引用本文： 李媛媛, 陈丹, 吴蓓. 过表达低氧诱导因子 1α 对乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞分化影响的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(6): 761-768. doi: 10.7507/1002-1892.202012024 复制
MSCs 具有多向分化和自我更新特点，在胚胎发育和组织再生中发挥着重要作用[1]。目前研究已发现了一些与牙齿相关的 MSCs 群体，例如来自恒牙的牙髓干细胞、来自人类脱落乳牙的牙髓干细胞（stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth，SHED）和来自多生牙顶端乳头的干细胞。研究发现[2-3]，人牙髓 MSCs 可以分化为成骨细胞和内皮细胞，其中 CD31 和 CD146 呈阴性的亚群 SHED 能通过分泌 VEGF 等促血管生成因子刺激血管形成。有研究表明[4]，SHED 还具有分化为血管内皮细胞的能力。但目前对于促血管生成因子参与调控 SHED 分化的分子机制知之甚少。
低氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）是低氧条件下产生的具有转录活性的蛋白，能与 β 亚基结合形成二聚体复合物，进而调控下游多种靶基因的表达，参与调控细胞促血管生成蛋白的表达水平。研究表明[5-6]，HIF-1α 联合 BMP-6 蛋白过表达能增强 BMSCs 在低氧状态下的促血管生成能力，并促进细胞核内 β-连环蛋白（β-catenin）的表达。而 β-catenin 是经典 Wnt/β-catenin 信号通路的关键因子，下调该信号通路能抑制血管新生[7]。但 HIF-1α 能否通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路影响 SHED 分化尚不清楚。为此，本研究通过构建 HIF-1α 过表达 SHED，探讨 HIF-1α 对 SHED 向血管内皮细胞定向分化的影响以及可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
滞留乳牙来源于电子科技大学医学院附属妇女儿童医院收治的 12 名 8～12 岁健康儿童，其家属签署知情同意书。
HIF-1α 过表达质粒及其阴性对照空载质粒的构建以及慢病毒（8×108 PFU/mL）包装、浓缩及纯化，均由吉满生物科技（上海）有限公司完成。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂 IWR-1（MedChemExpress 公司，美国）；胰蛋白酶、FBS、Ⅰ型胶原酶、DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；Matrigel（Sigma 公司，美国）；HIF-1α 抗体、β-catenin 抗体、GAPDH 抗体（CST 公司，美国）；磷酸化糖原合酶激酶 3β（phosphate-glycogen synthasc kinase 3β，p-GSK3β）抗体（Tyr216；Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；荧光标记流式抗体 PE-血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、PE-CD73、FITC-CD90、APC-CD105、APC-CD45、PE-STRO-1、FITC-CD31（BD Biosciences 公司，美国）。BX51 荧光显微镜（Olympus 公司，日本）。
1.2 SHED 分离培养及鉴定
1.2.1 SHED 分离培养
牙髓组织用无菌 PBS 和 1% 青霉素/链霉素清洗后，切成约 1 mm×1 mm 大小；加入 3 mg/mLⅠ型胶原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶，于 37℃ 消化 30 min；置于含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基培养，待细胞融合达 70% 后，按 1∶2 比例传代，取第 3 代 SHED 进行后续实验。
1.2.2 SHED 鉴定
取第 3 代细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面分子标志物 CD73、CD90、CD105、CD45 和 STRO-1 表达水平；采用成骨诱导剂对细胞进行成骨诱导分化 14 d 后，行茜素红和 ALP 染色观察细胞成骨分化能力。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 实验分组
实验分为 5 组，分别为空白对照组（未经任何处理的 SHED）、空载组（感染空载慢病毒的 SHED）、HIF-1α 过表达组（感染 HIF-1α 过表达慢病毒的 SHED）、Wnt 抑制剂组（经 1 μmol/L IWR-1 干预的 SHED）和联合组（感染 HIF-1α 过表达慢病毒并经 1 μmol/L IWR-1 干预的 SHED）。
1.3.2 慢病毒感染方法及观测
① 感染方法：取对数生长期第 3 代 SHED，以 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，待细胞融合至 70% 时，以病毒感染复数值 50 加入 HIF-1α 过表达慢病毒或空载慢病毒感染 SHED，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 12 h 后，更换新鲜培养液，继续培养 72 h。② 观测指标：采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 法检测空白对照组、空载组及 HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 和蛋白的表达水平，观察转染效率。相关引物序列见表 1。
表1
实时荧光定量 PCR 检测各基因引物序列
Table1.
The primer sequence of the genes by qRT-PCR
1.3.3 Wnt 抑制剂干预方法
取未经任何处理的 SHED 和感染 HIF-1α 过表达慢病毒的 SHED，以 2×105个/孔密度接种于 6 孔板中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后，加入 1 μmol/L IWR-1 培养 48 h。
1.3.4 诱导 SHED 向血管内皮细胞分化
取 5 组 SHED 按照 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，采用 DMEM 培养基于 37℃、5%CO2 培养箱培养 24 h；待细胞完全贴壁后，更换诱导培养基[8]（含 2%FBS、50 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF、0.1 mg/L 地塞米松、2 g/L 牛血清白蛋白、1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基）进行定向诱导，每 2 天换液 1 次。其中，Wnt 抑制剂组和联合组在换液时同时加入 IWR-1。定向诱导分化 14 d 后进行以下观测。
1.4 观测方法
1.4.1 实时荧光定量 PCR 检测
各组 SHED 采用 Trizol 法提取总 RNA，分光光度仪测定总 RNA 含量及浓度，再使用逆转录酶试剂盒将 RNA 反转录到 cDNA，根据实时荧光定量 PCR 试剂盒说明书进行扩增。扩增条件：95℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 15 s，56℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 30 s，40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2–ΔΔCt法计算血管细胞黏附分子 1（vascular cell adhesion protein 1，VACM-1）、VEGF 受体-2 KDR（Kinase-inserted domain containing receptor）、血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin，VE）基因相对表达量。引物序列见表 1。实验重复 3 次。
1.4.2 流式细胞仪检测
各组 SHED 经胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，分别加入 PE-vWF 和 FITC-CD31，充分混匀后室温避光孵育 20 min，PBS 洗涤 3 次；以离心半径 10 cm、500 r/min 离心 5 min，加入 500 μL PBS 重悬，上流式细胞仪检测，计算阳性细胞百分比。
1.4.3 Western blot 检测
各组 SHED 加入细胞裂解液后于冰上静置 30 min，4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 20 min，取上清液，使用 BCA 试剂盒检测上清液蛋白浓度。然后用 10%SDS-PAGE 进行电泳，将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，分别加入一抗 p-GSK3β、β-catenin 和 GAPDH，4℃ 孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的 IgG 二抗，常温孵育 1 h，加入 ECL 发光液，显影和定影后将得到的胶片放入凝胶图像分析仪曝光及拍照，分析目的条带。以目的蛋白灰度值与 GAPDH 灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4.4 Matrigel 基质胶成管实验
取 96 孔板，每孔滴加 50 μL Matrigel，37℃ 恒温孵箱放置 30 min，待其凝固成胶状后备用。取各组 SHED 按照 5×103个/孔密度接种于覆盖 Matrigel 的 96 孔板，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 12 h。倒置显微镜下观察细胞成管情况，随机取 5 个视野统计小管形成数量，取均值。
1.4.5 DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）吞噬实验
各组 SHED 以 5×103个/孔密度接种至 96 孔板中，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，待细胞融合达 80%，弃培养液，加入含 10 μg/mL DiI-Ac-LDL 的无血清 DMEM 基础培养基，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 6 h，滴加 DAPI 避光染核 5 min，预冷 PBS 浸洗 3 次。荧光显微镜下观察，以红色荧光强度值表示细胞吞噬脂质能力。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SHED 鉴定
流式细胞仪检测示 SHED 表面抗原 CD73、CD90、CD105 以及 STRO-1 呈阳性，CD45 呈阴性（图 1a）。成骨诱导培养 14 d 后，茜素红染色呈阳性，镜下可见大量红色钙化结节（图 1b）；ALP 染色呈阳性，镜下可见细胞质内出现大量蓝黑色沉淀（图 1c）。
图1
SHED 鉴定观察
a. 流式细胞仪检测；b. 成骨诱导培养 14 d 后茜素红染色（×200）；c. 成骨诱导培养 14 d 后 ALP 染色（×200）
Figure1. Identification observation of SHEDa. Flow cytometry detection; b. Alizarin red staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200); c. ALP staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200)
2.2 慢病毒感染细胞观测
实时荧光定量 PCR 检测示空白对照组、空载组及 HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 相对表达量分别为 1.02±0.42、1.42±0.62、248.75±43.55；Western blot 检测示 HIF-1α 蛋白相对表达量分别 0.09±0.08、0.12±0.09、1.52±0.16。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 和蛋白相对表达量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测慢病毒感染后各组 HIF-1α 蛋白表达1：空白对照组 2：空载组 3：HIF-1α 过表达组
Figure2.
Expression of HIF-1α protein after lentivirus transfection detected by Western blot
1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group
2.3 SHED 向内皮细胞诱导分化后检测
2.3.1 实时荧光定量 PCR 检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 VCAM-1、KDR、VE mRNA 相对表达量增加（P<0.05），而 Wnt 抑制剂组相对表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组上述指标 mRNA 相对表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
各组 VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相对表达量比较
Figure3.
Comparison of VCAM-1, KDR, and VE mRNA relative expressions between groups
2.3.2 流式细胞仪检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比增加，而 Wnt 抑制剂组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4、5。
图4
流式细胞仪检测各组 vWF 和 CD31 表达
从左至右分别为空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组、联合组 a. vWF；b. CD31
Figure4. The expressions of vWF and CD31 detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, empty group, HIF-1α overexpression group, Wnt inhibitor group, and combination group, respectively a. vWF; b. CD31
图5
各组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比比较
Figure5.
Comparison of percentages of vWF and CD31 positive cells between groups
2.3.3 Western blot 检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组细胞中 β-catenin 蛋白相对表达量增加、p-GSK3β 蛋白相对表达量降低，而 Wnt 抑制剂组 β-catenin 蛋白相对表达量降低、p-GSK3β 蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组 β-catenin 蛋白相对表达量降低、p-GSK3β 蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
Western blot 检测各组 β-catenin 及 p-GSK3β 蛋白表达
a. 电泳图 1：空白对照组 2：空载组 3：HIF-1α 过表达组 4：Wnt 抑制剂组 5：联合组；b. 目的蛋白相对表达量比较
Figure6. Expressions of β-catenin and p-GSK3β proteins in each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group 4: Wnt inhibitor group 5: Combination group; b. Comparison of relative expressions of target proteins
2.3.4 Matrigel 基质胶成管实验
空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组及联合组小管形成数量分别为（27.33±4.56）、（28.66±5.21）、（89.00±6.62）、（8.00±3.15）、（51.33±7.52）个。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组小管形成数量增加，而 Wnt 抑制剂组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与 HIF-1α 过表达组比较，联合组小管形成数量明显降低（P<0.05）。见图 7。
图7
各组小管形成观察（倒置显微镜×200）
a. 空白对照组；b. 空载组；c. HIF-1α 过表达组；d. Wnt 抑制剂组；e. 联合组
Figure7. Observation of tubule formation in each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
2.3.5 DiI-Ac-LDL 吞噬实验
空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组及联合组红色荧光强度值分别为 100.00±10.82、103.33±14.56、756.66±88.42、21.00±9.84、234.66±70.43。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组细胞吞噬脂质能力明显提高（P<0.05），而 Wnt 抑制剂组明显降低（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组细胞吞噬脂质能力明显降低（P<0.05）。见图 8。
图8
各组细胞吞噬能力观察（荧光显微镜×400）
a. 空白对照组；b. 空载组；c. HIF-1α 过表达组；d. Wnt 抑制剂组；e. 联合组
Figure8. Observation of phagocytic capacity of cells in each group (Fluorescence microscope×400)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
3 讨论
乳牙向成人恒牙的过渡是一个非常独特的动态过程，恒牙发育和萌出与乳牙牙根的吸收相协调。人类可能需要超过 7 年才能完成 20 颗乳牙的有序替换[9]。自然脱落的乳牙在某些方面类似于无髓牙，含有干细胞，可能作为临床独特的干细胞来源[10]。血管生成是形成新血管的过程，被定义为前体细胞向内皮细胞的分化[11]。有研究表明[12]，牙髓干细胞参与了血管生成过程，但相关作用机制鲜少报道。
HIF 是细胞适应低氧过程中的关键效应因子。HIF-1 对血管发育至关重要，HIF-1α 或 HIF-1β 缺失会影响血管系统的形成[13]。HIF-1α 是公认的血管生成途径关键因子，在血管生成过程中起着重要作用。研究表明[14]，以 HIF-1α 通路为靶点，上调其表达水平能促进血管生成，可以成功修复大面积损伤。HIF-1α 不仅对细胞具有促血管生成作用，还对 MSCs 的分化过程起重要调控作用。研究发现，在 HIF-1α 介导的长期缺氧条件下，BMSCs 出现脂肪细胞样的表型和细胞内脂滴的积聚，其向脂肪细胞分化得到促进[15]。另外，HIF-1α 参与介导的低强度间歇负压通过促进胶原纤维蛋白Ⅰ、VEGF 以及骨保护素的表达水平，诱导 MSCs 向骨细胞分化[16]。本研究首先采用 vWF 和 CD31 作为鉴定血管内皮细胞表型标志物，结果显示 HIF-1α 过表达组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比明显增加，VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相对表达量也明显增加，细胞体外成管能力以及吞噬能力均提高，表明 HIF-1α 过表达能够促进 SHED 向血管内皮细胞分化。
Wnt/β-catenin 是经典的 Wnt 信号通路，也是进化上十分保守的信号通路，在胚胎发生和成体动物组织内稳态维持过程中，对干细胞更新、细胞增殖和细胞分化具有重要调控作用[17]。研究发现，抑制 Wnt/β-catenin 信号通路能抑制 BMSCs 的分化潜能[18]。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信号通路中重要调控因子，作为一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能促进 β-catenin 降解，使 Wnt/β-catenin 信号通路失活[19]，但在 SHED 分化过程中 GSK3β 与 Wnt/β-catenin 信号通路活性的相关机制尚不清楚。本研究结果显示，HIF-1α 过表达能够上调 SHED 向血管内皮细胞分化过程中 β-catenin 蛋白表达，抑制 GSK3β 蛋白磷酸化水平，提示 HIF-1α 促进 SHED 向血管内皮细胞分化的机制可能与 Wnt/β-catenin 信号通路激活有关。有研究显示[20]，激活 Wnt/β-catenin 信号通路能够促进 SHED 的多向分化。相反，用小分子抑制剂或 β-catenin 基因沉默阻断 Wnt/β-catenin 信号通路，可阻止牙髓干细胞的血管生成分化[21]。这些研究表明，牙髓干细胞可以通过一个与早期胚胎发育过程中血管生成过程非常相似的过程，被诱导分化为血管内皮细胞，形成新生血管，而 Wnt/β-catenin 信号通路在调节这一过程中起着关键作用，即该信号通路是决定调节成骨细胞/成牙本质细胞分化或血管内皮细胞分化的“开关”。本研究结果也提示，Wnt 抑制剂 IWR-1 干预能够抑制 SHED 向血管内皮细胞定向分化过程中 vWF、CD31、VCAM-1、KDR 和 VE 的表达，同时也降低细胞体外成管能力以及吞噬能力。但进一步观察发现采用 Wnt 抑制剂 IWR-1 干预能够抑制 HIF-1α 过表达对 SHED 向血管内皮细胞分化的促进作用，表明 HIF-1α 可能通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路促进 SHED 向血管内皮细胞分化。
综上述，HIF-1α 过表达能明显促进 SHED 向血管内皮细胞分化，上调血管内皮细胞因子表达，这可能是通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路来实现的。
作者贡献：陈丹负责实验设计；李媛媛和吴蓓负责实验实施、文献查询以及实验结果整理；李媛媛负责实验结果的分析和文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经电子科技大学医学院附属妇女儿童医院医学伦理委员会批准（D20200113JL）。
MSCs 具有多向分化和自我更新特点，在胚胎发育和组织再生中发挥着重要作用[1]。目前研究已发现了一些与牙齿相关的 MSCs 群体，例如来自恒牙的牙髓干细胞、来自人类脱落乳牙的牙髓干细胞（stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth，SHED）和来自多生牙顶端乳头的干细胞。研究发现[2-3]，人牙髓 MSCs 可以分化为成骨细胞和内皮细胞，其中 CD31 和 CD146 呈阴性的亚群 SHED 能通过分泌 VEGF 等促血管生成因子刺激血管形成。有研究表明[4]，SHED 还具有分化为血管内皮细胞的能力。但目前对于促血管生成因子参与调控 SHED 分化的分子机制知之甚少。
低氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）是低氧条件下产生的具有转录活性的蛋白，能与 β 亚基结合形成二聚体复合物，进而调控下游多种靶基因的表达，参与调控细胞促血管生成蛋白的表达水平。研究表明[5-6]，HIF-1α 联合 BMP-6 蛋白过表达能增强 BMSCs 在低氧状态下的促血管生成能力，并促进细胞核内 β-连环蛋白（β-catenin）的表达。而 β-catenin 是经典 Wnt/β-catenin 信号通路的关键因子，下调该信号通路能抑制血管新生[7]。但 HIF-1α 能否通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路影响 SHED 分化尚不清楚。为此，本研究通过构建 HIF-1α 过表达 SHED，探讨 HIF-1α 对 SHED 向血管内皮细胞定向分化的影响以及可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
滞留乳牙来源于电子科技大学医学院附属妇女儿童医院收治的 12 名 8～12 岁健康儿童，其家属签署知情同意书。
HIF-1α 过表达质粒及其阴性对照空载质粒的构建以及慢病毒（8×108 PFU/mL）包装、浓缩及纯化，均由吉满生物科技（上海）有限公司完成。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂 IWR-1（MedChemExpress 公司，美国）；胰蛋白酶、FBS、Ⅰ型胶原酶、DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；Matrigel（Sigma 公司，美国）；HIF-1α 抗体、β-catenin 抗体、GAPDH 抗体（CST 公司，美国）；磷酸化糖原合酶激酶 3β（phosphate-glycogen synthasc kinase 3β，p-GSK3β）抗体（Tyr216；Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；荧光标记流式抗体 PE-血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、PE-CD73、FITC-CD90、APC-CD105、APC-CD45、PE-STRO-1、FITC-CD31（BD Biosciences 公司，美国）。BX51 荧光显微镜（Olympus 公司，日本）。
1.2 SHED 分离培养及鉴定
1.2.1 SHED 分离培养
牙髓组织用无菌 PBS 和 1% 青霉素/链霉素清洗后，切成约 1 mm×1 mm 大小；加入 3 mg/mLⅠ型胶原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶，于 37℃ 消化 30 min；置于含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基培养，待细胞融合达 70% 后，按 1∶2 比例传代，取第 3 代 SHED 进行后续实验。
1.2.2 SHED 鉴定
取第 3 代细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面分子标志物 CD73、CD90、CD105、CD45 和 STRO-1 表达水平；采用成骨诱导剂对细胞进行成骨诱导分化 14 d 后，行茜素红和 ALP 染色观察细胞成骨分化能力。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 实验分组
实验分为 5 组，分别为空白对照组（未经任何处理的 SHED）、空载组（感染空载慢病毒的 SHED）、HIF-1α 过表达组（感染 HIF-1α 过表达慢病毒的 SHED）、Wnt 抑制剂组（经 1 μmol/L IWR-1 干预的 SHED）和联合组（感染 HIF-1α 过表达慢病毒并经 1 μmol/L IWR-1 干预的 SHED）。
1.3.2 慢病毒感染方法及观测
① 感染方法：取对数生长期第 3 代 SHED，以 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，待细胞融合至 70% 时，以病毒感染复数值 50 加入 HIF-1α 过表达慢病毒或空载慢病毒感染 SHED，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 12 h 后，更换新鲜培养液，继续培养 72 h。② 观测指标：采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 法检测空白对照组、空载组及 HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 和蛋白的表达水平，观察转染效率。相关引物序列见表 1。
表1
实时荧光定量 PCR 检测各基因引物序列
Table1.
The primer sequence of the genes by qRT-PCR
1.3.3 Wnt 抑制剂干预方法
取未经任何处理的 SHED 和感染 HIF-1α 过表达慢病毒的 SHED，以 2×105个/孔密度接种于 6 孔板中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后，加入 1 μmol/L IWR-1 培养 48 h。
1.3.4 诱导 SHED 向血管内皮细胞分化
取 5 组 SHED 按照 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，采用 DMEM 培养基于 37℃、5%CO2 培养箱培养 24 h；待细胞完全贴壁后，更换诱导培养基[8]（含 2%FBS、50 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF、0.1 mg/L 地塞米松、2 g/L 牛血清白蛋白、1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基）进行定向诱导，每 2 天换液 1 次。其中，Wnt 抑制剂组和联合组在换液时同时加入 IWR-1。定向诱导分化 14 d 后进行以下观测。
1.4 观测方法
1.4.1 实时荧光定量 PCR 检测
各组 SHED 采用 Trizol 法提取总 RNA，分光光度仪测定总 RNA 含量及浓度，再使用逆转录酶试剂盒将 RNA 反转录到 cDNA，根据实时荧光定量 PCR 试剂盒说明书进行扩增。扩增条件：95℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 15 s，56℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 30 s，40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2–ΔΔCt法计算血管细胞黏附分子 1（vascular cell adhesion protein 1，VACM-1）、VEGF 受体-2 KDR（Kinase-inserted domain containing receptor）、血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin，VE）基因相对表达量。引物序列见表 1。实验重复 3 次。
1.4.2 流式细胞仪检测
各组 SHED 经胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，分别加入 PE-vWF 和 FITC-CD31，充分混匀后室温避光孵育 20 min，PBS 洗涤 3 次；以离心半径 10 cm、500 r/min 离心 5 min，加入 500 μL PBS 重悬，上流式细胞仪检测，计算阳性细胞百分比。
1.4.3 Western blot 检测
各组 SHED 加入细胞裂解液后于冰上静置 30 min，4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 20 min，取上清液，使用 BCA 试剂盒检测上清液蛋白浓度。然后用 10%SDS-PAGE 进行电泳，将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，分别加入一抗 p-GSK3β、β-catenin 和 GAPDH，4℃ 孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的 IgG 二抗，常温孵育 1 h，加入 ECL 发光液，显影和定影后将得到的胶片放入凝胶图像分析仪曝光及拍照，分析目的条带。以目的蛋白灰度值与 GAPDH 灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4.4 Matrigel 基质胶成管实验
取 96 孔板，每孔滴加 50 μL Matrigel，37℃ 恒温孵箱放置 30 min，待其凝固成胶状后备用。取各组 SHED 按照 5×103个/孔密度接种于覆盖 Matrigel 的 96 孔板，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 12 h。倒置显微镜下观察细胞成管情况，随机取 5 个视野统计小管形成数量，取均值。
1.4.5 DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）吞噬实验
各组 SHED 以 5×103个/孔密度接种至 96 孔板中，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，待细胞融合达 80%，弃培养液，加入含 10 μg/mL DiI-Ac-LDL 的无血清 DMEM 基础培养基，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 6 h，滴加 DAPI 避光染核 5 min，预冷 PBS 浸洗 3 次。荧光显微镜下观察，以红色荧光强度值表示细胞吞噬脂质能力。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SHED 鉴定
流式细胞仪检测示 SHED 表面抗原 CD73、CD90、CD105 以及 STRO-1 呈阳性，CD45 呈阴性（图 1a）。成骨诱导培养 14 d 后，茜素红染色呈阳性，镜下可见大量红色钙化结节（图 1b）；ALP 染色呈阳性，镜下可见细胞质内出现大量蓝黑色沉淀（图 1c）。
图1
SHED 鉴定观察
a. 流式细胞仪检测；b. 成骨诱导培养 14 d 后茜素红染色（×200）；c. 成骨诱导培养 14 d 后 ALP 染色（×200）
Figure1. Identification observation of SHEDa. Flow cytometry detection; b. Alizarin red staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200); c. ALP staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200)
2.2 慢病毒感染细胞观测
实时荧光定量 PCR 检测示空白对照组、空载组及 HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 相对表达量分别为 1.02±0.42、1.42±0.62、248.75±43.55；Western blot 检测示 HIF-1α 蛋白相对表达量分别 0.09±0.08、0.12±0.09、1.52±0.16。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 HIF-1α mRNA 和蛋白相对表达量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
Western blot 检测慢病毒感染后各组 HIF-1α 蛋白表达1：空白对照组 2：空载组 3：HIF-1α 过表达组
Figure2.
Expression of HIF-1α protein after lentivirus transfection detected by Western blot
1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group
2.3 SHED 向内皮细胞诱导分化后检测
2.3.1 实时荧光定量 PCR 检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 VCAM-1、KDR、VE mRNA 相对表达量增加（P<0.05），而 Wnt 抑制剂组相对表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组上述指标 mRNA 相对表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
各组 VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相对表达量比较
Figure3.
Comparison of VCAM-1, KDR, and VE mRNA relative expressions between groups
2.3.2 流式细胞仪检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比增加，而 Wnt 抑制剂组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4、5。
图4
流式细胞仪检测各组 vWF 和 CD31 表达
从左至右分别为空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组、联合组 a. vWF；b. CD31
Figure4. The expressions of vWF and CD31 detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, empty group, HIF-1α overexpression group, Wnt inhibitor group, and combination group, respectively a. vWF; b. CD31
图5
各组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比比较
Figure5.
Comparison of percentages of vWF and CD31 positive cells between groups
2.3.3 Western blot 检测
与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组细胞中 β-catenin 蛋白相对表达量增加、p-GSK3β 蛋白相对表达量降低，而 Wnt 抑制剂组 β-catenin 蛋白相对表达量降低、p-GSK3β 蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组 β-catenin 蛋白相对表达量降低、p-GSK3β 蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
Western blot 检测各组 β-catenin 及 p-GSK3β 蛋白表达
a. 电泳图 1：空白对照组 2：空载组 3：HIF-1α 过表达组 4：Wnt 抑制剂组 5：联合组；b. 目的蛋白相对表达量比较
Figure6. Expressions of β-catenin and p-GSK3β proteins in each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group 4: Wnt inhibitor group 5: Combination group; b. Comparison of relative expressions of target proteins
2.3.4 Matrigel 基质胶成管实验
空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组及联合组小管形成数量分别为（27.33±4.56）、（28.66±5.21）、（89.00±6.62）、（8.00±3.15）、（51.33±7.52）个。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组小管形成数量增加，而 Wnt 抑制剂组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与 HIF-1α 过表达组比较，联合组小管形成数量明显降低（P<0.05）。见图 7。
图7
各组小管形成观察（倒置显微镜×200）
a. 空白对照组；b. 空载组；c. HIF-1α 过表达组；d. Wnt 抑制剂组；e. 联合组
Figure7. Observation of tubule formation in each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
2.3.5 DiI-Ac-LDL 吞噬实验
空白对照组、空载组、HIF-1α 过表达组、Wnt 抑制剂组及联合组红色荧光强度值分别为 100.00±10.82、103.33±14.56、756.66±88.42、21.00±9.84、234.66±70.43。与空白对照组和空载组比较，HIF-1α 过表达组细胞吞噬脂质能力明显提高（P<0.05），而 Wnt 抑制剂组明显降低（P<0.05）。与 HIF-1α 过表达组比较，联合组细胞吞噬脂质能力明显降低（P<0.05）。见图 8。
图8
各组细胞吞噬能力观察（荧光显微镜×400）
a. 空白对照组；b. 空载组；c. HIF-1α 过表达组；d. Wnt 抑制剂组；e. 联合组
Figure8. Observation of phagocytic capacity of cells in each group (Fluorescence microscope×400)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
3 讨论
乳牙向成人恒牙的过渡是一个非常独特的动态过程，恒牙发育和萌出与乳牙牙根的吸收相协调。人类可能需要超过 7 年才能完成 20 颗乳牙的有序替换[9]。自然脱落的乳牙在某些方面类似于无髓牙，含有干细胞，可能作为临床独特的干细胞来源[10]。血管生成是形成新血管的过程，被定义为前体细胞向内皮细胞的分化[11]。有研究表明[12]，牙髓干细胞参与了血管生成过程，但相关作用机制鲜少报道。
HIF 是细胞适应低氧过程中的关键效应因子。HIF-1 对血管发育至关重要，HIF-1α 或 HIF-1β 缺失会影响血管系统的形成[13]。HIF-1α 是公认的血管生成途径关键因子，在血管生成过程中起着重要作用。研究表明[14]，以 HIF-1α 通路为靶点，上调其表达水平能促进血管生成，可以成功修复大面积损伤。HIF-1α 不仅对细胞具有促血管生成作用，还对 MSCs 的分化过程起重要调控作用。研究发现，在 HIF-1α 介导的长期缺氧条件下，BMSCs 出现脂肪细胞样的表型和细胞内脂滴的积聚，其向脂肪细胞分化得到促进[15]。另外，HIF-1α 参与介导的低强度间歇负压通过促进胶原纤维蛋白Ⅰ、VEGF 以及骨保护素的表达水平，诱导 MSCs 向骨细胞分化[16]。本研究首先采用 vWF 和 CD31 作为鉴定血管内皮细胞表型标志物，结果显示 HIF-1α 过表达组 vWF 和 CD31 阳性细胞百分比明显增加，VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相对表达量也明显增加，细胞体外成管能力以及吞噬能力均提高，表明 HIF-1α 过表达能够促进 SHED 向血管内皮细胞分化。
Wnt/β-catenin 是经典的 Wnt 信号通路，也是进化上十分保守的信号通路，在胚胎发生和成体动物组织内稳态维持过程中，对干细胞更新、细胞增殖和细胞分化具有重要调控作用[17]。研究发现，抑制 Wnt/β-catenin 信号通路能抑制 BMSCs 的分化潜能[18]。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信号通路中重要调控因子，作为一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能促进 β-catenin 降解，使 Wnt/β-catenin 信号通路失活[19]，但在 SHED 分化过程中 GSK3β 与 Wnt/β-catenin 信号通路活性的相关机制尚不清楚。本研究结果显示，HIF-1α 过表达能够上调 SHED 向血管内皮细胞分化过程中 β-catenin 蛋白表达，抑制 GSK3β 蛋白磷酸化水平，提示 HIF-1α 促进 SHED 向血管内皮细胞分化的机制可能与 Wnt/β-catenin 信号通路激活有关。有研究显示[20]，激活 Wnt/β-catenin 信号通路能够促进 SHED 的多向分化。相反，用小分子抑制剂或 β-catenin 基因沉默阻断 Wnt/β-catenin 信号通路，可阻止牙髓干细胞的血管生成分化[21]。这些研究表明，牙髓干细胞可以通过一个与早期胚胎发育过程中血管生成过程非常相似的过程，被诱导分化为血管内皮细胞，形成新生血管，而 Wnt/β-catenin 信号通路在调节这一过程中起着关键作用，即该信号通路是决定调节成骨细胞/成牙本质细胞分化或血管内皮细胞分化的“开关”。本研究结果也提示，Wnt 抑制剂 IWR-1 干预能够抑制 SHED 向血管内皮细胞定向分化过程中 vWF、CD31、VCAM-1、KDR 和 VE 的表达，同时也降低细胞体外成管能力以及吞噬能力。但进一步观察发现采用 Wnt 抑制剂 IWR-1 干预能够抑制 HIF-1α 过表达对 SHED 向血管内皮细胞分化的促进作用，表明 HIF-1α 可能通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路促进 SHED 向血管内皮细胞分化。
综上述，HIF-1α 过表达能明显促进 SHED 向血管内皮细胞分化，上调血管内皮细胞因子表达，这可能是通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路来实现的。
作者贡献：陈丹负责实验设计；李媛媛和吴蓓负责实验实施、文献查询以及实验结果整理；李媛媛负责实验结果的分析和文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经电子科技大学医学院附属妇女儿童医院医学伦理委员会批准（D20200113JL）。
