引用本文： 何鹏杰, 李杨, 张若天, 任茂贤, 刘和栋, 杨民. p22phox 和 NOX5 在缺氧诱导成骨细胞自噬及凋亡中的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(7): 855-861. doi: 10.7507/1002-1892.202008039 复制
骨形态发生和重塑需要成骨细胞合成骨基质、破骨细胞协调吸收[1-2]。如骨髓血供下降会触发缺氧，进而引起成骨细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高，引发细胞自噬以及凋亡，最终导致骨质疏松。ROS 的生成需要 NADPH 氧化酶系统的协助[3]，而 NADPH 氧化酶系统又可通过 ROS 来调节成骨细胞的增殖分化。
NADPH 氧化酶系统包括 p22phox 和 NOX 家族，上述家族可形成二聚体促进 ROS 生成。NOX 家族包括 NOX1～5，研究已明确 p22phox 与 NOX1～4 的生成密切相关，NOX4 基因可以通过 ROS 来调节 BMP-2 表达，进而调节成骨细胞分化[4]；p22phox-Rubicon 轴的高效选择性抑制剂 TIPTP 可以治疗骨关节炎[5]，p47phox-NOX2 依赖的 ROS 信号则可抑制小鼠早期骨骼发育[6]。这些研究表明 p22phox 与 NOX 家族可调节成骨细胞的生物功能，而 p22phox、NOX5 在骨质疏松骨组织中的表达水平以及对缺氧引发的成骨细胞损害作用机制尚未明确。因此，本研究就 p22phox 及 NOX5 在缺氧条件下成骨细胞自噬与凋亡中的作用作进一步研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
新生 SD 大鼠 6 只，雌雄不限，体质量不限，由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。
p22phox、NOX5 抗体以及二抗（Abcam 公司，美国）；Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bax、Bcl-2 抗体（CST 公司，美国）；荧光探针（DCFH-DA）、细胞凋亡试剂盒、ROS 检测试剂盒、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、茜素红染色试剂盒、ALP 染色试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；p22phox 和 NOX5 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA；广东锐博生物科技有限公司）；SYBR ExScript Q-PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）。
流式细胞仪（Beckman 公司，美国）；倒置荧光显微镜（OSRAM 公司，德国）；三气培养箱（Abcam 公司，美国）。
1.2 成骨细胞培养及鉴定
取 6 只新生 SD 大鼠断头处死后，置于乙醇浸泡 15 min，无菌条件下取颅骨[7]，去除周围结缔组织后剪碎至 2 mm×2 mm，置于胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶混合液消化 2 h，获得组织块。采用组织块贴壁法获得成骨细胞，差速贴壁法纯化成骨细胞。将细胞置于恒温、恒湿培养箱培养，每 3 天换液 1 次，倒置显微镜下观察细胞形态，待 1 周后细胞达 90% 融合时传代 1 次，即第 1 代细胞，用于后续实验。
取第 1 代细胞行 HE 染色观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞纯度，茜素红染色和 ALP 染色鉴定细胞功能[8-9]。
1.3 成骨细胞缺氧模型制备及最佳缺氧时间选择
1.3.1 成骨细胞缺氧模型制备
实验使用三气培养箱制备成骨细胞缺氧模型。首先以 95%N2 和 5%CO2 混合气体持续供给三气培养箱，直至培养箱 O2 浓度降至 1%（缺氧环境），再将成骨细胞置入培养箱[10]。于缺氧培养 0、3、6、12、24 h 后，分别取出细胞行 Western blot 及流式细胞仪检测。
1.3.2 检测方法
① Western blot 检测：将各时间点细胞采用 RIPA buffer 裂解，获得裂解蛋白，用 BCA 法调整蛋白浓度，每孔加入 5 μL 蛋白混合物，抗体稀释浓度 p22phox（1∶1 000）、NOX5（1∶500）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），二抗稀释浓度 1∶500。然后进行电泳实验，转膜，曝光，Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算与内参蛋白 β-actin 的灰度值比值作为目标蛋白 p22phox、NOX5、LC3 相对表达量。其中，以 LC3Ⅱ/Ⅰ作为 LC3 表达量[11]，观测细胞自噬水平的改变。实验重复 3 次。
② 流式细胞仪检测：使用荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内 ROS 水平[12]。取各时间点细胞，用不含血清培养基清洗 3 次，加入浓度为 10 μmol/L 的 DCFH-DA 孵育 30 min，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至 1×106个/mL，流式细胞仪测量细胞内 ROS 水平。
取各时间点细胞用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至 1×106个/mL，使用 Annexin V/碘化丙啶染色[13]后，流式细胞仪测量各组细胞凋亡率。
根据上述检测结果，选择细胞内 ROS 水平最高时间作为最佳缺氧时间，进行后续实验。
1.4 细胞转染实验
1.4.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率观测
① 分组方法：将成骨细胞分成正常组和 si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组。其中，正常组为正常细胞，不作转染处理；si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组：将 p22phox 和 NOX5 的 siRNA 分别按说明书使用脂质体转染至成骨细胞中 12 h。然后，将 3 组细胞以 5×104个/孔接种于 6 孔板中过夜后，参照 1.3.1 方法进行缺氧处理。
② 抑制效率检测：取缺氧处理 12 h 后细胞，提取总 RNA，采用 SYBR ExScript Q-PCR 试剂盒行 RT-PCR 检测细胞抑制效率。
1.4.2 分别抑制成骨细胞 p22phox 或 NOX5 基因表达观测
① 分组方法：将成骨细胞分成 4 组，正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组。其中，后 3 组先按照 1.4.1 方法采用 si-NC（不含 siRNA 的脂质体）以及含 p22phox 或 NOX5 的 siRNA 转染成骨细胞后，参照 1.3.1 方法将 4 组细胞缺氧处理 12 h。
② 观测方法：参照 1.3.2 方法采用 Western blot 及流式细胞仪检测细胞内 p22phox、NOX5、ROS 水平，与细胞自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin）、凋亡（Bax 和 Bcl-2）相关的蛋白表达，以及细胞凋亡率。
1.4.3 同时抑制成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达观测
① 分组方法：将成骨细胞分成 2 组，缺氧 12 h 组（缺氧组）以及同时转染 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 组（抑制+缺氧组）。抑制+缺氧组成骨细胞同 1.4.1 方法使用脂质体转染 si-p22phox 及 si-NOX5 后，将 2 组成骨细胞缺氧处理 12 h。
② 观察方法：采用免疫荧光染色观察 2 组细胞内 Beclin 及 Bax 表达变化，荧光显微镜下见 Beclin 呈绿色荧光，Bax 呈红色荧光，Beclin、Bax 混合呈黄色荧光。
1.5 统计学方法
采用 R 语言 4.02 版本软件中 stats 包进行统计分析。数据以均数±标准差表示；两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Tukey 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 成骨细胞形态观察及鉴定
倒置显微镜下见第 1 代细胞为梭形并呈铺路石状生长，细胞形态一致性较好。流式细胞仪检测细胞纯度达 95% 左右。HE 染色示细胞形态较完整，茜素红染色可见红色结节，ALP 染色可见细胞内蓝紫色颗粒。见图 1。经鉴定，培养获得的细胞为成骨细胞。
图1
成骨细胞形态观察及鉴定
a. 第 1 代细胞形态（倒置显微镜×40）；b. 流式细胞仪鉴定；c. HE 染色（×100）；d. 茜素红染色（×100）；e. ALP 染色（×100）
Figure1. Observation and identification of osteoblastsa. The morphology of the first generation cells (Inverted mircoscopy×40); b. Flow cytometry identification; c. HE staining (×100); d. Alizarin red staining (×100); e. ALP staining (×100)
2.2 成骨细胞最佳缺氧时间选择
2.2.1 Western blot 检测
随着缺氧时间延长，p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测缺氧后各时间点成骨细胞 p22phox、NOX5 及 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达
a. 电泳图 1～5 分别为缺氧培养 0、3、6、12、24 hMr：相对分子质量；b. 各目标蛋白相对表达量
Figure2. The expressions of p22phox, NOX5, and LC3Ⅱ/Ⅰ proteins in osteoblasts at each hypoxia time point detected by Western blota. Electrophoresis 1-5 for hypoxia culture for 0, 3, 6, 12, and 24 hours, respectively Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein
2.2.2 流式细胞仪检测
随缺氧时间延长，成骨细胞内 ROS 水平逐渐升高，12 h 达峰值，之后开始下降；各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡率也随着缺氧时间延长逐渐升高，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
流式细胞仪检测缺氧后各时间点成骨细胞内 ROS 水平及细胞凋亡率
a. ROS 水平；b. 细胞凋亡率
Figure3. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia detected by flow cytometrya. Level of ROS; b. Apoptosis rate
综合 Western blot 检测及流式细胞仪检测结果，选择缺氧 12 h 模型进行后续实验。
2.3 细胞转染实验
2.3.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率观测
RT-PCR 检测 p22phox 及 NOX5 的 siRNA 抑制效率均达 98% 以上，其中 si-p22phox 缺氧处理组 p22phox 抑制效率 99.45%，si-NOX5 缺氧处理组 NOX5 抑制效率 98.36%，按照 siRNA 转染使用说明，抑制效率达 95% 即可用于实验。
2.3.2 分别抑制成骨细胞 p22phox、NOX5 基因表达观测
① Western blot 检测：与 si-NC 缺氧处理组相比，si-p22phox 缺氧处理组 NOX5 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），而 p22phox 蛋白相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）；si-NOX5 缺氧处理组 p22phox 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），NOX5 蛋白相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测缺氧并转染处理后各组相关目的蛋白表达
1～4 分别为正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组 a. 电泳图 Mr：相对分子质量；b. 各目标蛋白相对表达量 *P<0.05
Figure4. The target protein expression detected by Western blot after hypoxia and transfection treatment1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively a. Electrophoresis Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein *P<0.05
与正常组比较，si-NC 缺氧处理组 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量上升，Bcl-2 蛋白相对表达量表达下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 si-NC 缺氧处理组比较，si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组的 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量下降，而 Bcl-2 蛋白相对表达量上升，差异均有统计学意义（P<0.05），见图 4。
② 流式细胞仪检测：与正常组比较，si-NC 缺氧组 ROS 水平及细胞凋亡率上升，差异有统计学意义（P<0.05）；与 si-NC 缺氧组比较，si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组 ROS 水平及细胞凋亡率下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
流式细胞仪检测缺氧并转染处理后各组 ROS 水平及细胞凋亡情况
1～4 分别为正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组 *P<0.05 a. ROS 水平；b. 细胞凋亡率
Figure5. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia and transfection treatment detected by flow cytometry1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively *P<0.05 a. Level of ROS; b. Apoptosis rate
2.3.3 同时抑制成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达观察
免疫荧光染色显示缺氧组细胞中与自噬相关基因 Beclin 以及与凋亡相关基因 Bax 呈强荧光，抑制+缺氧组上述基因荧光均较弱，见图 6。
图6
免疫荧光染色观察同时抑制 p22phox、NOX5 基因表达后细胞内 Beclin、Bax 表达情况（荧光显微镜×100）
从左至右分别为 DAPI、Beclin、Bax 及重叠图片 a. 缺氧组；b. 抑制+缺氧组
Figure6. The expressions of Beclin and Bax after simultaneously inhibiting the expressions of p22phox and NOX5 genes by immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×100)From left to right for DAPI, Beclin, Bax, and merge images, respectively a. Hypoxia group; b. Inhibition+hypoxia group
3 讨论
研究表明体内骨质疏松区域内的成骨细胞会长期处于缺血缺氧环境[14]，而缺血缺氧又会引发成骨细胞自噬和凋亡[15]。本研究在体外实验中初步观察到抑制 p22phox、NOX5 基因表达，可以降低成骨细胞在缺氧环境中自噬和凋亡。自噬和凋亡对于成骨细胞的增殖和矿化具有重要意义。凋亡势必降低成骨细胞的矿化以及增殖能力；轻度自噬利于细胞维持正常生理状态，包括增殖、分化等，而过度自噬对原细胞生理环境破坏较大。
研究表明 ROS 在细胞周期以及细胞增殖、凋亡、自噬中具有重要作用[16]，多项研究均表明抗骨质疏松药物具有清除细胞内 ROS 的作用，并且在骨质疏松模型中检测到 ROS 表达升高[17]。本研究也观察到缺氧可导致细胞内 ROS 水平上升，而缺氧是骨质疏松发生的重要一环[18]。本研究将成骨细胞置于缺氧培养箱中培养，发现在一定时间内，随着缺氧时间增加，细胞中 ROS 水平增加，当缺氧时间超过一定时间阈值，细胞内 ROS 水平开始下降。与此同时，对上述不同缺氧时间点 p22phox 和 NOX5 蛋白表达变化进行检测，发现与细胞内 ROS 水平具有相同变化趋势，这说明 p22phox、NOX5 和成骨细胞 ROS 的产生可能存在上、下游分子作用关系，p22phox、NOX5 可以影响细胞内 ROS 水平，同时也初步验证了 p22phox、NOX5 是 ROS 产生的重要辅酶。
我们进一步研究在缺氧成骨细胞中 p22phox、NOX5 基因是否相互影响表达，结果发现缺氧诱导的成骨细胞 p22phox、NOX5 可能互不干扰。与 si-NC 缺氧处理组相比，当抑制 p22phox 基因表达时，NOX5 表达变化无统计学意义；而抑制 NOX5 基因表达时，p22phox 表达变化无统计学意义。由于细胞实验存在抑制效率问题，该结论还需进一步验证。
和 p22phox、NOX5 相似，p47phox、NOX2 协同产生的 ROS 在成骨细胞增殖和矿化方面也具有重要作用[6]。抑制 p47phox、NOX2 基因表达可导致骨质疏松模型皮质区成骨细胞增多、骨量增加，并促进和成骨密切相关的基因转换生长因子 RUNX-2[19]的表达，而 p22phox、p47phox、NOX2 和 NOX5 具有同源性，因此我们分析抑制 p22phox、NOX5 基因表达时，成骨细胞 ROS 降至接近生理水平，有利于成骨细胞增殖和矿化。实验结果证明抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达后，可将缺氧成骨细胞内 ROS 控制在较低水平，进而降低细胞自噬，减少细胞凋亡，从而提高细胞增殖和矿化能力。
LC3 反映细胞自噬能力，细胞自噬增强时会促进 LC3 前体 LC3Ⅰ向 LC3Ⅱ转化[20]。本研究发现随着成骨细胞缺氧时间增加，自噬蛋白 LC3Ⅰ转化为 LC3Ⅱ增加，说明细胞内自噬水平增强。同时，我们发现细胞凋亡也持续增加，并未出现下降或者稳定情况，而这种变化与 ROS 累积量变化趋势有所不同。根据既往研究[21-22]，我们分析这可能是随着成骨细胞缺氧程度加重，细胞自噬进一步加强，由于细胞内大量 ROS 积累，细胞损伤进一步加强，使得自噬抑制 ROS 生成以降低细胞损伤，但由于外在缺氧条件没有改变，p22phox、NOX5 可能通过其他途径进一步促进细胞凋亡所致。另外，流式细胞仪检测发现，缺氧所引起的成骨细胞凋亡大部分在早期以及晚期，抑制 p22phox、NOX5 基因表达可以降低成骨细胞在早期以及晚期凋亡，提示缺氧极易引起成骨细胞从早期凋亡直接过渡到晚期凋亡，并且 p22phox、NOX5 可有效减弱这一环节。
为了进一步探究 p22phox、NOX5 与成骨细胞 ROS 产生的上、下游分子关系，本研究通过抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达，观察 p22phox 和 NOX5 基因对缺氧条件下成骨细胞 ROS 形成的影响。成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达被抑制后，其 ROS 水平较 si-NC 缺氧处理组明显下降，我们分析可能是通过抑制成骨细胞内 p22phox、NOX5 的生成，从而进一步抑制了 ROS 形成中重要辅酶 NADPH 氧化酶的形成，进而影响成骨细胞内 ROS 形成。最后，我们检测了和细胞自噬相关蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ以及 Beclin 表达变化，发现抑制 p22phox、NOX5 基因表达后，Beclin 蛋白表达下降，而 LC3Ⅰ转化成 LC3Ⅱ的进程受到部分抑制[23]。与此同时，还检测了和细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 表达变化，发现 Bax 表达下降，Bcl-2 表达上升。免疫荧光染色发现在单个细胞内，同时抑制 p22phox、NOX5 基因表达后，相对于缺氧组，Beclin 和 Bax 表达下降。另外，Bcl-2 虽然和凋亡相关，但其反映的是细胞增殖能力，Bcl-2 表达上升则表示细胞增殖能力升高。另外我们发现抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达能明显降低成骨细胞晚期凋亡，提示抑制 p22phox 和 NOX5 的表达可降低成骨细胞内 ROS 水平，从而促进细胞内环境稳态，降低细胞凋亡，而 Bcl-2 表达上升从侧面证明这种抑制作用。
综上述，本研究初步观察到抑制 p22phox、NOX5 基因表达可以降低缺氧条件下成骨细胞自噬和凋亡，从而促进成骨细胞增殖。然而，随着缺氧时间延长，成骨细胞内 ROS 水平出现下降趋势，其原因有待进一步研究。而且本研究仅在体外验证了 p22phox、NOX5 在缺氧成骨细胞中的作用，还需要进一步进行体内实验。另外，成骨细胞缺氧自噬与 ROS 之间的具体分子作用关系也有待进一步研究。
作者贡献：何鹏杰负责实验、数据收集、图片处理及撰稿；李杨、张若天、任茂贤、刘和栋负责部分实验数据收集；杨民负责实验经费、实验思路、文章构架及校稿。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经皖南医学院附属弋矶山医院动物实验伦理委员会批准。实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2018-004。
骨形态发生和重塑需要成骨细胞合成骨基质、破骨细胞协调吸收[1-2]。如骨髓血供下降会触发缺氧，进而引起成骨细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高，引发细胞自噬以及凋亡，最终导致骨质疏松。ROS 的生成需要 NADPH 氧化酶系统的协助[3]，而 NADPH 氧化酶系统又可通过 ROS 来调节成骨细胞的增殖分化。
NADPH 氧化酶系统包括 p22phox 和 NOX 家族，上述家族可形成二聚体促进 ROS 生成。NOX 家族包括 NOX1～5，研究已明确 p22phox 与 NOX1～4 的生成密切相关，NOX4 基因可以通过 ROS 来调节 BMP-2 表达，进而调节成骨细胞分化[4]；p22phox-Rubicon 轴的高效选择性抑制剂 TIPTP 可以治疗骨关节炎[5]，p47phox-NOX2 依赖的 ROS 信号则可抑制小鼠早期骨骼发育[6]。这些研究表明 p22phox 与 NOX 家族可调节成骨细胞的生物功能，而 p22phox、NOX5 在骨质疏松骨组织中的表达水平以及对缺氧引发的成骨细胞损害作用机制尚未明确。因此，本研究就 p22phox 及 NOX5 在缺氧条件下成骨细胞自噬与凋亡中的作用作进一步研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
新生 SD 大鼠 6 只，雌雄不限，体质量不限，由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。
p22phox、NOX5 抗体以及二抗（Abcam 公司，美国）；Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bax、Bcl-2 抗体（CST 公司，美国）；荧光探针（DCFH-DA）、细胞凋亡试剂盒、ROS 检测试剂盒、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、茜素红染色试剂盒、ALP 染色试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；p22phox 和 NOX5 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA；广东锐博生物科技有限公司）；SYBR ExScript Q-PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）。
流式细胞仪（Beckman 公司，美国）；倒置荧光显微镜（OSRAM 公司，德国）；三气培养箱（Abcam 公司，美国）。
1.2 成骨细胞培养及鉴定
取 6 只新生 SD 大鼠断头处死后，置于乙醇浸泡 15 min，无菌条件下取颅骨[7]，去除周围结缔组织后剪碎至 2 mm×2 mm，置于胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶混合液消化 2 h，获得组织块。采用组织块贴壁法获得成骨细胞，差速贴壁法纯化成骨细胞。将细胞置于恒温、恒湿培养箱培养，每 3 天换液 1 次，倒置显微镜下观察细胞形态，待 1 周后细胞达 90% 融合时传代 1 次，即第 1 代细胞，用于后续实验。
取第 1 代细胞行 HE 染色观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞纯度，茜素红染色和 ALP 染色鉴定细胞功能[8-9]。
1.3 成骨细胞缺氧模型制备及最佳缺氧时间选择
1.3.1 成骨细胞缺氧模型制备
实验使用三气培养箱制备成骨细胞缺氧模型。首先以 95%N2 和 5%CO2 混合气体持续供给三气培养箱，直至培养箱 O2 浓度降至 1%（缺氧环境），再将成骨细胞置入培养箱[10]。于缺氧培养 0、3、6、12、24 h 后，分别取出细胞行 Western blot 及流式细胞仪检测。
1.3.2 检测方法
① Western blot 检测：将各时间点细胞采用 RIPA buffer 裂解，获得裂解蛋白，用 BCA 法调整蛋白浓度，每孔加入 5 μL 蛋白混合物，抗体稀释浓度 p22phox（1∶1 000）、NOX5（1∶500）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），二抗稀释浓度 1∶500。然后进行电泳实验，转膜，曝光，Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算与内参蛋白 β-actin 的灰度值比值作为目标蛋白 p22phox、NOX5、LC3 相对表达量。其中，以 LC3Ⅱ/Ⅰ作为 LC3 表达量[11]，观测细胞自噬水平的改变。实验重复 3 次。
② 流式细胞仪检测：使用荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内 ROS 水平[12]。取各时间点细胞，用不含血清培养基清洗 3 次，加入浓度为 10 μmol/L 的 DCFH-DA 孵育 30 min，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至 1×106个/mL，流式细胞仪测量细胞内 ROS 水平。
取各时间点细胞用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至 1×106个/mL，使用 Annexin V/碘化丙啶染色[13]后，流式细胞仪测量各组细胞凋亡率。
根据上述检测结果，选择细胞内 ROS 水平最高时间作为最佳缺氧时间，进行后续实验。
1.4 细胞转染实验
1.4.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率观测
① 分组方法：将成骨细胞分成正常组和 si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组。其中，正常组为正常细胞，不作转染处理；si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组：将 p22phox 和 NOX5 的 siRNA 分别按说明书使用脂质体转染至成骨细胞中 12 h。然后，将 3 组细胞以 5×104个/孔接种于 6 孔板中过夜后，参照 1.3.1 方法进行缺氧处理。
② 抑制效率检测：取缺氧处理 12 h 后细胞，提取总 RNA，采用 SYBR ExScript Q-PCR 试剂盒行 RT-PCR 检测细胞抑制效率。
1.4.2 分别抑制成骨细胞 p22phox 或 NOX5 基因表达观测
① 分组方法：将成骨细胞分成 4 组，正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组。其中，后 3 组先按照 1.4.1 方法采用 si-NC（不含 siRNA 的脂质体）以及含 p22phox 或 NOX5 的 siRNA 转染成骨细胞后，参照 1.3.1 方法将 4 组细胞缺氧处理 12 h。
② 观测方法：参照 1.3.2 方法采用 Western blot 及流式细胞仪检测细胞内 p22phox、NOX5、ROS 水平，与细胞自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin）、凋亡（Bax 和 Bcl-2）相关的蛋白表达，以及细胞凋亡率。
1.4.3 同时抑制成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达观测
① 分组方法：将成骨细胞分成 2 组，缺氧 12 h 组（缺氧组）以及同时转染 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 组（抑制+缺氧组）。抑制+缺氧组成骨细胞同 1.4.1 方法使用脂质体转染 si-p22phox 及 si-NOX5 后，将 2 组成骨细胞缺氧处理 12 h。
② 观察方法：采用免疫荧光染色观察 2 组细胞内 Beclin 及 Bax 表达变化，荧光显微镜下见 Beclin 呈绿色荧光，Bax 呈红色荧光，Beclin、Bax 混合呈黄色荧光。
1.5 统计学方法
采用 R 语言 4.02 版本软件中 stats 包进行统计分析。数据以均数±标准差表示；两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Tukey 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 成骨细胞形态观察及鉴定
倒置显微镜下见第 1 代细胞为梭形并呈铺路石状生长，细胞形态一致性较好。流式细胞仪检测细胞纯度达 95% 左右。HE 染色示细胞形态较完整，茜素红染色可见红色结节，ALP 染色可见细胞内蓝紫色颗粒。见图 1。经鉴定，培养获得的细胞为成骨细胞。
图1
成骨细胞形态观察及鉴定
a. 第 1 代细胞形态（倒置显微镜×40）；b. 流式细胞仪鉴定；c. HE 染色（×100）；d. 茜素红染色（×100）；e. ALP 染色（×100）
Figure1. Observation and identification of osteoblastsa. The morphology of the first generation cells (Inverted mircoscopy×40); b. Flow cytometry identification; c. HE staining (×100); d. Alizarin red staining (×100); e. ALP staining (×100)
2.2 成骨细胞最佳缺氧时间选择
2.2.1 Western blot 检测
随着缺氧时间延长，p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量均逐渐增加，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测缺氧后各时间点成骨细胞 p22phox、NOX5 及 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达
a. 电泳图 1～5 分别为缺氧培养 0、3、6、12、24 hMr：相对分子质量；b. 各目标蛋白相对表达量
Figure2. The expressions of p22phox, NOX5, and LC3Ⅱ/Ⅰ proteins in osteoblasts at each hypoxia time point detected by Western blota. Electrophoresis 1-5 for hypoxia culture for 0, 3, 6, 12, and 24 hours, respectively Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein
2.2.2 流式细胞仪检测
随缺氧时间延长，成骨细胞内 ROS 水平逐渐升高，12 h 达峰值，之后开始下降；各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡率也随着缺氧时间延长逐渐升高，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
流式细胞仪检测缺氧后各时间点成骨细胞内 ROS 水平及细胞凋亡率
a. ROS 水平；b. 细胞凋亡率
Figure3. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia detected by flow cytometrya. Level of ROS; b. Apoptosis rate
综合 Western blot 检测及流式细胞仪检测结果，选择缺氧 12 h 模型进行后续实验。
2.3 细胞转染实验
2.3.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率观测
RT-PCR 检测 p22phox 及 NOX5 的 siRNA 抑制效率均达 98% 以上，其中 si-p22phox 缺氧处理组 p22phox 抑制效率 99.45%，si-NOX5 缺氧处理组 NOX5 抑制效率 98.36%，按照 siRNA 转染使用说明，抑制效率达 95% 即可用于实验。
2.3.2 分别抑制成骨细胞 p22phox、NOX5 基因表达观测
① Western blot 检测：与 si-NC 缺氧处理组相比，si-p22phox 缺氧处理组 NOX5 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），而 p22phox 蛋白相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）；si-NOX5 缺氧处理组 p22phox 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），NOX5 蛋白相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
Western blot 检测缺氧并转染处理后各组相关目的蛋白表达
1～4 分别为正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组 a. 电泳图 Mr：相对分子质量；b. 各目标蛋白相对表达量 *P<0.05
Figure4. The target protein expression detected by Western blot after hypoxia and transfection treatment1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively a. Electrophoresis Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein *P<0.05
与正常组比较，si-NC 缺氧处理组 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量上升，Bcl-2 蛋白相对表达量表达下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 si-NC 缺氧处理组比较，si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组的 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相对表达量下降，而 Bcl-2 蛋白相对表达量上升，差异均有统计学意义（P<0.05），见图 4。
② 流式细胞仪检测：与正常组比较，si-NC 缺氧组 ROS 水平及细胞凋亡率上升，差异有统计学意义（P<0.05）；与 si-NC 缺氧组比较，si-p22phox 缺氧处理组以及 si-NOX5 缺氧处理组 ROS 水平及细胞凋亡率下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
流式细胞仪检测缺氧并转染处理后各组 ROS 水平及细胞凋亡情况
1～4 分别为正常组、si-NC 缺氧处理组、si-p22phox 缺氧处理组、si-NOX5 缺氧处理组 *P<0.05 a. ROS 水平；b. 细胞凋亡率
Figure5. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia and transfection treatment detected by flow cytometry1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively *P<0.05 a. Level of ROS; b. Apoptosis rate
2.3.3 同时抑制成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达观察
免疫荧光染色显示缺氧组细胞中与自噬相关基因 Beclin 以及与凋亡相关基因 Bax 呈强荧光，抑制+缺氧组上述基因荧光均较弱，见图 6。
图6
免疫荧光染色观察同时抑制 p22phox、NOX5 基因表达后细胞内 Beclin、Bax 表达情况（荧光显微镜×100）
从左至右分别为 DAPI、Beclin、Bax 及重叠图片 a. 缺氧组；b. 抑制+缺氧组
Figure6. The expressions of Beclin and Bax after simultaneously inhibiting the expressions of p22phox and NOX5 genes by immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×100)From left to right for DAPI, Beclin, Bax, and merge images, respectively a. Hypoxia group; b. Inhibition+hypoxia group
3 讨论
研究表明体内骨质疏松区域内的成骨细胞会长期处于缺血缺氧环境[14]，而缺血缺氧又会引发成骨细胞自噬和凋亡[15]。本研究在体外实验中初步观察到抑制 p22phox、NOX5 基因表达，可以降低成骨细胞在缺氧环境中自噬和凋亡。自噬和凋亡对于成骨细胞的增殖和矿化具有重要意义。凋亡势必降低成骨细胞的矿化以及增殖能力；轻度自噬利于细胞维持正常生理状态，包括增殖、分化等，而过度自噬对原细胞生理环境破坏较大。
研究表明 ROS 在细胞周期以及细胞增殖、凋亡、自噬中具有重要作用[16]，多项研究均表明抗骨质疏松药物具有清除细胞内 ROS 的作用，并且在骨质疏松模型中检测到 ROS 表达升高[17]。本研究也观察到缺氧可导致细胞内 ROS 水平上升，而缺氧是骨质疏松发生的重要一环[18]。本研究将成骨细胞置于缺氧培养箱中培养，发现在一定时间内，随着缺氧时间增加，细胞中 ROS 水平增加，当缺氧时间超过一定时间阈值，细胞内 ROS 水平开始下降。与此同时，对上述不同缺氧时间点 p22phox 和 NOX5 蛋白表达变化进行检测，发现与细胞内 ROS 水平具有相同变化趋势，这说明 p22phox、NOX5 和成骨细胞 ROS 的产生可能存在上、下游分子作用关系，p22phox、NOX5 可以影响细胞内 ROS 水平，同时也初步验证了 p22phox、NOX5 是 ROS 产生的重要辅酶。
我们进一步研究在缺氧成骨细胞中 p22phox、NOX5 基因是否相互影响表达，结果发现缺氧诱导的成骨细胞 p22phox、NOX5 可能互不干扰。与 si-NC 缺氧处理组相比，当抑制 p22phox 基因表达时，NOX5 表达变化无统计学意义；而抑制 NOX5 基因表达时，p22phox 表达变化无统计学意义。由于细胞实验存在抑制效率问题，该结论还需进一步验证。
和 p22phox、NOX5 相似，p47phox、NOX2 协同产生的 ROS 在成骨细胞增殖和矿化方面也具有重要作用[6]。抑制 p47phox、NOX2 基因表达可导致骨质疏松模型皮质区成骨细胞增多、骨量增加，并促进和成骨密切相关的基因转换生长因子 RUNX-2[19]的表达，而 p22phox、p47phox、NOX2 和 NOX5 具有同源性，因此我们分析抑制 p22phox、NOX5 基因表达时，成骨细胞 ROS 降至接近生理水平，有利于成骨细胞增殖和矿化。实验结果证明抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达后，可将缺氧成骨细胞内 ROS 控制在较低水平，进而降低细胞自噬，减少细胞凋亡，从而提高细胞增殖和矿化能力。
LC3 反映细胞自噬能力，细胞自噬增强时会促进 LC3 前体 LC3Ⅰ向 LC3Ⅱ转化[20]。本研究发现随着成骨细胞缺氧时间增加，自噬蛋白 LC3Ⅰ转化为 LC3Ⅱ增加，说明细胞内自噬水平增强。同时，我们发现细胞凋亡也持续增加，并未出现下降或者稳定情况，而这种变化与 ROS 累积量变化趋势有所不同。根据既往研究[21-22]，我们分析这可能是随着成骨细胞缺氧程度加重，细胞自噬进一步加强，由于细胞内大量 ROS 积累，细胞损伤进一步加强，使得自噬抑制 ROS 生成以降低细胞损伤，但由于外在缺氧条件没有改变，p22phox、NOX5 可能通过其他途径进一步促进细胞凋亡所致。另外，流式细胞仪检测发现，缺氧所引起的成骨细胞凋亡大部分在早期以及晚期，抑制 p22phox、NOX5 基因表达可以降低成骨细胞在早期以及晚期凋亡，提示缺氧极易引起成骨细胞从早期凋亡直接过渡到晚期凋亡，并且 p22phox、NOX5 可有效减弱这一环节。
为了进一步探究 p22phox、NOX5 与成骨细胞 ROS 产生的上、下游分子关系，本研究通过抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达，观察 p22phox 和 NOX5 基因对缺氧条件下成骨细胞 ROS 形成的影响。成骨细胞 p22phox 和 NOX5 基因表达被抑制后，其 ROS 水平较 si-NC 缺氧处理组明显下降，我们分析可能是通过抑制成骨细胞内 p22phox、NOX5 的生成，从而进一步抑制了 ROS 形成中重要辅酶 NADPH 氧化酶的形成，进而影响成骨细胞内 ROS 形成。最后，我们检测了和细胞自噬相关蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ以及 Beclin 表达变化，发现抑制 p22phox、NOX5 基因表达后，Beclin 蛋白表达下降，而 LC3Ⅰ转化成 LC3Ⅱ的进程受到部分抑制[23]。与此同时，还检测了和细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 表达变化，发现 Bax 表达下降，Bcl-2 表达上升。免疫荧光染色发现在单个细胞内，同时抑制 p22phox、NOX5 基因表达后，相对于缺氧组，Beclin 和 Bax 表达下降。另外，Bcl-2 虽然和凋亡相关，但其反映的是细胞增殖能力，Bcl-2 表达上升则表示细胞增殖能力升高。另外我们发现抑制 p22phox 和 NOX5 基因表达能明显降低成骨细胞晚期凋亡，提示抑制 p22phox 和 NOX5 的表达可降低成骨细胞内 ROS 水平，从而促进细胞内环境稳态，降低细胞凋亡，而 Bcl-2 表达上升从侧面证明这种抑制作用。
综上述，本研究初步观察到抑制 p22phox、NOX5 基因表达可以降低缺氧条件下成骨细胞自噬和凋亡，从而促进成骨细胞增殖。然而，随着缺氧时间延长，成骨细胞内 ROS 水平出现下降趋势，其原因有待进一步研究。而且本研究仅在体外验证了 p22phox、NOX5 在缺氧成骨细胞中的作用，还需要进一步进行体内实验。另外，成骨细胞缺氧自噬与 ROS 之间的具体分子作用关系也有待进一步研究。
作者贡献：何鹏杰负责实验、数据收集、图片处理及撰稿；李杨、张若天、任茂贤、刘和栋负责部分实验数据收集；杨民负责实验经费、实验思路、文章构架及校稿。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经皖南医学院附属弋矶山医院动物实验伦理委员会批准。实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2018-004。
