引用本文： 张栋, 宗宪磊, 郭小双, 杜宏, 宋国栋, 靳小雷. 不同烧结温度对双相钙磷陶瓷颗粒材料介孔结构及其成骨性能的影响. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(1): 95-103. doi: 10.7507/1002-1892.202007074 复制
由外伤、肿瘤、先天性畸形、手术等多种因素导致的骨缺损和骨不连临床较常见，治疗方案包括自体骨移植、同种异体骨移植、异种异体骨移植、人工合成生物材料植入等。其中自体骨移植被认为是治疗骨缺损的“金标准”[1-2]，但存在供骨量有限、供区损伤及感染等缺陷；同种及异种异体骨移植也存在潜在疾病传染、血管化程度差、免疫排斥等风险。因此，使用优质人工合成生物材料逐渐成为治疗骨缺损的热点。
磷酸钙（cacium phosphate，CaP）类材料主要包括羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）、双相钙磷陶瓷（biphasic calcium phosphate，BCP）和磷酸钙类骨水泥等[3]。因其与人体自身骨组织的无机成分磷灰石相似，具备不同程度的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，成为颌面外科骨缺损和骨修复的研究热点[4-5]。但是目前人工合成的 CaP 类材料组分和微结构往往与人骨磷灰石存在差异，不同 CaP 材料的成骨能力差异显著。其中将两种 CaP 材料按不同比例混合制备的 BCP 材料，能有效避免单一材料强度低、降解变异大的缺陷，实现更为优异的骨传导性、骨诱导性[4, 6-7]，具备巨大临床应用潜力[8-10]。
BMSCs 是一种在骨髓基质中广泛存在且具有多向分化潜能的细胞，在不同条件下经诱导可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等不同细胞系。既往研究利用动物机体作为生物反应器构建人工骨，通过将 BCP 材料植入比格犬背部，证实 BMSCs 作为干细胞参与了 BCP 材料的异位诱导成骨[6]。本课题组前期研究[8]在体外将 BMSCs 与 BCP 材料共培养，ALP 分泌显著升高，提示 BCP 材料能够显著提高 BMSCs 的成骨分化潜能。实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测结果显示，随着共培养时间延长，成骨相关基因骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ 型胶原蛋白、Runx2 表达水平逐步上升；而加入了成骨信号通路抑制剂（RO4929097）的组别，成骨相关基因表达水平均明显下降。证实将 BMSCs 与 BCP 材料共培养，在早期可上调成骨信号通路相关基因表达，从而促进其骨向分化。同时，大量研究证实 BCP 材料的配比和宏观结构不同，会导致成骨效果差异显著[4-5]；但微观结构，尤其是介孔直径等具体参数对成骨效果的影响，目前研究尚无明确结论。
BCP 材料在不同温度下烧结，会形成不同的微观结构，其中介孔直径会随温度不同而产生差异[11]。基于此，本研究设计在 3 种温度下烧制 3 种不同介孔直径的颗粒状 BCP 材料，通过体内外实验检测其成骨能力的差异。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄雌性 SD 大鼠 5 只，体质量 180～230 g；1 岁龄比格犬 9 只，雌雄不限，体质量 12～14 kg；由中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院提供。
α-MEM 培养基、FBS（GIBCO 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8），Masson、番红固绿及 HE 染色试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德国）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。扫描电镜（FEI 公司，美国）；转盘式激光共聚焦显微镜（Olympus 公司，日本）。
1.2 材料的生物相容性评价
1.2.1 BCP 的制备及评估
将 HA 与 β-TCP 以 8∶2 比例混合，分别在 1 050、1 150 及 1 250℃ 下烧制 3 h 制备 3 种 BCP 材料（分别设为材料 1、2、3），材料孔隙率设计为 60%～70%。将 3 种材料打磨成直径 2 mm 的细颗粒。采用比表面积测试法（Brunauer-Emmett-Teller test，BET）测量材料颗粒内部孔隙率及介孔直径、体积、面积，X 线衍射（X-ray diffraction、XRD）评估材料组成成分，扫描电镜观察材料微观表面形态。每种材料送检样本约 1 g，BET 检测数据为整体样本的均数。材料的制备及评估均于四川大学生物材料工程研究中心完成。
1.2.2 材料与大鼠 BMSCs 共培养
取 4 周龄 SD 大鼠断颈处死后获取股骨，针管抽取 5 mL 含 10%FBS 的 α-MEM 培养基将骨髓冲出并接种于 10 cm 培养皿，静置 48 h 后换液；将获得的贴壁细胞每 3～5 天传代，培养至第 3 代备用。将 BCP 材料 1、2、3 置于 24 孔板底，分别设为 A、B、C 组，每组 4 孔，覆盖 75% 孔底部面积，先后以 PBS 液、无血清 α-MEM 培养基、含 10%FBS 的 α-MEM 培养基反复浸泡各 24 h；然后与第 3 代 BMSCs（1×105个/mL）共培养。
1.2.3 观测指标
① 扫描电镜观察：材料与 BMSCs 共培养 7 d 后，加 2% 戊二醛固定 24～48 h，梯度乙醇脱水后乙酸异戊酯置换 2 次，常规 CO2 临界干燥器干燥、真空条件下喷溅铂金离子，扫描电镜观察细胞黏附情况。② 鬼笔环肽染色：采用 24 孔板进行实验，3 种 BCP 材料分别与 BMSCs 共培养 7 d 后，进行鬼笔环肽染色，使用转盘式激光共聚焦显微镜观察 BMSCs 贴附于材料表面后的形态。③ CCK-8 法检测细胞增殖活性：采用 96 孔板进行实验，同上法将 BMSCs 分别接种于 3 组 BCP 材料（A、B、C 组），另设单纯 BMSCs 作为空白对照组（D 组），每组 5 个复孔。培养 1、3、5、7、9 d 采用 CCK-8 法测量 450 nm 波长下吸光度（A）值。
1.3 动物体内实验评价材料成骨能力
1.3.1 比格犬异位成骨分组及模型构建
取 9 只 1 岁龄比格犬，肌肉注射舒泰（0.50～0.55 mg/kg）、阿托品 1 mL、速眠新 0.5 mL 麻醉后，常规备皮消毒，于背部正中切开长约 10 cm 切口，在每只犬双侧竖脊肌内均匀制作 9 个直径约 2 cm、深度约 3 cm 的肌袋。将 9 个肌袋随机分为 3 组，每组 3 个肌袋，A、B、C 组肌袋内分别置入 1 g 材料 1、2、3，然后逐层关闭切口。术中及术后 3 d 每日予以青霉素 80 万 U 肌肉注射预防感染。
1.3.2 HE、Masson 及番红固绿染色
分别于术后 1、2、3 个月随机同上法麻醉 3 只比格犬，切取肌袋内包埋的材料，观察大体形态；每组每时间点共 9 个标本，随机选取其中 4 个标本，经 4% 多聚甲醛固定后常规制备 4 μm 厚切片，行 HE、Masson 及番红固绿染色观察。于放大 10 倍的 Masson 染色切片中每张随机取 3 个视野，采用 Image J 软件测量并按以下公式计算 BCP 间隙中的成骨面积比，成骨面积比=BCP 间隙骨组织面积/BCP 间隙面积×100%。
1.3.3 qRT-PCR 检测
分别于术后 1、2、3 个月同上法取材，根据 RNA 提取试剂盒说明提取材料中心位置区域的 RNA，取 1 000 ng RNA 按逆转录试剂盒说明逆转录为 cDNA。使用 Primer 6 软件设计引物序列（表 1），由北京擎科生物科技有限公司合成。通过 Roche 480 系统完成 qRT-PCR 检测，采用 2−ΔΔCt 法计算各成骨相关基因［ALP、OPN、骨钙素（osteocalcin，OC）］mRNA 相对表达量。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of each gene in qRT-PCR
1.4 统计学方法
采用 SPSS23.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准取双侧 α=0.05。
2 结果
2.1 材料的生物相容性评价
2.1.1 BCP 材料评估
① 大体观察：3 种材料均为直径约 2 mm 的白色颗粒，随烧结温度增加，材料直径无区别，颜色均匀一致。见图 1。② BET 检测：随烧结温度增加，颗粒内部孔隙率无明显变化，但介孔直径、体积及面积逐渐减小。见表 2。③ XRD 检测：3 种材料均可见 HA 及 β-TCP 两种 X 线衍射波。见图 2。④ 扫描电镜观察：BCP 表面广泛分布微孔，3 种材料的微孔直径较为相近，材料表面及内部的微孔之间均可见孔径不一的连通孔道，孔壁粗糙不平，3 种材料间无明显差异。见图 3。
图1
3 种 BCP 材料大体观察
从左至右分别为材料 1、2、3
Figure1. General observation of 3 kinds of BCPsFrom left to right for materials 1, 2, and 3, respectively
表2
3 种 BCP 材料 BET 检测参数
Table2.
Parameters of 3 BCPs detected by BET
图2
3 种 BCP 材料 XRD 检测
a. 材料 1；b. 材料 2；c. 材料 3
Figure2. XRD detection of 3 BCPsa. Material 1; b. Material 2; c. Material 3
图3
3 种 BCP 材料扫描电镜观察（×300）
黑箭头示微孔，红箭头示孔间相连的孔道 a. 材料 1；b. 材料 2；c. 材料 3
Figure3. SEM observation of 3 kinds of BCPs (×300)Black arrow indicated macropores, red arrow indicated pores connecting holes a. Material 1; b. Material 2; c. Material 3
2.1.2 材料生物相容性评价
① 扫描电镜观察：BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后，可见细胞大量贴附于孔壁上，多伸出伪足，形态不规则，3 种材料间无明显区别。见图 4。② 鬼笔环肽染色：转盘式激光共聚焦显微镜观察示，3 组均有大量细胞贴敷于 BCP 材料表面的孔壁，细胞形态因材料表面不平整而变化多样，3 种材料间无明显区别。见图 5。③ CCK-8 法检测细胞增殖活性：随着共培养时间延长，各组细胞增殖活性均逐渐增加，于 7 d 时达峰值，后逐渐下降。培养 3、5、7、9 d，D 组 A 值显著高于其余各组，A 组 A 值显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；7、9 d 时 C 组 A 值显著高于 B 组，差异有统计学意义（P< 0.05）。见图 6。
图4
BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后扫描电镜观察（×2 000）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure4. SEM observation of BMSCs and BCPs at 7 days after co-culture (×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图5
BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后鬼笔环肽及 DAPI 染色观察（转盘式激光共聚焦显微镜×200）
绿色示肌动蛋白，蓝色示细胞核a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Phalloidin and DAPI staining of BMSCs and BCPs at 7 days after co-culture (Rotary confocal laser microscope×200)Green staining indicated the actin, blue staining indicated the nuclei a. Group A; b. Group B; c. Group C
图6
CCK-8 法检测细胞增殖活性
Figure6.
Cell proliferation detected by CCK-8 assay
2.2 动物体内实验评价材料成骨能力
2.2.1 大体观察
术后 1、2、3 个月各组取材大体观察显示形态相似，材料植入后在肌肉挤压作用下呈现扁团状，被多层纤维组织包膜紧密包裹。见图 7。
图7
B 组术后异位成骨材料大体观察
从左至右分别为术后 1、2、3 个月
Figure7. General observation of ectopic osteogenesis of group BFrom left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively2.2.2 HE、Masson 及番红固绿染色
术后 1 个月，纤维组织及血管样组织开始逐步沉积于颗粒材料的间隙，此时新生骨样组织较少；术后 2 个月，在 3 组 BCP 材料边缘区域均可见明显的骨样组织沉积，材料之间缝隙的中心区域可见纤维组织及新生血管；术后 3 个月，颗粒间隙内可见广泛新生骨样组织。见图 8～10。
图8
术后各时间点各组 HE 染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. HE staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
图9
术后各时间点各组 Masson 染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure9. Masson staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
图10
术后各时间点各组番红固绿染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure10. Safranin green staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
术后随时间延长，各组成骨面积比均呈逐渐上升趋势。术后 2、3 个月 A 组成骨面积比显著高于 B、C 组，1 个月时显著高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后各时间点 B、C 组间比较成骨面积比，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 11。
图11
术后各时间点各组成骨面积比比较
Figure11.
Comparison of the bone formation area ratio of each group at each time point after operation
2.2.3 qRT-PCR 检测
随术后时间延长，A 组各基因 mRNA 相对表达量呈先增高后下降趋势，于 2 个月时达峰值；B、C 组各基因 mRNA 相对表达量均逐渐增高。术后 1 个月 A 组 ALP 和 OPN mRNA 相对表达量显著高于 B、C 组，术后 2 个月 A 组 OC mRNA 相对表达量显著高于 B、C 组，术后 3 个月 B、C 组 ALP mRNA 相对表达量及 B 组 OPN mRNA 相对表达量显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各时间点各组间比较各基因 mRNA 相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 12。
图12
术后各时间点各组 qRT-PCR 检测各成骨相关基因 mRNA 相对表达量比较
a. ALP；b. OC；c. OPN
Figure12. Comparison of the relative expressions of osteogenic related genes detected by qRT-PCR in each group at each time point after implantationa. ALP; b. OC; c. OPN
3 讨论
颅颌面部的骨缺损不仅导致患者面部不对称、偏颌、局部严重凹陷、颞下颌运动受限及咀嚼功能丧失等形态和功能障碍[12]，还会影响患者心理状态，给日常生活和社交带来不利影响[13]。应用手术进行局部骨的自体骨移植和生物相容性材料填充，是目前主要治疗方案[14-15]。BCP 是颅颌面外科目前最常用的修复材料，将 HA 及 β-TCP 以不同比例混合烧制的 BCP，可以融合 HA 及 β-TCP 的骨传导性、骨诱导性、生物相容性、降解性可控等优点，改善单一材料机械强度低、降解性不合理的缺点，成骨效果显著，得到了广泛认可[5]。但 BCP 材料介导产生的新骨大多难以充分地填充植入材料与自体骨组织之间的空隙[3]，导致 BCP 材料应用受到极大限制。因此，对 BCP 材料的宏观和微观结构进行研究和改进，成为当前研究热点。
目前在宏观结构方面，关于 HA/β-TCP 的最优比例尚无统一结论[16]。研究表明，BCP 的物理化学特性，如 HA/β-TCP 比例、材料大体直径、孔隙率和孔隙直径等因素，显著影响材料的成骨能力、生物相容性及材料降解性[17]。为了增加材料植入后与周围组织的接触面积，对材料与自体骨之间的间隙充分利用[3]，我们设计了直径均为 2 mm 的颗粒状材料，可以灵活应用于复杂及形态不规则骨缺损空间。微观结构方面，研究表明，基于不同烧结温度能够制备不同介孔结构的 BCP 材料[11]。本研究在 1 050、1 150 及 1 250℃ 3 种温度下烧结制作了 3 种 HA/β-TCP 比例一致（8∶2）、材料微孔直径相近、具备不同介孔直径的 BCP 材料。CCK-8 法细胞增殖实验显示，不同介孔直径的 BCP 材料与 BMSCs 的生物相容性差异巨大，介孔直径 12.57 nm 的材料 1 对细胞增殖造成了明显抑制；尽管如此，扫描电镜依然可以观察到 BMSCs 均能在 3 种 BCP 材料表面良好地贴敷和生长，并且呈多边不规则形，伸展出可牢固贴附的伪足。
3 种 BCP 颗粒材料包埋于比格犬竖脊肌肌袋 2 个月后，材料缝隙间可见明显骨样组织沉积，此时开始出现成骨差异，在体外实验中生物相容性表现最差的 A 组材料，成骨面积比却显著高于其余两组；尽管 3 个月时 B、C 组成骨面积比有所增加，但仍显著低于 A 组。3 种材料随着置入时间延长，成骨面积比均稳步升高，从整体趋势看，成骨是一个缓慢持续且较为稳定的过程，介孔直径更大的材料其成骨性能在异位成骨模型中表现更好。qRT-PCR 检测示，A 组 ALP、OC 及 OPN 基因表达在2 个月时达高峰，之后平稳回落；B 组 3 种成骨相关基因表达整体上略高于 C 组，但两组间差异并无统计学意义。尽管随时间推移 3 组材料的基因表达水平均较植入初期明显升高，但 A 组基因上调时间最早，达到基因表达高峰的时间最短，这与组织学检测得出的成骨面积比表达规律一致。
本研究结果提示：1 050℃ 温度烧结的 BCP 材料成骨效果优于其余两组可能是暂时的，因为其余两组成骨相关基因的表达仍在持续上调，其成骨效率尚未达到峰值，因此还需要更长时间观测以评估各材料的整体成骨性能。1 050℃ 温度烧结的 BCP 材料生物相容性最差，但成骨性能最佳，是因为体内环境充足的血供和细胞来源为 BCP 的成骨提供了良好基础，提示我们在后期临床应用中，应充分考虑材料植入区域的血供条件。介孔直径对材料成骨效果产生的诸多影响，其机制目前尚不明确，并不是所有 BCP 材料都能展现出明显的异位成骨能力。有研究证实介孔直径小、比表面积很低的材料甚至不会有成骨发生[18]，还有研究证实孔隙率约为 60% 的材料能够为骨组织提供充分的生长空间[19]，并认为在充足的孔隙内保持稳定新陈代谢的原因是植入物内充足的体液浸润[18, 20]。在此基础上，介孔的存在为局部环境提供了丰富的钙、磷离子[21]，当浓度达到了过饱和水平，丰富的钙、磷离子足以形成生物磷灰石层，进一步产生了成骨现象[22]。因此可以推测，本研究中的 3 种 BCP 材料在其整体结构能够提供一可靠空间支撑的前提下，不同介孔直径导致材料表层产生了不同程度的钙、磷离子，该过程不会太快，但稳定而持续，所以成骨面积比随时间延长逐步升高。介孔直径作为一个重要参数，可调节局部钙、磷离子水平，维持生物磷灰石层稳定。在一定介孔直径范围内，直径较大的材料能够生成更稳定的生物磷灰石层，具备更早、更快成骨的能力。
综上述，本研究成功制备了 3 种不同介孔直径的 BCP 材料，尽管其生物相容性存在显著差异，但是 BMSCs 均可在材料表面贴附和增殖；动物体内实验表明在充足血供和良好成骨环境中，介孔直径较大的 BCP 材料能够展现出更强的成骨能力。介孔直径作为一个可以调控的指标，可在 BCP 制备过程中作为有效参数，实现 BCP 材料的优化和升级。
志谢：感谢四川大学生物材料工程研究中心提供制作 3 种 BCP 颗粒材料的技术支持。
作者贡献：张栋负责实验设计及实施、数据收集整理、统计分析以及论文撰写；宗宪磊对文章的知识性内容作批评性审阅；郭小双、杜宏参与实验实施，包括动物的体内实验、标本取材及检测；宋国栋、靳小雷参与文章科研设计及讨论部分的分析，对文章整体的知识性内容作批评性审阅及支持性贡献。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：本研究经中国医学科学院整形外科医院实验动物伦理委员会批准［（2014）注册第（10）号］。实验动物使用许可证号 ：SYXK（京）2020-0018。
由外伤、肿瘤、先天性畸形、手术等多种因素导致的骨缺损和骨不连临床较常见，治疗方案包括自体骨移植、同种异体骨移植、异种异体骨移植、人工合成生物材料植入等。其中自体骨移植被认为是治疗骨缺损的“金标准”[1-2]，但存在供骨量有限、供区损伤及感染等缺陷；同种及异种异体骨移植也存在潜在疾病传染、血管化程度差、免疫排斥等风险。因此，使用优质人工合成生物材料逐渐成为治疗骨缺损的热点。
磷酸钙（cacium phosphate，CaP）类材料主要包括羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）、双相钙磷陶瓷（biphasic calcium phosphate，BCP）和磷酸钙类骨水泥等[3]。因其与人体自身骨组织的无机成分磷灰石相似，具备不同程度的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，成为颌面外科骨缺损和骨修复的研究热点[4-5]。但是目前人工合成的 CaP 类材料组分和微结构往往与人骨磷灰石存在差异，不同 CaP 材料的成骨能力差异显著。其中将两种 CaP 材料按不同比例混合制备的 BCP 材料，能有效避免单一材料强度低、降解变异大的缺陷，实现更为优异的骨传导性、骨诱导性[4, 6-7]，具备巨大临床应用潜力[8-10]。
BMSCs 是一种在骨髓基质中广泛存在且具有多向分化潜能的细胞，在不同条件下经诱导可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等不同细胞系。既往研究利用动物机体作为生物反应器构建人工骨，通过将 BCP 材料植入比格犬背部，证实 BMSCs 作为干细胞参与了 BCP 材料的异位诱导成骨[6]。本课题组前期研究[8]在体外将 BMSCs 与 BCP 材料共培养，ALP 分泌显著升高，提示 BCP 材料能够显著提高 BMSCs 的成骨分化潜能。实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测结果显示，随着共培养时间延长，成骨相关基因骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ 型胶原蛋白、Runx2 表达水平逐步上升；而加入了成骨信号通路抑制剂（RO4929097）的组别，成骨相关基因表达水平均明显下降。证实将 BMSCs 与 BCP 材料共培养，在早期可上调成骨信号通路相关基因表达，从而促进其骨向分化。同时，大量研究证实 BCP 材料的配比和宏观结构不同，会导致成骨效果差异显著[4-5]；但微观结构，尤其是介孔直径等具体参数对成骨效果的影响，目前研究尚无明确结论。
BCP 材料在不同温度下烧结，会形成不同的微观结构，其中介孔直径会随温度不同而产生差异[11]。基于此，本研究设计在 3 种温度下烧制 3 种不同介孔直径的颗粒状 BCP 材料，通过体内外实验检测其成骨能力的差异。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄雌性 SD 大鼠 5 只，体质量 180～230 g；1 岁龄比格犬 9 只，雌雄不限，体质量 12～14 kg；由中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院提供。
α-MEM 培养基、FBS（GIBCO 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8），Masson、番红固绿及 HE 染色试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德国）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。扫描电镜（FEI 公司，美国）；转盘式激光共聚焦显微镜（Olympus 公司，日本）。
1.2 材料的生物相容性评价
1.2.1 BCP 的制备及评估
将 HA 与 β-TCP 以 8∶2 比例混合，分别在 1 050、1 150 及 1 250℃ 下烧制 3 h 制备 3 种 BCP 材料（分别设为材料 1、2、3），材料孔隙率设计为 60%～70%。将 3 种材料打磨成直径 2 mm 的细颗粒。采用比表面积测试法（Brunauer-Emmett-Teller test，BET）测量材料颗粒内部孔隙率及介孔直径、体积、面积，X 线衍射（X-ray diffraction、XRD）评估材料组成成分，扫描电镜观察材料微观表面形态。每种材料送检样本约 1 g，BET 检测数据为整体样本的均数。材料的制备及评估均于四川大学生物材料工程研究中心完成。
1.2.2 材料与大鼠 BMSCs 共培养
取 4 周龄 SD 大鼠断颈处死后获取股骨，针管抽取 5 mL 含 10%FBS 的 α-MEM 培养基将骨髓冲出并接种于 10 cm 培养皿，静置 48 h 后换液；将获得的贴壁细胞每 3～5 天传代，培养至第 3 代备用。将 BCP 材料 1、2、3 置于 24 孔板底，分别设为 A、B、C 组，每组 4 孔，覆盖 75% 孔底部面积，先后以 PBS 液、无血清 α-MEM 培养基、含 10%FBS 的 α-MEM 培养基反复浸泡各 24 h；然后与第 3 代 BMSCs（1×105个/mL）共培养。
1.2.3 观测指标
① 扫描电镜观察：材料与 BMSCs 共培养 7 d 后，加 2% 戊二醛固定 24～48 h，梯度乙醇脱水后乙酸异戊酯置换 2 次，常规 CO2 临界干燥器干燥、真空条件下喷溅铂金离子，扫描电镜观察细胞黏附情况。② 鬼笔环肽染色：采用 24 孔板进行实验，3 种 BCP 材料分别与 BMSCs 共培养 7 d 后，进行鬼笔环肽染色，使用转盘式激光共聚焦显微镜观察 BMSCs 贴附于材料表面后的形态。③ CCK-8 法检测细胞增殖活性：采用 96 孔板进行实验，同上法将 BMSCs 分别接种于 3 组 BCP 材料（A、B、C 组），另设单纯 BMSCs 作为空白对照组（D 组），每组 5 个复孔。培养 1、3、5、7、9 d 采用 CCK-8 法测量 450 nm 波长下吸光度（A）值。
1.3 动物体内实验评价材料成骨能力
1.3.1 比格犬异位成骨分组及模型构建
取 9 只 1 岁龄比格犬，肌肉注射舒泰（0.50～0.55 mg/kg）、阿托品 1 mL、速眠新 0.5 mL 麻醉后，常规备皮消毒，于背部正中切开长约 10 cm 切口，在每只犬双侧竖脊肌内均匀制作 9 个直径约 2 cm、深度约 3 cm 的肌袋。将 9 个肌袋随机分为 3 组，每组 3 个肌袋，A、B、C 组肌袋内分别置入 1 g 材料 1、2、3，然后逐层关闭切口。术中及术后 3 d 每日予以青霉素 80 万 U 肌肉注射预防感染。
1.3.2 HE、Masson 及番红固绿染色
分别于术后 1、2、3 个月随机同上法麻醉 3 只比格犬，切取肌袋内包埋的材料，观察大体形态；每组每时间点共 9 个标本，随机选取其中 4 个标本，经 4% 多聚甲醛固定后常规制备 4 μm 厚切片，行 HE、Masson 及番红固绿染色观察。于放大 10 倍的 Masson 染色切片中每张随机取 3 个视野，采用 Image J 软件测量并按以下公式计算 BCP 间隙中的成骨面积比，成骨面积比=BCP 间隙骨组织面积/BCP 间隙面积×100%。
1.3.3 qRT-PCR 检测
分别于术后 1、2、3 个月同上法取材，根据 RNA 提取试剂盒说明提取材料中心位置区域的 RNA，取 1 000 ng RNA 按逆转录试剂盒说明逆转录为 cDNA。使用 Primer 6 软件设计引物序列（表 1），由北京擎科生物科技有限公司合成。通过 Roche 480 系统完成 qRT-PCR 检测，采用 2−ΔΔCt 法计算各成骨相关基因［ALP、OPN、骨钙素（osteocalcin，OC）］mRNA 相对表达量。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of each gene in qRT-PCR
1.4 统计学方法
采用 SPSS23.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准取双侧 α=0.05。
2 结果
2.1 材料的生物相容性评价
2.1.1 BCP 材料评估
① 大体观察：3 种材料均为直径约 2 mm 的白色颗粒，随烧结温度增加，材料直径无区别，颜色均匀一致。见图 1。② BET 检测：随烧结温度增加，颗粒内部孔隙率无明显变化，但介孔直径、体积及面积逐渐减小。见表 2。③ XRD 检测：3 种材料均可见 HA 及 β-TCP 两种 X 线衍射波。见图 2。④ 扫描电镜观察：BCP 表面广泛分布微孔，3 种材料的微孔直径较为相近，材料表面及内部的微孔之间均可见孔径不一的连通孔道，孔壁粗糙不平，3 种材料间无明显差异。见图 3。
图1
3 种 BCP 材料大体观察
从左至右分别为材料 1、2、3
Figure1. General observation of 3 kinds of BCPsFrom left to right for materials 1, 2, and 3, respectively
表2
3 种 BCP 材料 BET 检测参数
Table2.
Parameters of 3 BCPs detected by BET
图2
3 种 BCP 材料 XRD 检测
a. 材料 1；b. 材料 2；c. 材料 3
Figure2. XRD detection of 3 BCPsa. Material 1; b. Material 2; c. Material 3
图3
3 种 BCP 材料扫描电镜观察（×300）
黑箭头示微孔，红箭头示孔间相连的孔道 a. 材料 1；b. 材料 2；c. 材料 3
Figure3. SEM observation of 3 kinds of BCPs (×300)Black arrow indicated macropores, red arrow indicated pores connecting holes a. Material 1; b. Material 2; c. Material 3
2.1.2 材料生物相容性评价
① 扫描电镜观察：BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后，可见细胞大量贴附于孔壁上，多伸出伪足，形态不规则，3 种材料间无明显区别。见图 4。② 鬼笔环肽染色：转盘式激光共聚焦显微镜观察示，3 组均有大量细胞贴敷于 BCP 材料表面的孔壁，细胞形态因材料表面不平整而变化多样，3 种材料间无明显区别。见图 5。③ CCK-8 法检测细胞增殖活性：随着共培养时间延长，各组细胞增殖活性均逐渐增加，于 7 d 时达峰值，后逐渐下降。培养 3、5、7、9 d，D 组 A 值显著高于其余各组，A 组 A 值显著低于其余各组，差异均有统计学意义（P<0.05）；7、9 d 时 C 组 A 值显著高于 B 组，差异有统计学意义（P< 0.05）。见图 6。
图4
BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后扫描电镜观察（×2 000）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure4. SEM observation of BMSCs and BCPs at 7 days after co-culture (×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图5
BMSCs 与 BCP 材料共培养 7 d 后鬼笔环肽及 DAPI 染色观察（转盘式激光共聚焦显微镜×200）
绿色示肌动蛋白，蓝色示细胞核a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Phalloidin and DAPI staining of BMSCs and BCPs at 7 days after co-culture (Rotary confocal laser microscope×200)Green staining indicated the actin, blue staining indicated the nuclei a. Group A; b. Group B; c. Group C
图6
CCK-8 法检测细胞增殖活性
Figure6.
Cell proliferation detected by CCK-8 assay
2.2 动物体内实验评价材料成骨能力
2.2.1 大体观察
术后 1、2、3 个月各组取材大体观察显示形态相似，材料植入后在肌肉挤压作用下呈现扁团状，被多层纤维组织包膜紧密包裹。见图 7。
图7
B 组术后异位成骨材料大体观察
从左至右分别为术后 1、2、3 个月
Figure7. General observation of ectopic osteogenesis of group BFrom left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively2.2.2 HE、Masson 及番红固绿染色
术后 1 个月，纤维组织及血管样组织开始逐步沉积于颗粒材料的间隙，此时新生骨样组织较少；术后 2 个月，在 3 组 BCP 材料边缘区域均可见明显的骨样组织沉积，材料之间缝隙的中心区域可见纤维组织及新生血管；术后 3 个月，颗粒间隙内可见广泛新生骨样组织。见图 8～10。
图8
术后各时间点各组 HE 染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. HE staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
图9
术后各时间点各组 Masson 染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure9. Masson staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
图10
术后各时间点各组番红固绿染色观察（×10）
从左至右分别为术后 1、2、3 个月 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure10. Safranin green staining of each group at each time point after implantation (×10)From left to right for 1, 2, and 3 months after implantation, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
术后随时间延长，各组成骨面积比均呈逐渐上升趋势。术后 2、3 个月 A 组成骨面积比显著高于 B、C 组，1 个月时显著高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后各时间点 B、C 组间比较成骨面积比，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 11。
图11
术后各时间点各组成骨面积比比较
Figure11.
Comparison of the bone formation area ratio of each group at each time point after operation
2.2.3 qRT-PCR 检测
随术后时间延长，A 组各基因 mRNA 相对表达量呈先增高后下降趋势，于 2 个月时达峰值；B、C 组各基因 mRNA 相对表达量均逐渐增高。术后 1 个月 A 组 ALP 和 OPN mRNA 相对表达量显著高于 B、C 组，术后 2 个月 A 组 OC mRNA 相对表达量显著高于 B、C 组，术后 3 个月 B、C 组 ALP mRNA 相对表达量及 B 组 OPN mRNA 相对表达量显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各时间点各组间比较各基因 mRNA 相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 12。
图12
术后各时间点各组 qRT-PCR 检测各成骨相关基因 mRNA 相对表达量比较
a. ALP；b. OC；c. OPN
Figure12. Comparison of the relative expressions of osteogenic related genes detected by qRT-PCR in each group at each time point after implantationa. ALP; b. OC; c. OPN
3 讨论
颅颌面部的骨缺损不仅导致患者面部不对称、偏颌、局部严重凹陷、颞下颌运动受限及咀嚼功能丧失等形态和功能障碍[12]，还会影响患者心理状态，给日常生活和社交带来不利影响[13]。应用手术进行局部骨的自体骨移植和生物相容性材料填充，是目前主要治疗方案[14-15]。BCP 是颅颌面外科目前最常用的修复材料，将 HA 及 β-TCP 以不同比例混合烧制的 BCP，可以融合 HA 及 β-TCP 的骨传导性、骨诱导性、生物相容性、降解性可控等优点，改善单一材料机械强度低、降解性不合理的缺点，成骨效果显著，得到了广泛认可[5]。但 BCP 材料介导产生的新骨大多难以充分地填充植入材料与自体骨组织之间的空隙[3]，导致 BCP 材料应用受到极大限制。因此，对 BCP 材料的宏观和微观结构进行研究和改进，成为当前研究热点。
目前在宏观结构方面，关于 HA/β-TCP 的最优比例尚无统一结论[16]。研究表明，BCP 的物理化学特性，如 HA/β-TCP 比例、材料大体直径、孔隙率和孔隙直径等因素，显著影响材料的成骨能力、生物相容性及材料降解性[17]。为了增加材料植入后与周围组织的接触面积，对材料与自体骨之间的间隙充分利用[3]，我们设计了直径均为 2 mm 的颗粒状材料，可以灵活应用于复杂及形态不规则骨缺损空间。微观结构方面，研究表明，基于不同烧结温度能够制备不同介孔结构的 BCP 材料[11]。本研究在 1 050、1 150 及 1 250℃ 3 种温度下烧结制作了 3 种 HA/β-TCP 比例一致（8∶2）、材料微孔直径相近、具备不同介孔直径的 BCP 材料。CCK-8 法细胞增殖实验显示，不同介孔直径的 BCP 材料与 BMSCs 的生物相容性差异巨大，介孔直径 12.57 nm 的材料 1 对细胞增殖造成了明显抑制；尽管如此，扫描电镜依然可以观察到 BMSCs 均能在 3 种 BCP 材料表面良好地贴敷和生长，并且呈多边不规则形，伸展出可牢固贴附的伪足。
3 种 BCP 颗粒材料包埋于比格犬竖脊肌肌袋 2 个月后，材料缝隙间可见明显骨样组织沉积，此时开始出现成骨差异，在体外实验中生物相容性表现最差的 A 组材料，成骨面积比却显著高于其余两组；尽管 3 个月时 B、C 组成骨面积比有所增加，但仍显著低于 A 组。3 种材料随着置入时间延长，成骨面积比均稳步升高，从整体趋势看，成骨是一个缓慢持续且较为稳定的过程，介孔直径更大的材料其成骨性能在异位成骨模型中表现更好。qRT-PCR 检测示，A 组 ALP、OC 及 OPN 基因表达在2 个月时达高峰，之后平稳回落；B 组 3 种成骨相关基因表达整体上略高于 C 组，但两组间差异并无统计学意义。尽管随时间推移 3 组材料的基因表达水平均较植入初期明显升高，但 A 组基因上调时间最早，达到基因表达高峰的时间最短，这与组织学检测得出的成骨面积比表达规律一致。
本研究结果提示：1 050℃ 温度烧结的 BCP 材料成骨效果优于其余两组可能是暂时的，因为其余两组成骨相关基因的表达仍在持续上调，其成骨效率尚未达到峰值，因此还需要更长时间观测以评估各材料的整体成骨性能。1 050℃ 温度烧结的 BCP 材料生物相容性最差，但成骨性能最佳，是因为体内环境充足的血供和细胞来源为 BCP 的成骨提供了良好基础，提示我们在后期临床应用中，应充分考虑材料植入区域的血供条件。介孔直径对材料成骨效果产生的诸多影响，其机制目前尚不明确，并不是所有 BCP 材料都能展现出明显的异位成骨能力。有研究证实介孔直径小、比表面积很低的材料甚至不会有成骨发生[18]，还有研究证实孔隙率约为 60% 的材料能够为骨组织提供充分的生长空间[19]，并认为在充足的孔隙内保持稳定新陈代谢的原因是植入物内充足的体液浸润[18, 20]。在此基础上，介孔的存在为局部环境提供了丰富的钙、磷离子[21]，当浓度达到了过饱和水平，丰富的钙、磷离子足以形成生物磷灰石层，进一步产生了成骨现象[22]。因此可以推测，本研究中的 3 种 BCP 材料在其整体结构能够提供一可靠空间支撑的前提下，不同介孔直径导致材料表层产生了不同程度的钙、磷离子，该过程不会太快，但稳定而持续，所以成骨面积比随时间延长逐步升高。介孔直径作为一个重要参数，可调节局部钙、磷离子水平，维持生物磷灰石层稳定。在一定介孔直径范围内，直径较大的材料能够生成更稳定的生物磷灰石层，具备更早、更快成骨的能力。
综上述，本研究成功制备了 3 种不同介孔直径的 BCP 材料，尽管其生物相容性存在显著差异，但是 BMSCs 均可在材料表面贴附和增殖；动物体内实验表明在充足血供和良好成骨环境中，介孔直径较大的 BCP 材料能够展现出更强的成骨能力。介孔直径作为一个可以调控的指标，可在 BCP 制备过程中作为有效参数，实现 BCP 材料的优化和升级。
志谢：感谢四川大学生物材料工程研究中心提供制作 3 种 BCP 颗粒材料的技术支持。
作者贡献：张栋负责实验设计及实施、数据收集整理、统计分析以及论文撰写；宗宪磊对文章的知识性内容作批评性审阅；郭小双、杜宏参与实验实施，包括动物的体内实验、标本取材及检测；宋国栋、靳小雷参与文章科研设计及讨论部分的分析，对文章整体的知识性内容作批评性审阅及支持性贡献。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：本研究经中国医学科学院整形外科医院实验动物伦理委员会批准［（2014）注册第（10）号］。实验动物使用许可证号 ：SYXK（京）2020-0018。
