引用本文： 任朋洁, 徐奕昊, 范飞, 田乐, 陆晓娜, 尤建军, 王欢, 郑若冰. 组织工程软骨在鼻再造术中的临床应用. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(2): 221-226. doi: 10.7507/1002-1892.202009053 复制
鼻位于面部中央，外鼻缺损或畸形对人的外貌有着显著影响。鼻再造是修复鼻缺损或矫正鼻畸形的主要方法，外被、支架和衬里是鼻再造的 3 个重要组成部分[1]。支架是整个再造鼻的骨架核心，是将二维皮瓣转化为三维立体结构的关键。本课题组前期采用 3D 打印技术在体外成功构建具有精细结构的组织工程鼻翼软骨[2]。为进一步探索该组织工程软骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014 年 3 月—2015 年 10 月我们将其用于治疗 5 例鼻缺损或畸形患者。现回顾 5 例患者治疗过程，总结临床观察结果，为今后研究提供参考。
1 临床资料
1.1 一般资料
本组 1 例 4 岁患儿为先天性鼻畸形。其余 4 例成年患者为外伤所致鼻部亚单位缺损，男 3 例、女 1 例；年龄 24～33 岁，平均 28.5 岁。既往均未对鼻畸形或缺损进行修复。患者临床资料详见表 1。
表1
患者临床资料
Table1.
The clinical data of 5 patients
1.2 组织工程软骨构建
1.2.1 种子细胞培养
局麻下，成年患者取耳甲腔软骨约 0.12 mL，患儿取鼻中隔软骨约 0.013 mL，置于 0～4℃ 培养液中，即刻转送至实验室。使用酶消化法获得原代人耳软骨细胞/鼻中隔软骨细胞，用含 5.0 ng/mL bFGF（R&D 公司，美国）、10%FBS（HyClone 公司，美国）的 H-DMEM 培养基（GIBCO公司，美国）制成细胞悬液，以 1.5×104个/cm2密度接种至培养瓶后，置于 37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。待细胞生长汇合至 70%～80% 进行传代，收集第 2 代软骨细胞，备用。
1.2.2 组织工程软骨构建
① 应用 3D 打印技术制备与正常鼻翼、鼻背形态相似的塑料支架，利用塑料支架制备石膏阳模与阴模。
② 采用聚羟基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）-聚乳酸（poly-lactic acid，PLA）复合材料构建组织工程软骨支架。其中，PGA 相对分子质量约 30×103，由上海组织工程国家工程中心提供；PLA 相对分子质量约 10×103，购于美国 Sigma-Aldrich 公司。将无纺的絮状 PGA 纤维均匀铺在石膏阳模上，反复滴加含 0.5%PLA 的二氯甲烷溶液，直至 PLA 干重占支架材料总质量的 15%；待二氯甲烷大部分挥发后，扣上阴模加压使其成型。
③ 取出制备的 PGA-PLA 支架材料，修剪周围多余材料，获得相应形态的支架；置于 75% 乙醇浸泡 1 h、紫外线照射 30 min 消毒，无血清 DMEM 培养液洗涤 5 次，加入常规细胞培养液预培养 48 h，确定无污染后吸干培养液备用。
④ 取 1.2.1 制备的第 2 代软骨细胞，调整细胞浓度至 1×106个/mL 后接种于 PGA-PLA 支架材料上；采用软骨分化培养液，于 37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养 12 周，体外构建组织工程软骨。培养结束后，将其行 HE 染色检测，确定无感染后植入人体内。其中，早期收治的例 1、2 鼻背部的组织工程软骨制备为片状；为进一步缩短术中支架雕刻时间，例 3、4、5 将鼻背部的组织工程软骨形状改为与隆鼻用硅胶 L 形支架一致。
1.3 手术方法
本组 1 例先天性鼻畸形患儿一期行鼻部畸形矫正术、硅胶假体植入术，二期取出假体同时植入组织工程软骨；其余 4 例成年患者均采用额部皮瓣扩张法进行鼻再造。
1.3.1 一期手术
一期行额部扩张器植入。全麻下，标记发际内切口线及扩张器置入范围。切开皮肤，在皮下层进行剥离，在帽状腱膜下层分离至预定范围。4 例成年患者均置入 300 mL 椭圆形扩张器，留置引流管 1 根，适当加压包扎。本组例 4 同时行鼻孔开大术。
术后 14 d 切口愈合后拆线。拆线后 1 周开始向扩张器内注水，每周注水 2 次，每次 15～20 mL，待总注水量达 600～750 mL 后停止注水并静置 1 个月。4 例患者注水及静置共耗时 5～6 个月，平均 5.75 个月。
1.3.2 二期手术
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受区切开松解瘢痕，依据局部瘢痕及黏膜情况制作衬里皮瓣，于鼻背正中皮下彻底松解组织，并于骨膜上方剥离形成腔隙。然后取出扩张器，设计额部带蒂皮瓣。局麻后，切开皮瓣并向下旋转至受区。将构建的组织工程软骨适当修剪，分别置于鼻翼及鼻背，并与周围组织固定。将皮瓣与制备的衬里皮瓣缝合，最后缝合额部供区。
术后放置引流管，密切观察皮瓣血运及引流情况，2 d 后拔出引流管，14 d 后拆线。术后 1 个月开始使用肠钳夹持再造鼻蒂部血运进行锻炼，待血运阻断可达 2 h 以上时，行皮瓣断蒂术。
1.3.3 三期手术
全麻后，患者取平卧位，采用局部浸润麻醉后切断鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并将多余的蒂部组织放回原处，矫正双眉位置不对称。断蒂后 6 个月左右水肿消退、皮瓣收缩和瘢痕稳定后[3]，根据患者鼻部外形行再造鼻修整术，包括修薄皮瓣形成鼻部精细结构、调整软骨支架、修复切口瘢痕等。本组 5 例患者行 1～4 次鼻修整术，平均 2.2 次。
1.4 组织学观察
本组 2 例患者在后期鼻修整术中取组织工程软骨进行组织学观察，其中例 3 分别于术后 1 年 6 个月、5 年取材，例 4 分别于术后 4、5 年取材。上述标本均行 HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色。为方便表述，观察结果以术后早期（植入时间<2 年）和远期（植入时间>2 年）来区分。
2 结果
2.1 临床观察结果
4 例成年患者二期术后 72 h 内皮瓣远端均未出现静脉淤血现象，皮瓣全部成活，切口 Ⅰ 期愈合，无急性期感染、明显排斥反应等并发症发生。额部供区切口均 Ⅰ 期愈合。4 例成年患者中，2 例（例 3、4）术后出现一过性低热，未予特殊处理，自行缓解；2 例（例 1、2）鼻部肿胀程度较其余 2 例明显，经常规口服消肿药物处理后，切口均按时拆线。另 1 例患儿（例 5）二期组织工程软骨植入术后出现持续性低热，鼻部肿胀明显，术后 2 d 拔除引流管后引流管口延迟愈合，渗出液较多，分泌物细菌培养呈阴性；6 d 时体温突然升高，考虑为扁桃体炎，给予抗生素后体温恢复正常，切口按时拆线。
术后 5 例患者均获随访，随访时间 9～74 个月，平均 54.8 个月。随访期间患者鼻部无明显不适，无组织工程软骨感染、移位或变形等并发症发生，鼻部形态明显改善，皮瓣色泽与正常皮肤相似，质地柔软，鼻部无明显通气障碍。患者对鼻部外形基本满意。见图 1、2。
图1
例 3 患者临床观察
a. 一期扩张器植入术后 6 个月（二期鼻再造术前）；b. 构建的组织工程软骨；c-e. 二期鼻再造术操作过程；f. 二期术后即刻；g. 二期术后 1 年 6 个月（第 1 次鼻修整术前）；h. 二期术后 5 年（第 3 次鼻修整术前）；i. 第 3 次鼻修整术中于左侧鼻翼植入组织工程软骨位置完整分离出质软组织；j. 二期术后 5 年 10 个月
Figure1. The clinical observation of case 3a. At 6 months after the expander implantation in the first stage (before the second nasal reconstruction); b. The tissue engineered cartilage; c-e. The surgery procedure of the second nasal reconstruction; f. At immediate after the second nasal reconstruction; g. At 1 year and 6 months after the second nasal reconstruction (before the first nasal revision); h. At 5 years after the second nasal reconstruction (before the third nasal revision); i. The soft tissue was separated from the place where tissue engineered cartilage had been implanted during the third nasal revision; j. At 5 years and 10 months after the second nasal reconstruction
图2
组织工程软骨鼻再造序列治疗及随访
从左至右分别为组织工程软骨植入术前、构建的组织工程软骨以及再造术后即刻、远期a. 例 4（二期术后 4 年 3 个月，第 3 次修整术后）；b. 例 5（二期术后 4 年 10 个月，第 1 次修整术后）
Figure2. Sequential treatment and follow-up of tissue engineered cartilage nasal reconstructionFrom left to right for the view before implantation of tissue engineered cartilage, the morphology of tissue engineered cartilage, the view at immediate after nasal reconstruction, and the long-term effectiveness, respectively a. Case 4 (at 4 years and 3 months after the second nasal reconstruction and after the third nasal revision); b. Case 5 (at 4 years and 10 months after the nasal reconstruction and after the first nasal revision)
2.2 组织学检测结果
镜下观察：术后早期（例 3）取材 HE 染色可见散在的软骨组织结构，EvG 弹性纤维染色阳性，Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色阳性，Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色为弱阳性。其余周围大部分组织与纤维结缔组织表现相同，可见散在的无结构组织，旁边可见多核巨噬细胞浸润，考虑为 PGA-PLA 残余支架成分。术后远期取材中，例 3 患者 HE 染色呈纤维结缔组织特点，未见明显软骨组织结构，EvG 弹性纤维染色呈阴性，Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色呈阴性，同样可见散在的无结构组织。例 4 患者术后 4 年的标本呈明显骨化表现；术后 5 年的标本可见明显软骨组织结构，HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色结果与例 3 术后早期结果相似。见图 3。
图3
例 3 患者组织学观察（×200）
从左至右分别为 HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ 、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色 箭头示无结构组织 a. 第 1 次鼻修整术取材；b. 第 3 次鼻修整术取材
Figure3. Histological characterization of tissue biopsy from the case 3 (×200)From left to right for HE staining, EvG staining, immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ, and immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ, respectively Arrow indicated the dispersed amorphous material a. The sample from the first revision; b. The sample from the third revision
3 讨论
理想化的鼻部组织工程软骨是在减少患者损伤的同时，提供更好的支架材料，降低手术难度，减少手术时间和鼻修整次数。Fulco 等[4]首次在癌症术后患者中使用片状组织工程软骨进行单侧鼻翼重建，获得了较好的鼻翼功能与外形重建。除此之外，其他用于鼻部的组织工程软骨人体体内研究非常有限[5]。
我们经过 5 年术后随访的临床试验，结果已初步证实了自体耳软骨细胞或鼻中隔软骨细胞复合 PGA-PLA 支架体外构建的组织工程软骨用于鼻再造的安全性。在 3D 打印技术辅助下，可以较精确地获得鼻翼和鼻背形状的组织工程软骨，但是随访发现植入后仍存在一些问题。组织学检测显示，组织工程软骨在植入鼻部后，软骨组织逐渐被吸收，取而代之的是纤维结缔组织，有少量 PGA-PLA 支架材料残留。例 4 患者 CT 复查示组织工程软骨植入体内 8 个月后出现明显钙化现象[6]，与本研究中临床观察以及免疫组织化学染色结果一致，但具体原因尚不清楚。在本课题组同期进行的组织工程软骨耳廓再造临床试验中，结果显示软骨支架移植入体内最早 2 个月就开始出现变形、坍塌，解剖结构模糊，MRI 也显示植入的软骨被吸收[7-8]。尽管植入的组织工程软骨外形和力学性能尚能满足临床需求，但植入体内后出现的这种吸收、纤维化及钙化趋势，必然会导致不可预测的刚度变化及原位变形，最终对头面部再造器官外形产生影响。已有研究证实软骨微环境及种子细胞来源均对再生软骨类型有一定调控作用[9]，肋软骨来源种子细胞构建的组织工程软骨表现肋软骨的骨化倾向[10]。但是，目前对于维持组织工程软骨机变性的特异性生化成分尚不清楚，细胞生化、免疫学以及生物力学间的复杂关系也需进一步研究。
例 5 患儿在组织工程软骨植入后出现低热、鼻部肿胀、渗出液增多等情况，但分泌物细菌培养结果为阴性，因组织工程软骨的种子细胞为自体来源，所以考虑无菌性炎症可能是由支架材料的体内代谢或其他相关因素引起。本试验中采用 PGA 和 PLA 作为支架材料，其在降解过程中产生的低 pH 环境会影响软骨细胞的生长、增殖和表型维持，甚至导致细胞坏死[11]。本研究软骨构建过程，只有细胞材料复合物体外培养阶段，未经裸鼠体内培养阶段，PGA-PLA 支架未能充分降解，即使在术后 5 年，构建的组织工程软骨中仍散在支架材料。
与传统肋软骨鼻再造法相比，采用组织工程软骨行鼻再造减少了受区损伤，同时因避免了繁琐的肋软骨支架搭建，大大缩短手术时间，根据目前患者随访情况，远期手术效果与肋软骨支架鼻再造法无明显差异。但组织工程软骨构建较繁琐、价格昂贵，其在鼻再造中的应用仍处于探索阶段，临床推广应用仍有一定差距。
要实现组织工程软骨在头面部器官重建中的大规模临床应用，需要解决更多问题。例如，如何解决组织工程软骨纤维化及骨化、如何将可能引发的免疫反应和炎症程度控制在最低。针对以上问题，我们依据组织工程三要素总结了可能的解决措施。① 种子细胞。除成体软骨细胞外，BMSCs 和脂肪 MSCs 也具有成软骨能力，它们是目前种子细胞的研究热点。有必要对 MSCs 分化调控及远期转归进行研究，以避免可能存在的风险[5]。② 支架材料。为避免上述支架材料植入体内后的不良反应可不使用支架，采用细胞膜片技术[12]进行组织工程软骨培养；或不植入支架，即加快支架材料在体外培养阶段的代谢速率；或者探索其他新的支架材料。还可通过不同方式提高天然材料的可塑性及力学强度，或将天然材料和人工合成材料进行复合，从而获得组织相容性较好、形态可控、力学性能合适的复合材料[13]，如 PLA-羟基乙酸共聚物/脱细胞软骨细胞外基质支架材料、壳聚糖/丝素蛋白/纳米羟基磷灰石多层支架复合体[14]等，但这些支架材料在人体内的长期安全性及用于头面部器官重建的有效性尚不明确。③ 培养条件。动态培养环境比静态培养环境能更好地模拟人体内状态，动态生物反应器因而也更适宜组织工程软骨的生长。不同种子细胞来源及所构建的软骨用途不同，所适宜的最佳动态软骨培养条件也存在差异[15]。本课题组自主研发了一种组合式组织工程动态培养仪[16]，但构建鼻部组织工程软骨的具体条件仍在探索中。
综上述，本研究结果已经初步表明组织工程软骨行鼻再造术的安全性，但其有效性仍需进一步验证。为确保组织工程软骨在长期植入体内后仍有足够软骨存留，提高体外构建软骨的质量及功能是后续研究的重要方向。
作者贡献：任朋洁参与实验设计，临床及组织学数据收集、整理、分析，撰写文章；徐奕昊、田乐、陆晓娜参与实验设计，手术实施，收集实验原始数据；王欢、尤建军、郑若冰参与手术实施；范飞参与指导实验设计，手术实施，文章撰写及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院医学伦理委员会批准（2016 注册第 05 号）。
鼻位于面部中央，外鼻缺损或畸形对人的外貌有着显著影响。鼻再造是修复鼻缺损或矫正鼻畸形的主要方法，外被、支架和衬里是鼻再造的 3 个重要组成部分[1]。支架是整个再造鼻的骨架核心，是将二维皮瓣转化为三维立体结构的关键。本课题组前期采用 3D 打印技术在体外成功构建具有精细结构的组织工程鼻翼软骨[2]。为进一步探索该组织工程软骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014 年 3 月—2015 年 10 月我们将其用于治疗 5 例鼻缺损或畸形患者。现回顾 5 例患者治疗过程，总结临床观察结果，为今后研究提供参考。
1 临床资料
1.1 一般资料
本组 1 例 4 岁患儿为先天性鼻畸形。其余 4 例成年患者为外伤所致鼻部亚单位缺损，男 3 例、女 1 例；年龄 24～33 岁，平均 28.5 岁。既往均未对鼻畸形或缺损进行修复。患者临床资料详见表 1。
表1
患者临床资料
Table1.
The clinical data of 5 patients
1.2 组织工程软骨构建
1.2.1 种子细胞培养
局麻下，成年患者取耳甲腔软骨约 0.12 mL，患儿取鼻中隔软骨约 0.013 mL，置于 0～4℃ 培养液中，即刻转送至实验室。使用酶消化法获得原代人耳软骨细胞/鼻中隔软骨细胞，用含 5.0 ng/mL bFGF（R&D 公司，美国）、10%FBS（HyClone 公司，美国）的 H-DMEM 培养基（GIBCO公司，美国）制成细胞悬液，以 1.5×104个/cm2密度接种至培养瓶后，置于 37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。待细胞生长汇合至 70%～80% 进行传代，收集第 2 代软骨细胞，备用。
1.2.2 组织工程软骨构建
① 应用 3D 打印技术制备与正常鼻翼、鼻背形态相似的塑料支架，利用塑料支架制备石膏阳模与阴模。
② 采用聚羟基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）-聚乳酸（poly-lactic acid，PLA）复合材料构建组织工程软骨支架。其中，PGA 相对分子质量约 30×103，由上海组织工程国家工程中心提供；PLA 相对分子质量约 10×103，购于美国 Sigma-Aldrich 公司。将无纺的絮状 PGA 纤维均匀铺在石膏阳模上，反复滴加含 0.5%PLA 的二氯甲烷溶液，直至 PLA 干重占支架材料总质量的 15%；待二氯甲烷大部分挥发后，扣上阴模加压使其成型。
③ 取出制备的 PGA-PLA 支架材料，修剪周围多余材料，获得相应形态的支架；置于 75% 乙醇浸泡 1 h、紫外线照射 30 min 消毒，无血清 DMEM 培养液洗涤 5 次，加入常规细胞培养液预培养 48 h，确定无污染后吸干培养液备用。
④ 取 1.2.1 制备的第 2 代软骨细胞，调整细胞浓度至 1×106个/mL 后接种于 PGA-PLA 支架材料上；采用软骨分化培养液，于 37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养 12 周，体外构建组织工程软骨。培养结束后，将其行 HE 染色检测，确定无感染后植入人体内。其中，早期收治的例 1、2 鼻背部的组织工程软骨制备为片状；为进一步缩短术中支架雕刻时间，例 3、4、5 将鼻背部的组织工程软骨形状改为与隆鼻用硅胶 L 形支架一致。
1.3 手术方法
本组 1 例先天性鼻畸形患儿一期行鼻部畸形矫正术、硅胶假体植入术，二期取出假体同时植入组织工程软骨；其余 4 例成年患者均采用额部皮瓣扩张法进行鼻再造。
1.3.1 一期手术
一期行额部扩张器植入。全麻下，标记发际内切口线及扩张器置入范围。切开皮肤，在皮下层进行剥离，在帽状腱膜下层分离至预定范围。4 例成年患者均置入 300 mL 椭圆形扩张器，留置引流管 1 根，适当加压包扎。本组例 4 同时行鼻孔开大术。
术后 14 d 切口愈合后拆线。拆线后 1 周开始向扩张器内注水，每周注水 2 次，每次 15～20 mL，待总注水量达 600～750 mL 后停止注水并静置 1 个月。4 例患者注水及静置共耗时 5～6 个月，平均 5.75 个月。
1.3.2 二期手术
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受区切开松解瘢痕，依据局部瘢痕及黏膜情况制作衬里皮瓣，于鼻背正中皮下彻底松解组织，并于骨膜上方剥离形成腔隙。然后取出扩张器，设计额部带蒂皮瓣。局麻后，切开皮瓣并向下旋转至受区。将构建的组织工程软骨适当修剪，分别置于鼻翼及鼻背，并与周围组织固定。将皮瓣与制备的衬里皮瓣缝合，最后缝合额部供区。
术后放置引流管，密切观察皮瓣血运及引流情况，2 d 后拔出引流管，14 d 后拆线。术后 1 个月开始使用肠钳夹持再造鼻蒂部血运进行锻炼，待血运阻断可达 2 h 以上时，行皮瓣断蒂术。
1.3.3 三期手术
全麻后，患者取平卧位，采用局部浸润麻醉后切断鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并将多余的蒂部组织放回原处，矫正双眉位置不对称。断蒂后 6 个月左右水肿消退、皮瓣收缩和瘢痕稳定后[3]，根据患者鼻部外形行再造鼻修整术，包括修薄皮瓣形成鼻部精细结构、调整软骨支架、修复切口瘢痕等。本组 5 例患者行 1～4 次鼻修整术，平均 2.2 次。
1.4 组织学观察
本组 2 例患者在后期鼻修整术中取组织工程软骨进行组织学观察，其中例 3 分别于术后 1 年 6 个月、5 年取材，例 4 分别于术后 4、5 年取材。上述标本均行 HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色。为方便表述，观察结果以术后早期（植入时间<2 年）和远期（植入时间>2 年）来区分。
2 结果
2.1 临床观察结果
4 例成年患者二期术后 72 h 内皮瓣远端均未出现静脉淤血现象，皮瓣全部成活，切口 Ⅰ 期愈合，无急性期感染、明显排斥反应等并发症发生。额部供区切口均 Ⅰ 期愈合。4 例成年患者中，2 例（例 3、4）术后出现一过性低热，未予特殊处理，自行缓解；2 例（例 1、2）鼻部肿胀程度较其余 2 例明显，经常规口服消肿药物处理后，切口均按时拆线。另 1 例患儿（例 5）二期组织工程软骨植入术后出现持续性低热，鼻部肿胀明显，术后 2 d 拔除引流管后引流管口延迟愈合，渗出液较多，分泌物细菌培养呈阴性；6 d 时体温突然升高，考虑为扁桃体炎，给予抗生素后体温恢复正常，切口按时拆线。
术后 5 例患者均获随访，随访时间 9～74 个月，平均 54.8 个月。随访期间患者鼻部无明显不适，无组织工程软骨感染、移位或变形等并发症发生，鼻部形态明显改善，皮瓣色泽与正常皮肤相似，质地柔软，鼻部无明显通气障碍。患者对鼻部外形基本满意。见图 1、2。
图1
例 3 患者临床观察
a. 一期扩张器植入术后 6 个月（二期鼻再造术前）；b. 构建的组织工程软骨；c-e. 二期鼻再造术操作过程；f. 二期术后即刻；g. 二期术后 1 年 6 个月（第 1 次鼻修整术前）；h. 二期术后 5 年（第 3 次鼻修整术前）；i. 第 3 次鼻修整术中于左侧鼻翼植入组织工程软骨位置完整分离出质软组织；j. 二期术后 5 年 10 个月
Figure1. The clinical observation of case 3a. At 6 months after the expander implantation in the first stage (before the second nasal reconstruction); b. The tissue engineered cartilage; c-e. The surgery procedure of the second nasal reconstruction; f. At immediate after the second nasal reconstruction; g. At 1 year and 6 months after the second nasal reconstruction (before the first nasal revision); h. At 5 years after the second nasal reconstruction (before the third nasal revision); i. The soft tissue was separated from the place where tissue engineered cartilage had been implanted during the third nasal revision; j. At 5 years and 10 months after the second nasal reconstruction
图2
组织工程软骨鼻再造序列治疗及随访
从左至右分别为组织工程软骨植入术前、构建的组织工程软骨以及再造术后即刻、远期a. 例 4（二期术后 4 年 3 个月，第 3 次修整术后）；b. 例 5（二期术后 4 年 10 个月，第 1 次修整术后）
Figure2. Sequential treatment and follow-up of tissue engineered cartilage nasal reconstructionFrom left to right for the view before implantation of tissue engineered cartilage, the morphology of tissue engineered cartilage, the view at immediate after nasal reconstruction, and the long-term effectiveness, respectively a. Case 4 (at 4 years and 3 months after the second nasal reconstruction and after the third nasal revision); b. Case 5 (at 4 years and 10 months after the nasal reconstruction and after the first nasal revision)
2.2 组织学检测结果
镜下观察：术后早期（例 3）取材 HE 染色可见散在的软骨组织结构，EvG 弹性纤维染色阳性，Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色阳性，Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色为弱阳性。其余周围大部分组织与纤维结缔组织表现相同，可见散在的无结构组织，旁边可见多核巨噬细胞浸润，考虑为 PGA-PLA 残余支架成分。术后远期取材中，例 3 患者 HE 染色呈纤维结缔组织特点，未见明显软骨组织结构，EvG 弹性纤维染色呈阴性，Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色呈阴性，同样可见散在的无结构组织。例 4 患者术后 4 年的标本呈明显骨化表现；术后 5 年的标本可见明显软骨组织结构，HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色结果与例 3 术后早期结果相似。见图 3。
图3
例 3 患者组织学观察（×200）
从左至右分别为 HE 染色、EvG 弹性纤维染色以及 Ⅰ 、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色 箭头示无结构组织 a. 第 1 次鼻修整术取材；b. 第 3 次鼻修整术取材
Figure3. Histological characterization of tissue biopsy from the case 3 (×200)From left to right for HE staining, EvG staining, immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ, and immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ, respectively Arrow indicated the dispersed amorphous material a. The sample from the first revision; b. The sample from the third revision
3 讨论
理想化的鼻部组织工程软骨是在减少患者损伤的同时，提供更好的支架材料，降低手术难度，减少手术时间和鼻修整次数。Fulco 等[4]首次在癌症术后患者中使用片状组织工程软骨进行单侧鼻翼重建，获得了较好的鼻翼功能与外形重建。除此之外，其他用于鼻部的组织工程软骨人体体内研究非常有限[5]。
我们经过 5 年术后随访的临床试验，结果已初步证实了自体耳软骨细胞或鼻中隔软骨细胞复合 PGA-PLA 支架体外构建的组织工程软骨用于鼻再造的安全性。在 3D 打印技术辅助下，可以较精确地获得鼻翼和鼻背形状的组织工程软骨，但是随访发现植入后仍存在一些问题。组织学检测显示，组织工程软骨在植入鼻部后，软骨组织逐渐被吸收，取而代之的是纤维结缔组织，有少量 PGA-PLA 支架材料残留。例 4 患者 CT 复查示组织工程软骨植入体内 8 个月后出现明显钙化现象[6]，与本研究中临床观察以及免疫组织化学染色结果一致，但具体原因尚不清楚。在本课题组同期进行的组织工程软骨耳廓再造临床试验中，结果显示软骨支架移植入体内最早 2 个月就开始出现变形、坍塌，解剖结构模糊，MRI 也显示植入的软骨被吸收[7-8]。尽管植入的组织工程软骨外形和力学性能尚能满足临床需求，但植入体内后出现的这种吸收、纤维化及钙化趋势，必然会导致不可预测的刚度变化及原位变形，最终对头面部再造器官外形产生影响。已有研究证实软骨微环境及种子细胞来源均对再生软骨类型有一定调控作用[9]，肋软骨来源种子细胞构建的组织工程软骨表现肋软骨的骨化倾向[10]。但是，目前对于维持组织工程软骨机变性的特异性生化成分尚不清楚，细胞生化、免疫学以及生物力学间的复杂关系也需进一步研究。
例 5 患儿在组织工程软骨植入后出现低热、鼻部肿胀、渗出液增多等情况，但分泌物细菌培养结果为阴性，因组织工程软骨的种子细胞为自体来源，所以考虑无菌性炎症可能是由支架材料的体内代谢或其他相关因素引起。本试验中采用 PGA 和 PLA 作为支架材料，其在降解过程中产生的低 pH 环境会影响软骨细胞的生长、增殖和表型维持，甚至导致细胞坏死[11]。本研究软骨构建过程，只有细胞材料复合物体外培养阶段，未经裸鼠体内培养阶段，PGA-PLA 支架未能充分降解，即使在术后 5 年，构建的组织工程软骨中仍散在支架材料。
与传统肋软骨鼻再造法相比，采用组织工程软骨行鼻再造减少了受区损伤，同时因避免了繁琐的肋软骨支架搭建，大大缩短手术时间，根据目前患者随访情况，远期手术效果与肋软骨支架鼻再造法无明显差异。但组织工程软骨构建较繁琐、价格昂贵，其在鼻再造中的应用仍处于探索阶段，临床推广应用仍有一定差距。
要实现组织工程软骨在头面部器官重建中的大规模临床应用，需要解决更多问题。例如，如何解决组织工程软骨纤维化及骨化、如何将可能引发的免疫反应和炎症程度控制在最低。针对以上问题，我们依据组织工程三要素总结了可能的解决措施。① 种子细胞。除成体软骨细胞外，BMSCs 和脂肪 MSCs 也具有成软骨能力，它们是目前种子细胞的研究热点。有必要对 MSCs 分化调控及远期转归进行研究，以避免可能存在的风险[5]。② 支架材料。为避免上述支架材料植入体内后的不良反应可不使用支架，采用细胞膜片技术[12]进行组织工程软骨培养；或不植入支架，即加快支架材料在体外培养阶段的代谢速率；或者探索其他新的支架材料。还可通过不同方式提高天然材料的可塑性及力学强度，或将天然材料和人工合成材料进行复合，从而获得组织相容性较好、形态可控、力学性能合适的复合材料[13]，如 PLA-羟基乙酸共聚物/脱细胞软骨细胞外基质支架材料、壳聚糖/丝素蛋白/纳米羟基磷灰石多层支架复合体[14]等，但这些支架材料在人体内的长期安全性及用于头面部器官重建的有效性尚不明确。③ 培养条件。动态培养环境比静态培养环境能更好地模拟人体内状态，动态生物反应器因而也更适宜组织工程软骨的生长。不同种子细胞来源及所构建的软骨用途不同，所适宜的最佳动态软骨培养条件也存在差异[15]。本课题组自主研发了一种组合式组织工程动态培养仪[16]，但构建鼻部组织工程软骨的具体条件仍在探索中。
综上述，本研究结果已经初步表明组织工程软骨行鼻再造术的安全性，但其有效性仍需进一步验证。为确保组织工程软骨在长期植入体内后仍有足够软骨存留，提高体外构建软骨的质量及功能是后续研究的重要方向。
作者贡献：任朋洁参与实验设计，临床及组织学数据收集、整理、分析，撰写文章；徐奕昊、田乐、陆晓娜参与实验设计，手术实施，收集实验原始数据；王欢、尤建军、郑若冰参与手术实施；范飞参与指导实验设计，手术实施，文章撰写及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院医学伦理委员会批准（2016 注册第 05 号）。
