引用本文： 谢兴琴, 张怡, 赵新新, 刘瞳昕, 孙丽萍. 血小板衍生物在组织再生研究和应用中的标准化管理. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(3): 392-398. doi: 10.7507/1002-1892.202011023 复制
血小板具有凝血和组织修复两大类功能。血小板衍生物是一类体外提取血小板经特殊工艺制成活性生物制剂后，用于组织再生修复的医疗技术产品。将外周血通过离心或者富集作用获得的高度浓缩血小板（platelet concentrate，PC）进行有效激活，可促使 α 颗粒释放多种蛋白质，进而应用于组织再生修复中。激活过程可释放超过 4000 种蛋白[1]，基因信息分析发现其中至少有 125 种蛋白参与损伤修复过程[2]，包括 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等促进细胞生长、趋化、黏附和免疫调节的生物活性物质。这种源于血小板的高度复杂活性生物制剂可用于局部损伤组织，尤其是人体血液达不到或供血不良的位置，通过协同作用刺激细胞的增殖、分化与迁移，并增强细胞外基质的合成和分泌能力，达到对多种机体损伤原位修复与再生重建的目的[3-4]。
从 1954 年开始发展起来的富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），到富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）[5]，再到近年来组织工程修复中最前沿产品血小板裂解液（platelet lysates，PL）[6]，这些血小板衍生物逐渐从一种由临床医生根据经验在病床边自行制备的技术，走向规范化生产和应用的生物制剂或药物。PRP 一般是血液经过 2 次离心后，去掉大部分红细胞和乏血小板血浆后获得，可直接应用，也可采用凝血酶、氯化钙或胶原等激活成为 PRP 凝胶后应用。PRF 是一种将无抗凝剂的血液经离心激发血液凝集成胶后的富含血小板的纤维蛋白凝胶。由于此过程不添加任何外源物质激活，其制作工艺较 PRP 有很大优势，因而被称为第 2 代富血小板技术。PL 是将人血液进行血小板富集，或用采集而未回输的 5～7 d 浓缩血小板经多步处理，最后裂解激活，充分释放血小板颗粒和膜性结构中各种营养成分，被称为第 3 代富血小板技术。因不同研究者在制作过程中采用的采集方式、离心次数、激活方法、治疗疗程、应用方式以及是否含有白细胞、是否做成凝胶、血小板浓缩倍数和关键活性物质浓度等参数有很大区别，加之供体存在个体差异，造成富血小板技术获得的血小板衍生物终产品成分差别很大，极易导致同一类富血小板产品应用于同一种疾病时治疗效果有很大差别[7]。另外，缺少技术规范成为富血小板技术和产品发展的瓶颈问题，因此近年来医疗行业对多成分活性生物制剂标准化和质量均一控制的需求迫切，在一些国家已经逐步建立相应的管理要求和规范[8]。本文将从分类命名的标准化管理、对血小板衍生物发表论文的标准化管理、血小板衍生物制备技术的质量标准化管理及血小板衍生物临床应用的规范化管理 4 个方面，对血小板衍生物在组织再生研究和应用中的标准化管理进行综述。
1 分类命名的标准化管理
由于制备工艺和关键组成成分的复杂性，不同研究者试图通过标准化命名和分类，对血小板衍生物进行标准化管理和比较。2009 年—2020 年，多位研究者从制备工艺角度对血小板衍生物进行分类，见表 1。Dohan 等[9]根据产品中是否含有白细胞将血小板衍生物分为不含白细胞的纯 PRP（P-PRP）和富含白细胞的 PRP（L-PRP）；该方法目前被行业广泛接受。另有 PAW 分类法[10]、PLRA 分类法[11]、DEPA 分类法[12]、MARSPILL 分类法[13]等。2018 年国际血栓和止血学会（ISTH）按照血小板活化等级、血小板浓度等级、制备方法等级以及红细胞、白细胞的形式对不同 PRP 产品进行了相对完整的分类[14]。PRF 在骨缺损和颌面外科中广泛应用，除了根据是否含有白细胞[5, 8]进行命名外，PRF 又可根据离心速度、时间、离心管材质和激活程度不同进一步分类[15]。从 2003 年开始 PL 作为再生医学新产品，引起了再生修复领域研究工作者的广泛兴趣。PL 具有促进细胞生长、维持细胞原有良好性状以及扭转细胞老化等方面的作用。PL 已作为牛血清替代物广泛用于细胞规模化培养，成为临床级别的细胞，特别是干细胞培养的金标准；同时 PL 也可作为单独治疗制剂[16]或联合细胞共同移植的治疗产品，应用于骨科、抗衰老领域[17]；近年来负载人 PL（human PL，hPL）的生物活性材料也成为研究热点[18]。PL 制备工艺存在浓缩、激活、裂解方式以及是否含有纤维蛋白原的区别，因此命名稍有不同[19-20]。
表1
用于再生修复的血小板衍生物分类
Table1.
Classification of platelet derivatives for regeneration
2 对血小板衍生物发表论文的标准化管理
截止目前，同一类富血小板技术尚无最优制备工艺，获得的血小板衍生物也无法达到完全一致的应用共识。因此，为方便读者对研究结果进行理解和比较，在发表研究性论文时完整、准确和规范地描述制备工艺、产品性状和研究结果尤为重要。既往发表的血小板衍生物研究和应用论文存在以下问题：① 缺乏对制备过程关键细节的描述，读者无法重复实验结果；② 工艺描述中以百分比或倍数等相对值代替绝对值，读者无法对不同研究结果比较；③ 终产品中主要成分缺乏量化描述，令读者无法判断产品起效机制；④ 使用的语言和命名缺乏准确性和规范性，因此无法判定为何相似报道而研究结论却相差悬殊等问题。
Chahla 等[21]分析了 105 篇相关论文后发现，只有 11 篇论文完整清晰地描述了制备方案，17 篇论文对最终 PRP 组成进行了量化描述。对于 PRP 的制备过程，有 4% 报道中缺失血液初始体积，78% 报道缺失血液中初始血小板浓度，48% 报道缺失采血用抗凝剂种类，28% 报道未写明离心机种类，37% 报道中离心参数和时间不完整，36% 报道完全没有描述 PRP 激活与否。在 PRP 组成方面，仅有 26% 报道分析了 PRP 中血小板浓度，56% 报道以血小板倍数于初始血液的形式体现，13% 报道了 EGF 等细胞因子含量，57% 报道了 PRP 终体积。因此 Chahla 等提出在撰写富血小板技术文章时，需要将初始血液体积、抗凝剂种类及浓度、制备技术（包括离心机型号、转子直径、速度、离心时间）、激活剂种类、最终 PRP 产品中血小板浓度、单核细胞浓度、红细胞浓度等 7 类参数作为基本参数进行报告。在 PRP 的血小板数量方面，多数研究者习惯以 3～7 倍于初始血液中血小板浓度的方式来报道 PRP 制备工艺，但这种相对标准会因患者基础血小板浓度的巨大差别［（100～300）×109/L］，造成实际应用效果不同，因此将实际 PRP 中血小板浓度、注射 PRP 体积和到达组织内血小板总数作为重要标准化参数报道显得尤其重要。
Fadadu 等[22]对比了 33 个制备方案，发现制备工艺差异导致无法从血小板浓度推论关键修复因子浓度的高低，因此他建议撰写血小板衍生物研究与应用文章时，报告参数应尽量全面；同时，他也提出了最低报告参数的概念，其中特别要求将白细胞中的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞比例作为最低报告参数，关键生长因子中将 PDGF-AB、TGF-β1 和 VEGF 含量作为最低报告参数，以便在无全面报告技术细节时也能获得相对清晰的研究思路。
3 血小板衍生物制备技术的质量标准化管理
血小板衍生物的制备工艺差别很大，导致其质量的标准化管理难度较大。多数文献推荐采用口径大的采血针，以防止采血针过细、过长使得血小板在采血过程中即被激活或形成聚集[23]。在采血管选择上，使用 ACD-A 抗凝剂更有利于防止因血小板聚团对产品质量的影响[24]，而玻璃采血管内壁会导致血液中血小板提前激活。在温度控制方面，样本处理过程中低温可能会影响血小板活性，美国血库协会（AABB）建议对血小板采集、处理和保存温度均勿低于 20℃。不良的移液枪使用习惯将造成血小板提前激活，降低有效血小板浓度[25]。在离心操作中，离心速度或离心次数均会造成血小板一定程度激活；适中的离心速度有利于浓缩后血小板分散；离心力超过 800×g 后 TGF-β 释放浓度将出现下降，而超过 3000×g 将破坏血小板活性。因此，Ozer 等[26]建议采取短时间高速离心或长时间低速离心来保证血小板的稳定。目前有数十家生物医疗技术公司推出了商业化的血小板衍生物制备装置，采用固定装置和操作参数，可在一定程度上减少人为操作误差，更易实现质量标准化管理。吕汝举等[27]强调了商品化制备装置的无菌性要求应该符合中国国家药品监督管理局Ⅲ类器械管理规定。在自体化产品质量控制有难度的情况下，开展同种异体化产品的标准化管理，是未来发展趋势。Rebulla 等[28]报道了意大利脐血网络（ITCBN）通过标准化管理制备脐血血小板浓缩物的研究，该组织通过制定标准化离心速度和时间［第 1 次离心（200～210）×g、10～15 min，第 2 次离心（1800～2600）×g、15 min］，统一了 13 家脐血库制备脐血来源血小板浓缩物的工艺。采用同种异体成人外周血或脐带血进行 PL 制备，是最具标准化控制可行性的血小板衍生物生产方案[29]。Viau 等[30]对每批次制备 PL 时的供者数量与 hPL 产品间各参数变异率（coefficients of variation，CV）进行研究，通过蛋白组学分析和生物学特性分析，发现将血小板供者数量由 5 个增加至超过 200 个后，hPL 批次之间各参数 CV 值显著下降，总蛋白 CV 值从 16.06% 降至 4.74%、TGF-β1 从 18.38% 降至 7.92%、IGF-1 从 30.67% 降至 5.51%、VEGF 从 30.80% 降至 6.41%。因此，超过 200 个供者的大规模 hPL 制备具有极强的产品均一化、标准化特性，用 hPL 培养获得的 BMSCs 比 FBS+bFGF 培养获得的细胞大小更均一、细胞表面颗粒明显减少，批次之间细胞表面标志物 CD13、CD44、CD59、CD90 和 CD166 的 CV 值显著降低。
长期以来，PRP 和 PRF 作为在病床边分离、制备的自体产品，虽然不涉及病原微生物交叉传染，但存在操作过程带来的安全风险。迪拜国家卫生部门（DHA）和加拿大阿尔伯塔省外科医师学院分别在 2014 年和 2018 年出台了 PRP 管理指南，均特别强调了操作控制微生物污染的重要性。目前，PL 自体产品在临床中的应用逐渐增加，其临床安全控制也成为从研发到转化的重要一环[31]。同种异体来源的 PL 产品，不管是作为临床用细胞培养基添加物，还是作为单独的临床治疗生物制剂，控制传染性病原体都是质量标准化管理中的首要任务。各类文献报道中，制备药品生产质量管理规范（GMP）级别的 PL 产品供者数量在 4～200 个之间[30, 32]，虽然供者数量增加有助于实现 PL 批次之间的质量均一[30]，但也增加了病原体污染风险。因此，2019 年国际血液移植协会（ISBT）细胞治疗工作组发表了 hPL 生产全过程质量控制的声明[33]，建议生产每批次 PL 产品供者数量限制在 10～16 个。声明同时推荐了一套完整的标准化安全控制流程，包括：① 供者血液层面的严格病原微生物检测、筛选；② 小批量和规模化制备异体 hPL 中的过程病原体检测、灭活及终产品病原体检测、灭活。同时，为了实现标准化管理，声明中推荐了 hPL 终产品的各类检测参数及其范围，检测类别涵盖无菌、生化分析、免疫学分析，以及 PDGF-AB 和 TGF-β1 两个重要因子分析等内容，这是专业协会首次对 PL 产品公布的标准化声明（表 2）。
表2
ISBT 推荐的 hPL 质量标准化管理参数
Table2.
ISBT suggested standardized quality control of hPL
4 血小板衍生物临床应用的规范化管理
复杂的血小板衍生物组成、多样的制备工艺以及颇具难度的质量标准化控制，促使富血小板技术领域专业协会也试图通过分析大数据和积累的经验，根据不同疾病特点总结并发布临床应用指南或共识，为更好地发挥产品的临床价值提供参考。国际细胞医疗学会（ICMS）推荐[34]在临床应用中血小板激活过程不宜过于强烈，特别是在软组织修复中，可以不采用体外激活方式，而是通过组织中胶原对血小板自发激活方式，实现生物活性因子连续 3 d 释放。同时 ICMS 将富血小板产物应用的禁忌证分为绝对禁忌证和相对禁忌证，并在医生培训、用针、随访、风险等方面均进行了规范性描述。2018 年，中国医疗保健国际交流促进会骨科分会提出了 PRP 在骨关节外科中应用的专家共识[35]，共识提出了尽量使用新鲜制备的 PRP，采用直视或者利用超声引导方式向关节腔内多次注射 PRP 产品，每次注射剂量为 3～5 mL 等建议。同年，该学会按照循证医学证据，还发布了治疗膝骨关节炎的临床实践指南[8]，指南中提到关节腔内注射 PRP 更适用于年轻、严重程度轻的膝骨关节炎患者；关节注射次数不少于 2 次，间隔时间不少于 1 周；针对伴有关节腔积液的膝骨关节炎患者，建议抽吸积液后再接受关节腔注射治疗。在临床应用适应证方面，Le 等[3]根据文献报道的临床研究结果，建议采用富含白细胞的 PRP 治疗肱骨外上髁炎，而去白细胞 PRP 更适用于骨关节炎的治疗。
在临床应用政策监管方面，美国食品药品监督管理局（FDA）对 PRP 的制备套装按照医疗器械 510（K）实施放行管理[36]，对用于临床细胞培养添加物的 PL 按照细胞培养辅助成分进行分类和风险管理[33]。中国国家药品监督管理局对 PRP 制备用套装按照Ⅲ类医疗器械进行审批管理[27]。欧盟将 PRP、PRF 按照血液成分的制备、使用和质量保证方式管理[37]，将用于临床细胞培养的 PL 按照药典中生物来源的原材料进行管理[38]。作为欧盟成员之一的西班牙，在欧盟规范基础上，2015 年更是将 PRP 提升至按药物进行管理[39-40]。日本厚生劳动省则根据再生医学产品安全法案将 PC 按照以细胞为基础的医学产品中第三风险级别（涉及细胞的、进行最小操作的低风险治疗产品）进行管理[41]。由此看来，目前大多数国家是按照自体医疗技术对自体富血小板产品进行管理，部分国家逐渐开始建立新的更趋向于药物管理的方式进行监管，而对更易实现质量标准化、制备规模化的同种异体 PL 产品，按照再生医学药物管理模式的方向发展[33]。
5 总结
血小板衍生物含有 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等大量促进细胞生长、趋化、黏附、免疫调节和组织修复成分，属于再生医学技术产品。PRP 和 PRF 长期被用于骨科、皮肤损伤、颌面外科、神经损伤等领域的组织修复和再生，而 PL 作为血小板衍生物家族的新成员在细胞培养和组织损伤修复中发挥越来越大的作用。血小板衍生物由于受供者差异、操作个性化强、工艺参数差距大等因素影响，其标准化和量化控制问题一直是制约临床效果的关键。采用标准化命名和标准化撰写报告系统，将促进研究者报道的准确性和完整性，从而获得可重复性验证；采用良好操作模式以及质量标准化控制，并利用产品异体化来获得安全性和稳定性效果，是血小板衍生物实现量化、标准化以及从技术发展为再生医学药物的必经之路。
作者贡献：谢兴琴负责稿件撰写；张怡负责综述构思、设计和逻辑把控；赵新新负责文献检索；刘瞳昕负责资料归纳、整理；孙丽萍负责修订、校对。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费没有影响文章观点。
血小板具有凝血和组织修复两大类功能。血小板衍生物是一类体外提取血小板经特殊工艺制成活性生物制剂后，用于组织再生修复的医疗技术产品。将外周血通过离心或者富集作用获得的高度浓缩血小板（platelet concentrate，PC）进行有效激活，可促使 α 颗粒释放多种蛋白质，进而应用于组织再生修复中。激活过程可释放超过 4000 种蛋白[1]，基因信息分析发现其中至少有 125 种蛋白参与损伤修复过程[2]，包括 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等促进细胞生长、趋化、黏附和免疫调节的生物活性物质。这种源于血小板的高度复杂活性生物制剂可用于局部损伤组织，尤其是人体血液达不到或供血不良的位置，通过协同作用刺激细胞的增殖、分化与迁移，并增强细胞外基质的合成和分泌能力，达到对多种机体损伤原位修复与再生重建的目的[3-4]。
从 1954 年开始发展起来的富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），到富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）[5]，再到近年来组织工程修复中最前沿产品血小板裂解液（platelet lysates，PL）[6]，这些血小板衍生物逐渐从一种由临床医生根据经验在病床边自行制备的技术，走向规范化生产和应用的生物制剂或药物。PRP 一般是血液经过 2 次离心后，去掉大部分红细胞和乏血小板血浆后获得，可直接应用，也可采用凝血酶、氯化钙或胶原等激活成为 PRP 凝胶后应用。PRF 是一种将无抗凝剂的血液经离心激发血液凝集成胶后的富含血小板的纤维蛋白凝胶。由于此过程不添加任何外源物质激活，其制作工艺较 PRP 有很大优势，因而被称为第 2 代富血小板技术。PL 是将人血液进行血小板富集，或用采集而未回输的 5～7 d 浓缩血小板经多步处理，最后裂解激活，充分释放血小板颗粒和膜性结构中各种营养成分，被称为第 3 代富血小板技术。因不同研究者在制作过程中采用的采集方式、离心次数、激活方法、治疗疗程、应用方式以及是否含有白细胞、是否做成凝胶、血小板浓缩倍数和关键活性物质浓度等参数有很大区别，加之供体存在个体差异，造成富血小板技术获得的血小板衍生物终产品成分差别很大，极易导致同一类富血小板产品应用于同一种疾病时治疗效果有很大差别[7]。另外，缺少技术规范成为富血小板技术和产品发展的瓶颈问题，因此近年来医疗行业对多成分活性生物制剂标准化和质量均一控制的需求迫切，在一些国家已经逐步建立相应的管理要求和规范[8]。本文将从分类命名的标准化管理、对血小板衍生物发表论文的标准化管理、血小板衍生物制备技术的质量标准化管理及血小板衍生物临床应用的规范化管理 4 个方面，对血小板衍生物在组织再生研究和应用中的标准化管理进行综述。
1 分类命名的标准化管理
由于制备工艺和关键组成成分的复杂性，不同研究者试图通过标准化命名和分类，对血小板衍生物进行标准化管理和比较。2009 年—2020 年，多位研究者从制备工艺角度对血小板衍生物进行分类，见表 1。Dohan 等[9]根据产品中是否含有白细胞将血小板衍生物分为不含白细胞的纯 PRP（P-PRP）和富含白细胞的 PRP（L-PRP）；该方法目前被行业广泛接受。另有 PAW 分类法[10]、PLRA 分类法[11]、DEPA 分类法[12]、MARSPILL 分类法[13]等。2018 年国际血栓和止血学会（ISTH）按照血小板活化等级、血小板浓度等级、制备方法等级以及红细胞、白细胞的形式对不同 PRP 产品进行了相对完整的分类[14]。PRF 在骨缺损和颌面外科中广泛应用，除了根据是否含有白细胞[5, 8]进行命名外，PRF 又可根据离心速度、时间、离心管材质和激活程度不同进一步分类[15]。从 2003 年开始 PL 作为再生医学新产品，引起了再生修复领域研究工作者的广泛兴趣。PL 具有促进细胞生长、维持细胞原有良好性状以及扭转细胞老化等方面的作用。PL 已作为牛血清替代物广泛用于细胞规模化培养，成为临床级别的细胞，特别是干细胞培养的金标准；同时 PL 也可作为单独治疗制剂[16]或联合细胞共同移植的治疗产品，应用于骨科、抗衰老领域[17]；近年来负载人 PL（human PL，hPL）的生物活性材料也成为研究热点[18]。PL 制备工艺存在浓缩、激活、裂解方式以及是否含有纤维蛋白原的区别，因此命名稍有不同[19-20]。
表1
用于再生修复的血小板衍生物分类
Table1.
Classification of platelet derivatives for regeneration
2 对血小板衍生物发表论文的标准化管理
截止目前，同一类富血小板技术尚无最优制备工艺，获得的血小板衍生物也无法达到完全一致的应用共识。因此，为方便读者对研究结果进行理解和比较，在发表研究性论文时完整、准确和规范地描述制备工艺、产品性状和研究结果尤为重要。既往发表的血小板衍生物研究和应用论文存在以下问题：① 缺乏对制备过程关键细节的描述，读者无法重复实验结果；② 工艺描述中以百分比或倍数等相对值代替绝对值，读者无法对不同研究结果比较；③ 终产品中主要成分缺乏量化描述，令读者无法判断产品起效机制；④ 使用的语言和命名缺乏准确性和规范性，因此无法判定为何相似报道而研究结论却相差悬殊等问题。
Chahla 等[21]分析了 105 篇相关论文后发现，只有 11 篇论文完整清晰地描述了制备方案，17 篇论文对最终 PRP 组成进行了量化描述。对于 PRP 的制备过程，有 4% 报道中缺失血液初始体积，78% 报道缺失血液中初始血小板浓度，48% 报道缺失采血用抗凝剂种类，28% 报道未写明离心机种类，37% 报道中离心参数和时间不完整，36% 报道完全没有描述 PRP 激活与否。在 PRP 组成方面，仅有 26% 报道分析了 PRP 中血小板浓度，56% 报道以血小板倍数于初始血液的形式体现，13% 报道了 EGF 等细胞因子含量，57% 报道了 PRP 终体积。因此 Chahla 等提出在撰写富血小板技术文章时，需要将初始血液体积、抗凝剂种类及浓度、制备技术（包括离心机型号、转子直径、速度、离心时间）、激活剂种类、最终 PRP 产品中血小板浓度、单核细胞浓度、红细胞浓度等 7 类参数作为基本参数进行报告。在 PRP 的血小板数量方面，多数研究者习惯以 3～7 倍于初始血液中血小板浓度的方式来报道 PRP 制备工艺，但这种相对标准会因患者基础血小板浓度的巨大差别［（100～300）×109/L］，造成实际应用效果不同，因此将实际 PRP 中血小板浓度、注射 PRP 体积和到达组织内血小板总数作为重要标准化参数报道显得尤其重要。
Fadadu 等[22]对比了 33 个制备方案，发现制备工艺差异导致无法从血小板浓度推论关键修复因子浓度的高低，因此他建议撰写血小板衍生物研究与应用文章时，报告参数应尽量全面；同时，他也提出了最低报告参数的概念，其中特别要求将白细胞中的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞比例作为最低报告参数，关键生长因子中将 PDGF-AB、TGF-β1 和 VEGF 含量作为最低报告参数，以便在无全面报告技术细节时也能获得相对清晰的研究思路。
3 血小板衍生物制备技术的质量标准化管理
血小板衍生物的制备工艺差别很大，导致其质量的标准化管理难度较大。多数文献推荐采用口径大的采血针，以防止采血针过细、过长使得血小板在采血过程中即被激活或形成聚集[23]。在采血管选择上，使用 ACD-A 抗凝剂更有利于防止因血小板聚团对产品质量的影响[24]，而玻璃采血管内壁会导致血液中血小板提前激活。在温度控制方面，样本处理过程中低温可能会影响血小板活性，美国血库协会（AABB）建议对血小板采集、处理和保存温度均勿低于 20℃。不良的移液枪使用习惯将造成血小板提前激活，降低有效血小板浓度[25]。在离心操作中，离心速度或离心次数均会造成血小板一定程度激活；适中的离心速度有利于浓缩后血小板分散；离心力超过 800×g 后 TGF-β 释放浓度将出现下降，而超过 3000×g 将破坏血小板活性。因此，Ozer 等[26]建议采取短时间高速离心或长时间低速离心来保证血小板的稳定。目前有数十家生物医疗技术公司推出了商业化的血小板衍生物制备装置，采用固定装置和操作参数，可在一定程度上减少人为操作误差，更易实现质量标准化管理。吕汝举等[27]强调了商品化制备装置的无菌性要求应该符合中国国家药品监督管理局Ⅲ类器械管理规定。在自体化产品质量控制有难度的情况下，开展同种异体化产品的标准化管理，是未来发展趋势。Rebulla 等[28]报道了意大利脐血网络（ITCBN）通过标准化管理制备脐血血小板浓缩物的研究，该组织通过制定标准化离心速度和时间［第 1 次离心（200～210）×g、10～15 min，第 2 次离心（1800～2600）×g、15 min］，统一了 13 家脐血库制备脐血来源血小板浓缩物的工艺。采用同种异体成人外周血或脐带血进行 PL 制备，是最具标准化控制可行性的血小板衍生物生产方案[29]。Viau 等[30]对每批次制备 PL 时的供者数量与 hPL 产品间各参数变异率（coefficients of variation，CV）进行研究，通过蛋白组学分析和生物学特性分析，发现将血小板供者数量由 5 个增加至超过 200 个后，hPL 批次之间各参数 CV 值显著下降，总蛋白 CV 值从 16.06% 降至 4.74%、TGF-β1 从 18.38% 降至 7.92%、IGF-1 从 30.67% 降至 5.51%、VEGF 从 30.80% 降至 6.41%。因此，超过 200 个供者的大规模 hPL 制备具有极强的产品均一化、标准化特性，用 hPL 培养获得的 BMSCs 比 FBS+bFGF 培养获得的细胞大小更均一、细胞表面颗粒明显减少，批次之间细胞表面标志物 CD13、CD44、CD59、CD90 和 CD166 的 CV 值显著降低。
长期以来，PRP 和 PRF 作为在病床边分离、制备的自体产品，虽然不涉及病原微生物交叉传染，但存在操作过程带来的安全风险。迪拜国家卫生部门（DHA）和加拿大阿尔伯塔省外科医师学院分别在 2014 年和 2018 年出台了 PRP 管理指南，均特别强调了操作控制微生物污染的重要性。目前，PL 自体产品在临床中的应用逐渐增加，其临床安全控制也成为从研发到转化的重要一环[31]。同种异体来源的 PL 产品，不管是作为临床用细胞培养基添加物，还是作为单独的临床治疗生物制剂，控制传染性病原体都是质量标准化管理中的首要任务。各类文献报道中，制备药品生产质量管理规范（GMP）级别的 PL 产品供者数量在 4～200 个之间[30, 32]，虽然供者数量增加有助于实现 PL 批次之间的质量均一[30]，但也增加了病原体污染风险。因此，2019 年国际血液移植协会（ISBT）细胞治疗工作组发表了 hPL 生产全过程质量控制的声明[33]，建议生产每批次 PL 产品供者数量限制在 10～16 个。声明同时推荐了一套完整的标准化安全控制流程，包括：① 供者血液层面的严格病原微生物检测、筛选；② 小批量和规模化制备异体 hPL 中的过程病原体检测、灭活及终产品病原体检测、灭活。同时，为了实现标准化管理，声明中推荐了 hPL 终产品的各类检测参数及其范围，检测类别涵盖无菌、生化分析、免疫学分析，以及 PDGF-AB 和 TGF-β1 两个重要因子分析等内容，这是专业协会首次对 PL 产品公布的标准化声明（表 2）。
表2
ISBT 推荐的 hPL 质量标准化管理参数
Table2.
ISBT suggested standardized quality control of hPL
4 血小板衍生物临床应用的规范化管理
复杂的血小板衍生物组成、多样的制备工艺以及颇具难度的质量标准化控制，促使富血小板技术领域专业协会也试图通过分析大数据和积累的经验，根据不同疾病特点总结并发布临床应用指南或共识，为更好地发挥产品的临床价值提供参考。国际细胞医疗学会（ICMS）推荐[34]在临床应用中血小板激活过程不宜过于强烈，特别是在软组织修复中，可以不采用体外激活方式，而是通过组织中胶原对血小板自发激活方式，实现生物活性因子连续 3 d 释放。同时 ICMS 将富血小板产物应用的禁忌证分为绝对禁忌证和相对禁忌证，并在医生培训、用针、随访、风险等方面均进行了规范性描述。2018 年，中国医疗保健国际交流促进会骨科分会提出了 PRP 在骨关节外科中应用的专家共识[35]，共识提出了尽量使用新鲜制备的 PRP，采用直视或者利用超声引导方式向关节腔内多次注射 PRP 产品，每次注射剂量为 3～5 mL 等建议。同年，该学会按照循证医学证据，还发布了治疗膝骨关节炎的临床实践指南[8]，指南中提到关节腔内注射 PRP 更适用于年轻、严重程度轻的膝骨关节炎患者；关节注射次数不少于 2 次，间隔时间不少于 1 周；针对伴有关节腔积液的膝骨关节炎患者，建议抽吸积液后再接受关节腔注射治疗。在临床应用适应证方面，Le 等[3]根据文献报道的临床研究结果，建议采用富含白细胞的 PRP 治疗肱骨外上髁炎，而去白细胞 PRP 更适用于骨关节炎的治疗。
在临床应用政策监管方面，美国食品药品监督管理局（FDA）对 PRP 的制备套装按照医疗器械 510（K）实施放行管理[36]，对用于临床细胞培养添加物的 PL 按照细胞培养辅助成分进行分类和风险管理[33]。中国国家药品监督管理局对 PRP 制备用套装按照Ⅲ类医疗器械进行审批管理[27]。欧盟将 PRP、PRF 按照血液成分的制备、使用和质量保证方式管理[37]，将用于临床细胞培养的 PL 按照药典中生物来源的原材料进行管理[38]。作为欧盟成员之一的西班牙，在欧盟规范基础上，2015 年更是将 PRP 提升至按药物进行管理[39-40]。日本厚生劳动省则根据再生医学产品安全法案将 PC 按照以细胞为基础的医学产品中第三风险级别（涉及细胞的、进行最小操作的低风险治疗产品）进行管理[41]。由此看来，目前大多数国家是按照自体医疗技术对自体富血小板产品进行管理，部分国家逐渐开始建立新的更趋向于药物管理的方式进行监管，而对更易实现质量标准化、制备规模化的同种异体 PL 产品，按照再生医学药物管理模式的方向发展[33]。
5 总结
血小板衍生物含有 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等大量促进细胞生长、趋化、黏附、免疫调节和组织修复成分，属于再生医学技术产品。PRP 和 PRF 长期被用于骨科、皮肤损伤、颌面外科、神经损伤等领域的组织修复和再生，而 PL 作为血小板衍生物家族的新成员在细胞培养和组织损伤修复中发挥越来越大的作用。血小板衍生物由于受供者差异、操作个性化强、工艺参数差距大等因素影响，其标准化和量化控制问题一直是制约临床效果的关键。采用标准化命名和标准化撰写报告系统，将促进研究者报道的准确性和完整性，从而获得可重复性验证；采用良好操作模式以及质量标准化控制，并利用产品异体化来获得安全性和稳定性效果，是血小板衍生物实现量化、标准化以及从技术发展为再生医学药物的必经之路。
作者贡献：谢兴琴负责稿件撰写；张怡负责综述构思、设计和逻辑把控；赵新新负责文献检索；刘瞳昕负责资料归纳、整理；孙丽萍负责修订、校对。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费没有影响文章观点。
