以 2×104个/L 密度接种于 6 孔板，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培养基 1 mL，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。待细胞生长融合达 60%～70% 后吸弃培养液，加入含地塞米松 0.1 μmol/L、维生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸钠 10 mmol/L 的成骨诱导分化完全培养基继续培养，每 3 天更换 1 次培养基。
② Western blot 检测 OCN 及 Runx2 蛋白表达：诱导培养 3 d，参照 1.2.2 方法检测各组细胞 OCN、Runx2 蛋白相对表达量。
③ 免疫组织化学染色观察：诱导培养 7 d，将各组细胞接种于预置盖玻片的培养皿进行细胞爬片，每个培养皿接种 4×104 个细胞，3 d 后行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。倒置显微镜下观察细胞质内有棕黄色颗粒为阳性染色，随机选取 5 个视野，用 Image-Pro Plus 图像采集分析系统计算Ⅰ型胶原蛋白灰度值，即Ⅰ型胶原蛋白表达量。
④ ALP 检测成骨分化情况：诱导培养 7、10、14 d，分别取各组细胞上清液，参照 ALP 检测试剂盒说明书检测 ALP 活力。
⑤ 茜素红染色检测矿化结节形成情况：诱导培养 7、14 d，取各组细胞吸弃成骨诱导分化培养基，PBS 冲洗 2 次，每孔加入 2 mL 4%多聚甲醛溶液，固定 30 min；吸弃多聚甲醛溶液， PBS 冲洗 2 次，每孔加入茜素红 S 染色液 1 mL，染色 5 min；吸弃染液，PBS 冲洗 3 次。倒置显微镜下观察染色效果。
1.4 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 慢病毒载体筛选
2.1.1 细胞形态观察
倒置显微镜下见各组细胞形态无明显差异，呈长梭形贴壁生长，排列成辐射状。见图 1。
图1
倒置显微镜下观察各组细胞形态（×100）
a. siRNA-1 组；b. siRNA-2 组；c. siRNA-3 组；d. 阴性对照组；e. 空白对照组
Figure1. Cell morphology observation of each group under inverted microscope (×100)a. siRNA-1 group; b. siRNA-2 group; c. siRNA-3 group;d. Negative control group; e. Blank control group
2.1.2 实时荧光定量 PCR 检测
siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组、阴性对照组及空白对照组 P75NTR mRNA 相对表达量分别为 0.613±0.067、0.445±0.133、0.091±0.028、0.970±0.089、0.991±0.071。其中，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组与空白对照组、阴性对照组比较，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组抑制率分别为 38.1%±5.2%、55.1%±7.9%、90.8%±4.1%。
2.1.3 Western blot 检测
siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组、阴性对照组及空白对照组 P75NTR 蛋白相对表达量分别为 0.244±0.028、0.192±0.017、0.040±0.012、0.391±0.023、0.412±0.013。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组与空白对照组、阴性对照组比较，siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。siRNA-1 组、siRNA-2 组、siRNA-3 组抑制率分别为 40.8%±5.7%、53.4%±4.3%、90.3%±4.6%。见图 2。
图2
Western blot 检测各组 P75NTR 蛋白表达水平
Mr：相对分子质量 1：空白对照组 2：阴性对照组 3：siRNA-1 组 4：siRNA-2 组 5：siRNA-3 组
Figure2. Expression of P75NTR protein in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: siRNA-1 group 4: siRNA-2 group 5: siRNA-3 group
结合实时荧光定量 PCR 及 Western blot 检测结果，P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳，选择其进行后续实验。
2.2 沉默 P75NTR 基因对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响
2.2.1 MTT 法检测细胞增殖情况
随培养时间延长，3 组 BMSCs 数量均逐渐增加。与阴性对照组和空白对照组相比，实验组细胞增殖明显加快；从 3 d 开始实验组 A 值明显高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
MTT 法检测各组细胞增殖
Figure3.
Cell proliferation of each group detected by MTT assay
2.2.2 Western blot 检测细胞 OCN 及 Runx2 蛋白表达
实验组、阴性对照组及空白对照组 OCN 蛋白相对表达量分别为 1.113±0.204、0.611±0.181、0.605±0.113，Runx2 蛋白相对表达量分别为 1.793±0.190、0.967±0.314、0.918±0.261。实验组 OCN 及 Runx2 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组及空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测各组细胞 OCN 及 Runx2 蛋白表达水平 Mr：相对分子质量 1：空白对照组 2：阴性对照组 3：实验组
Figure4.
Expressions of OCN and Runx2 proteins in cells of each group detected by Western blot
Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: Experimental group
2.2.3 免疫组织化学染色观察 Ⅰ 型胶原表达
镜下观察各组细胞质内均可见棕黄色颗粒，实验组染色程度强于空白对照组及阴性对照组，空白对照组与阴性对照组无明显差异。见图 5。Ⅰ 型胶原蛋白表达量空白对照组为 18.64±3.12、阳性对照组为 19.12±4.09、实验组为 39.78±7.34。实验组明显高于其他两组，差异有统计学意义（P<0.05）；阳性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图5
各组免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×200）
a. 空白对照组；b. 阴性对照组；c. 实验组
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Negative control group; c. Experimental group
2.2.4 ALP 活力检测
随时间延长，各组细胞 ALP 活力均逐渐升高，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。各时间点，实验组 ALP 活力均较空白对照组和阴性对照组增高，差异有统计学意义（P<0.05）；空白对照组和阳性对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各时间点各组 ALP 活力比较（n=3，）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=3, )
2.2.5 茜素红染色
成骨诱导培养 7 d，空白对照组及阴性对照组仅有极少红色结节形成，实验组可见较多红色结节。14 d 时，空白对照组及阳性对照组仍为少量红色结节，而实验组出现大量红色结节。见图 6。
图6
各组茜素红染色观察（倒置显微镜×100）
从左至右分别为空白对照组、阴性对照组、实验组 a. 成骨诱导 7 d；b. 成骨诱导 14 d
Figure6. Alizarin red staining observation of each group (Inverted microscope×100)From left to right for blank control group, negative control group, and experimental group, respectively a. Osteogenic induction for 7 days; b. Osteogenic induction for 14 days
3 讨论
本课题组前期 P75NTR 与骨缺损相关性研究发现，P75NTR 在骨折不愈合处明显高表达[4]。为了进一步研究 P75NTR 在骨缺损中的作用，本次研究采用大鼠 BMSCs，以 siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因后，观察细胞成骨分化能力的变化。结果显示，P75NTR 基因沉默后，大鼠 BMSCs 中的Ⅰ型胶原蛋白形成、ALP 活力、矿化结节形成能力均明显提高，说明 P75NTR 基因沉默可增强大鼠 BMSCs 成骨分化能力。据此反向推理，P75NTR 基因表达上调可能使 BMSCs 增殖及成骨分化能力减弱，这可能是骨缺损发生的分子机制之一。
研究表明，NGF 的前体物质 pro-NGF 通过与 P75NTR 结合可以诱导细胞凋亡、抑制分化，但 NGF 与 P75NTR 结合可以发挥完全相反作用，诱导细胞增殖与分化，从而挽救受损的细胞[13-14]。目前，有关研究报道 P75NTR 参与的信号通路主要包括神经酰胺通路、JNK-p53-Bax 凋亡通路及 NF-κB 通路。结合本次研究结果，我们认为在神经酰胺通路中，沉默 P75NTR 基因后使得位于浆膜内表面的神经鞘磷脂、神经鞘磷脂酶不能被激活，从而不能生成足够的神经酰胺，进而阻断 JNK 通路引起的 BMSCs 凋亡，细胞增殖与凋亡的微环境失衡使 BMSCs 显示较强的增殖活性。另一方面，沉默 P75NTR 基因后启动核因子 NF-κB 通路，促进 BMSCs 增殖与分化。NGF 可以通过 P75NTR 与细胞内近端的 TRAF6 蛋白结合，启动 IKK（IkB kinases）和 ERK 的降解，激活 NF-κB 通路。本研究中沉默 P75NTR 基因促进 BMSCs 增殖分化，可能是存在竞争性抑制的结果，即表达量的不同可产生不同的竞争效应（pro-NGF 与 NGF 竞争性结合不同表达量 P75NTR 引起不同效应）。正常水平的 P75NTR 与 pro-NGF 结合占优势；P75NTR 水平下调后，则与 NGF 结合占优势，从而使 BMSCs 增殖分化。此外，由于在 NF-κB 通路中 P75NTR 和 TrkA 有共同作用，TrkA 与 She 相结合也能启动 IKK 和 ERK 通路激活 NF-κB 通路[15-16]，所以下调 P75NTR 水平后，TrkA 是否有可能由于代偿性作用直接与 NGF 存在联系，促进 BMSCs 的增殖与分化，有待进一步实验验证。
P75NTR 的复杂空间结构决定了其在细胞中具有独特而重要的生物学效应。结合本次研究结果，我们认为下一步可以通过沉默 P75NTR 基因并联合 NGF 过表达转染 BMSCs 后植入骨缺损处，提高 NGF 水平，关闭 P75NTR 凋亡通道，从而修复骨缺损，这可能为骨组织工程修复骨缺损提供新思路。值得注意的是，本研究沉默 P75NTR 基因表达可促进大鼠 BMSCs 的成骨分化仅是体外细胞实验，而骨缺损的形成是一个多因素参与过程，对于不同动物细胞、细胞种类、甚至细胞状态等混杂因素都需要进一步实验论证。对于 P75NTR 在骨组织修复方面所表现的双重作用通路机制[1]，也需要更深入研究。
作者贡献：贝朝涌负责实验设计；王宁、陈俊毅负责实验实施；陈西淼、朱伦井、段江涛负责文献查询及实验评价；王烨负责实验结果收集整理；王宁负责实验结果统计分析及文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准（GLMC201805018）。
