引用本文： 穆琳, 曾今实, 黄元亮, 林燕娴, 蒋海越, 滕利. 3D 生物打印脂肪来源干细胞联合甲基丙烯酰化明胶构建组织工程软骨的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(7): 896-903. doi: 10.7507/1002-1892.202101049 复制
由出生缺陷、感染、创伤、烧伤或癌症导致的耳廓畸形和缺损，对患者生理功能和心理状态有显著影响，耳廓重建是整形外科医生的难题之一。软骨细胞增殖率低、组织血管分布不良，成人耳廓软骨的再生和康复能力有限[1]。软骨组织工程技术为软骨缺损修复和重建提供了应用前景广阔的新选择。传统组织工程技术是将体外培养扩增的种子细胞种植到支架材料上，再进行体外培养或植入体内相应病损部位，对支架材料内部的细胞分布和密度难以精确控制。3D 生物打印技术能精确、快速实现支架复杂的宏观外形与内部微细结构的一体化构建，制备个性化修复体[2-3]，目前已成功打印出骨、软骨、肝单元、血管等组织器官[4-7]。
尽管 3D 生物打印在生物材料、生物分子及活细胞的精确空间分布和精细结构构建方面显示出巨大潜力，有望用于功能性耳廓支架的制备，但选择理想的生物材料和种子细胞组合用于软骨生物打印仍是一个难题。目前国内外软骨组织工程研究多采用软骨细胞和 BMSCs 作为种子细胞[8]，但二者均存在来源受限、供区副损伤等问题，因此在临床转化方面存在不足。而脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有易获得、创伤小、纯化率高、体外扩增速度快和免疫原性低等优点，且 3D 打印立体结构有利于 ADSCs 成软骨分化[9]。甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝胶因具备可打印、可调节的黏度、流变和凝胶化的物理特性以及适宜的生物特性，被广泛应用于各种生物医学领域[10-11]。本研究采用人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs）作为种子细胞，以 GelMA 水凝胶为载体，通过 3D 生物打印构建 hADSCs-GelMA 复合支架，并对其进行体内外成软骨实验研究，探讨该方法构建具有特定三维结构和生物学性能组织工程软骨的可行性，为应用 3D 生物打印技术构建组织工程软骨奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
5 周龄健康雌性裸鼠 20 只，体质量 18～24 g，由中国医学科学院整形外科医院实验动物中心提供。脂肪组织由在中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院接受脂肪抽吸手术患者自愿捐献。
L-DMEM 培养基、FBS、青链霉素、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（GIBCO 公司，美国）；成软骨、成脂、成骨诱导培养基（Cyagen 公司，美国）；人 MSCs 流式检测试剂盒（BD 公司，美国）；0.22 μm 针头过滤器（Millipore 公司，美国）；GelMA 冻干粉（上普博源北京生物科技有限公司）；一步法逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；活/死细胞活力检测试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；番红 O 染液（北京索莱宝科技有限公司）；抗Ⅱ型胶原抗体、山羊抗小鼠 IgG H&L（HRP）（Abcam 公司，英国）。
CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）；Bioplotter 3D 生物打印机（Envition tec 公司，德国）；倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；PCR 仪（Eppendorf 公司，德国）；LightCycler R 480Ⅱ实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系统（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c 微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；多功能酶标仪（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 hADSCs 分离、培养和鉴定
取脂肪组织加等体积 0.2%Ⅰ型胶原酶消化 60 min，离心后弃去含大量脂滴的上层及中间培养基层，加等体积 PBS 吹洗，100 μm 细胞滤网过滤；再次离心，弃上清，沉淀用适量完全培养基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基）重悬，接种于培养皿中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，每 2～3 天更换培养基。待细胞生长至 80% 融合时，以 0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA 消化后按 1∶3 比例传代。取第 3 代细胞，倒置显微镜观察细胞形态。
细胞鉴定：① 流式细胞术鉴定：采用人 MSCs 流式检测试剂盒检测细胞表面标志物 CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45 表达。② 诱导分化鉴定：取第 3 代细胞接种至 6 孔板中，完全培养基培养 72 h 后分别更换为成脂和成骨诱导培养基培养 21 d，行油红 O 染色和茜素红染色观察；取第 3 代细胞置于 15 mL 离心管中，成软骨诱导培养基培养 21 d，取细胞球制作石蜡切片，阿利新蓝染色观察。
1.3 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架
采用完全培养基将 GelMA 配制成 10%（W/V）溶液，于 75℃ 水浴加热至充分溶解后，用 0.22 μm 针头过滤器过滤除菌，与第 3 代 hADSCs 和光引发剂（2.5%LAP）均匀混合，配置成细胞终浓度为 4×106个/mL 的生物墨水。将打印温度设置为 21℃，气压 0.4 bar，打印线宽 320 μm，线间距 1.2 mm，打印的方形支架大小约为 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。按照上述参数逐层打印，每层打印后用 405 nm 紫外光光照交联 3～5 s，使载细胞 GelMA 水凝胶充分固化，得到 hADSCs-GelMA 复合支架，将其转移至培养皿中，加入完全培养基，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。48 h 后更换为成软骨诱导培养基培养。
1.4 观测指标
1.4.1 大体及扫描电镜观察
大体观察 hADSCs-GelMA 复合支架外观；于完全培养基培养 1 d 及成软骨诱导培养 14 d 行扫描电镜观察。
1.4.2 复合支架中细胞存活率检测
分别于培养 1、4、7 d 取 hADSCs-GelMA 复合支架样本，采用活/死细胞活力检测试剂盒进行活/死细胞染色，共聚焦荧光显微镜观察，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。每个样本任意选取图片中 5 个不同区域进行平均量化分析，用 Image pro plus 6.0 软件对图像进行色彩分类计数，按以下公式计算细胞存活率：活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。同时采用共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描（垂直间隔 100 μm）多层拟合图像，观察样本整体细胞分布及细胞密度变化。
1.4.3 复合支架中细胞增殖检测
培养 1、4、7 d 采用 CCK-8 法检测细胞增殖情况，每个时间点检测 3 个样本，每个样本设 3 个复孔。以 10%CCK-8 溶液作为空白对照，酶标仪上测定 450 nm 波长处每孔吸光度（A）值，以所测 A 值减去空白对照A值作为样本 A 值。
1.4.4 qRT-PCR 检测成软骨基因表达
取成软骨诱导培养 14 d 的复合支架为实验组，以 L-DMEM 完全培养基培养 14 d 的复合支架为对照组，用 Trizol 法提取复合支架中的总 RNA，NanoDrop 检测 RNA 浓度及纯度，并用一步法逆转录试剂盒行逆转录反应（1 000 ng RNA 体系），得到 cDNA。SYBR GREEN 法进行 qRT-PCR 检测软骨基质基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、成软骨调节因子 SOX9、软骨特异性基因Ⅱ型胶原蛋白（collagen typeⅡA1，COLⅡA1）、软骨肥大标志基因Ⅹ型胶原蛋白（collagen typeⅩA1，COLⅩA1）mRNA 的相对表达量，以 GAPDH 作为内参基因，对样本进行标准化校正，用 2–ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量，结果以实验组相比对照组基因表达量倍数表示。基因引物序列见表1。
表1
各基因引物序列（5'
3'）
Table1.
Primer sequences of genes (5'
3')
1.4.5 裸鼠皮下植入实验
取 20 只裸鼠经腹膜内注射 1% 戊巴比妥溶液麻醉后，于背部中线作一长约 1.2 cm 纵切口，向两侧侧腹部皮下分离形成囊袋，一侧植入体外成软骨诱导培养 14 d 的 3D 打印 hADSCs-GelMA 复合支架（实验组），另一侧植入不含细胞的空白 GelMA 水凝胶支架（对照组），4-0 可吸收线缝合切口。4 周后颈椎脱臼法处死裸鼠后取材，大体观察两组支架形态、大小和色泽，是否降解，以及与周围组织反应情况；两组样本以 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚 3 μm，常规行番红 O、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，评估组织结构和软骨细胞外基质沉积。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Turkey 法；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs 形态学观察及鉴定
倒置显微镜观察示，第 3 代细胞呈长梭形贴壁生长（图1）。流式细胞术鉴定示细胞表面标志物 CD73、CD90、CD105 表达为阳性，CD34、CD11b、CD19、CD45 表达为阴性（图2）。成脂、成骨、成软骨诱导培养 21 d，油红 O 染色可见大量脂滴，茜素红染色可见红色钙结节，阿利新蓝染色可见细胞间质蓝染（图3）。经鉴定，培养细胞为 hADSCs。
图1
第 3 代 hADSCs 形态观察（倒置显微镜×100）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hADSCs (Inverted microscope×100)
图2
hADSCs 流式细胞术鉴定
a. CD73；b. CD90；c. CD105；d. CD34、CD11b、CD19、CD45
Figure2. Flow cytometric identification of hADSCsa. CD73; b. CD90; c. CD105; d. CD34, CD11b, CD19, CD45
图3
诱导培养 21 d hADSCs 三系分化鉴定（倒置显微镜×100）
a. 油红 O 染色；b. 茜素红染色；c. 阿利新蓝染色
Figure3. Adipogenic, osteogenic, and chondrogenic induction of hADSCs after 21 days of culture (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining; b. Alizarin red staining; c. Alcian blue staining
2.2 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架相关观测
2.2.1 大体及扫描电镜观察
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架大小约 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，呈网格状，色半透明，质软；光镜下观察网格形状规则，线宽及间隔均匀（图4a）。扫描电镜观察示，完全培养基培养 1 d，支架形态稳定，网格状结构清晰规则，支架表面较光滑，未见明显孔隙；成软骨诱导培养 14 d，支架网格状结构仍清晰可见，但线宽和网格孔隙均缩小，细胞外基质紧密且均匀包裹支架，镜下形成凹凸不平的表面（图4b、c）。
图4
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架大体及扫描电镜观察
a. 大体观察；b. 培养 1 d 扫描电镜观察（×300）；c. 成软骨诱导培养 14 d 扫描电镜观察（×300）
Figure4. Gross and scanning electron microscope observation of 3D bioprinted hADSCs-GelMA composite scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation after cultured for 1 day (×300); c. Scanning electron microscope observation after chondrogenic induction cultured for 14 days (×300)
2.2.2 复合支架中细胞存活率检测
培养 1、4、7 d 支架内细胞存活率分别为 83.20%±1.27%、89.13%±1.36%、79.80%±1.97%，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描多层拟合图像示，支架内细胞分布均匀，培养 7 d 与 1 d 时比较，支架内细胞数量增加、密度增高（图6）。
图5
培养各时间点 hADSCs-GelMA 复合支架活/死细胞染色（共聚焦荧光显微镜×100）
a. 1 d；b. 4 d；c. 7 d
Figure5. Live/dead staining of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for different time points (Confocal fluorescence microscope×100)a. One day; b. Four days; c. Seven days
图6
hADSCs-GelMA 复合支架培养 1、7 d 共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描多层拟合图像（×100）
a. 1 d；b. 7 d
Figure6. Confocal fluorescence microscope panoramic mosaic scanning multilayer fitting image of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for 1 and 7 days (×100)a. One day; b. Seven days
2.2.3 复合支架中细胞增殖检测
CCK-8 法检测示，培养 1、4、7 d 样本 A 值分别为 0.155±0.002、0.325±0.026、0.410±0.004，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2.4 qRT-PCR 检测成软骨基因表达
培养 14 d qRT-PCR 检测示，实验组 ACAN、SOX9、COLⅡA1 和 COLⅩA1 mRNA 相对表达量分别为（6.976±2.739）×10-3、（2.641±1.250）×10-4、（1.712±0.491）×10-3、（2.337±0.013）×10-4，对照组分别为（6.203±1.395）×10-4、（1.821±0.085）×10-4、（1.034±0.056）×10-4、（3.570±0.141）×10-4，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组上述基因相对表达量分别为对照组的（11.5±0.1）、（1.5±0.1）、（17.0±1.0）和（0.7±0.0）倍。
2.2.5 裸鼠皮下植入实验
支架植入 4 周后大体观察示，两组裸鼠皮下植入区域仍可见方块状隆起。取材可见实验组支架较植入时略缩小变薄，呈白色，网格间隙中可见组织形成，韧性增强，剥离表面软组织可见有血管长入其中；对照组支架较植入时缩小变薄，呈半透明不规则凝胶状。见图7。
图7
支架植入裸鼠体内 4 周后大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Gross observation after 4 weeks of scaffold implanted into nude micea. Control group; b. Experimental group
番红 O 染色和阿利辛蓝染色示，实验组支架中分别可见红染和蓝染的软骨基质；对照组仅见材料染色，未见软骨细胞或基质沉积。免疫组织化学染色示，实验组支架中可见棕黄色Ⅱ型胶原特异性染色，且可见有软骨陷窝形成；对照组仅见材料非特异性染色。见图8。
图8
支架植入裸鼠后 4 周组织学和免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×200）
上、下分别为实验组和对照组 a. 番红 O 染色；b. 阿利新蓝染色；c. Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
Figure8. Histological and immunohistochemical observations after 4 weeks of scaffold implanted into nude mice (Inverted fluorescence microscope×200)The upper and lower for the experimental group and the control group, respectively a. Safranin O staining; b. Alcian blue staining; c. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining
3 讨论
耳廓再造是整形外科医生面临的最大挑战之一。目前主要方法是基于自体软骨或人工合成支架的耳廓再造术。然而，自体移植物存在吸收和供区并发症问题，人工合成的硅酮或聚乙烯移植物存在感染、挤压、生物相容性差和长期耐久性不确定等风险[12]。3D 生物打印是组织工程技术发展过程中兴起的一种新型增材制造技术，应用细胞、生物材料和生物分子在计算机辅助下进行分层打印，能够形成大小和形状精确、分辨率高、细胞分布均匀的具有生物学活性的三维组织结构，在软骨组织工程中具有巨大研究价值和应用前景。与其他组织工程研究的关键问题相似，选择理想的生物材料和种子细胞组合用于软骨生物打印是至关重要的一环。Kilian 等[13]应用人软骨细胞与一种基于海藻酸盐-甲基纤维素的生物墨水混合进行 3D 生物打印，证实在体外培养条件下有软骨细胞外基质产生，但细胞存活率仅 45%～75%。干细胞具有良好的增殖和分化潜能，为生物打印载细胞软骨支架提供了新的细胞类型，但打印过程中的细胞损伤给细胞存活、增殖和分化能力带来的影响亦不容忽视。
早期研究表明，光敏化水凝胶 GelMA 支持 BMSCs 的增殖和成软骨分化[14-15]，10%（W/V）GelMA 在打印后能维持良好的物理结构，并使 BMSCs 和人软骨细胞保持高细胞活性[16-17]。De Moor 等[18]采用高通量微孔培养系统培养人 BMSCs 球体，混合 GelMA 进行生物打印，结果表明 GelMA 具有良好的适打印性，且能维持人 BMSCs 球体的活性和软骨形成表型；该研究还表明，较低的水凝胶硬度可以进一步促进打印后的成软骨分化。因此，本研究选用 10%（W/V）GelMA 作为细胞载体构建 hADSCs-GelMA 复合支架，结果表明，3D 生物打印复合支架体外培养 14 d 三维结构稳定，未发生明显变形或塌陷；7 d 内细胞存活率保持在约 80%。本研究中，该复合支架细胞存活率先上升后下降，考虑与更换诱导分化培养基和静态培养方式有关，也可能是随体外培养时间延长，细胞外基质的沉积导致材料孔隙率下降，从而影响支架内部物质交换，进而导致长期培养后细胞死亡增加。
在种子细胞选择方面，本研究选用 hADSCs 进行成软骨研究。虽然目前国内外软骨组织工程研究多采用软骨细胞和 BMSCs 作为种子细胞，但二者在临床应用的转化均受到不同限制。健康人软骨细胞来源受限，往往需要获取大量自体软骨组织才能获得足够细胞进行组织构建，将会造成供区部位组织缺损和功能障碍，违背了研究的初衷。BMSCs 的优点在于可持续扩增，保持良好的多向分化潜能，但抽取骨髓既存在一定风险又给患者带来痛苦，且每个成人能获取的骨髓量有限（10～20 mL），因此限制了其应用。而 ADSCs 则具有以下优越性：① 脂肪组织容易获得，创伤小；② 相同培养条件下 ADSCs 增殖率更高；③ 在疾病微环境中，ADSCs 能够更好地维持细胞状态，发挥调节微环境的作用[19]；④ ADSCs 的人类白细胞抗原-ABC 表达较少，免疫排斥反应更低，更适用于同种异体移植[20]。在适打印性方面，本研究结果显示，hADSCs 在打印后细胞存活率与类似应用 BMSCs 的文献一致[16，21-22]，表明其细胞活力受打印过程剪切力、温度及光交联等因素影响不大，适用于 3D 生物打印。此外，本研究通过检测成软骨相关基因的表达，分析了 hADSCs 在打印后的分化能力。成软骨诱导培养 14 d 后，复合支架的软骨基质基因 ACAN、成软骨调节因子 SOX9 和软骨特异性基因 COLⅡA1 表达均显著上调，表明 hADSCs 在打印后仍具有良好的成软骨分化能力。而软骨肥大标志基因 ColⅩA1 表达下调，表明在成软骨诱导培养条件下，复合支架内的 hADSCs 分化形成的软骨细胞能够维持其表型，未出现早期肥大化的问题，可用于软骨组织工程支架的制备。
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架的体内成软骨能力也通过动物实验得到了证实。支架植入裸鼠体内 4 周后，实验组和对照组支架均较植入时缩小、变薄，虽然经组织学和免疫组织化学染色提示实验组有软骨细胞及基质形成，但软骨组织生成的速度较缓慢，与此同时水凝胶材料在动物体内被吸收并且发生降解，所以当材料的吸收和降解速度快于新生组织生成速度时，支架即可能出现体积缩小和形态变化的现象。因此，材料降解和吸收速度与组织形成速度不匹配是其作为组织工程材料需解决的一大难题。同时，本研究中制备的复合支架为胶冻状，虽三维结构稳定，但其力学强度远远未达到临床转化耳软骨的要求。有其他研究在生物墨水中加入磷酸三钙、生物玻璃、纳米纤维素和纳米复合材料等，以增强打印体的力学强度[23-26]。本研究可在此基础上进一步优化生物墨水材料及配比，以改进材料的生物力学性能，降低降解速率。我们也将继续评估支架内细胞的表型和迁移、蛋白水解活性以及材料吸收和降解速率，并与新的软骨组织形成相关联，以更好地理解 hADSCs 和交联 GelMA 水凝胶之间的相互作用，进一步解决组织形成和材料吸收降解速率相匹配的难题。
综上述，本研究通过 3D 生物打印技术制备了 hADSCs-GelMA 复合支架，其结构稳定，细胞存活率高，可于体内、外成软骨分化形成软骨组织，为应用 3D 生物打印技术构建组织工程软骨提供了一定的思路和研究基础。
作者贡献：穆琳负责实验设计、实施及文章撰写；曾今实参与实验设计与实施；黄元亮、林燕娴参与原材料的收集及制备，实验细胞的培养；滕利、蒋海越负责实验设计与评估以及文章审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院整形外科医院医学伦理委员会批准［（2021）注册第（2）号］。实验动物使用许可证号：SYXK（京）2020-0018。
由出生缺陷、感染、创伤、烧伤或癌症导致的耳廓畸形和缺损，对患者生理功能和心理状态有显著影响，耳廓重建是整形外科医生的难题之一。软骨细胞增殖率低、组织血管分布不良，成人耳廓软骨的再生和康复能力有限[1]。软骨组织工程技术为软骨缺损修复和重建提供了应用前景广阔的新选择。传统组织工程技术是将体外培养扩增的种子细胞种植到支架材料上，再进行体外培养或植入体内相应病损部位，对支架材料内部的细胞分布和密度难以精确控制。3D 生物打印技术能精确、快速实现支架复杂的宏观外形与内部微细结构的一体化构建，制备个性化修复体[2-3]，目前已成功打印出骨、软骨、肝单元、血管等组织器官[4-7]。
尽管 3D 生物打印在生物材料、生物分子及活细胞的精确空间分布和精细结构构建方面显示出巨大潜力，有望用于功能性耳廓支架的制备，但选择理想的生物材料和种子细胞组合用于软骨生物打印仍是一个难题。目前国内外软骨组织工程研究多采用软骨细胞和 BMSCs 作为种子细胞[8]，但二者均存在来源受限、供区副损伤等问题，因此在临床转化方面存在不足。而脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有易获得、创伤小、纯化率高、体外扩增速度快和免疫原性低等优点，且 3D 打印立体结构有利于 ADSCs 成软骨分化[9]。甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝胶因具备可打印、可调节的黏度、流变和凝胶化的物理特性以及适宜的生物特性，被广泛应用于各种生物医学领域[10-11]。本研究采用人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs）作为种子细胞，以 GelMA 水凝胶为载体，通过 3D 生物打印构建 hADSCs-GelMA 复合支架，并对其进行体内外成软骨实验研究，探讨该方法构建具有特定三维结构和生物学性能组织工程软骨的可行性，为应用 3D 生物打印技术构建组织工程软骨奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂、仪器
5 周龄健康雌性裸鼠 20 只，体质量 18～24 g，由中国医学科学院整形外科医院实验动物中心提供。脂肪组织由在中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院接受脂肪抽吸手术患者自愿捐献。
L-DMEM 培养基、FBS、青链霉素、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（GIBCO 公司，美国）；成软骨、成脂、成骨诱导培养基（Cyagen 公司，美国）；人 MSCs 流式检测试剂盒（BD 公司，美国）；0.22 μm 针头过滤器（Millipore 公司，美国）；GelMA 冻干粉（上普博源北京生物科技有限公司）；一步法逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；活/死细胞活力检测试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；番红 O 染液（北京索莱宝科技有限公司）；抗Ⅱ型胶原抗体、山羊抗小鼠 IgG H&L（HRP）（Abcam 公司，英国）。
CO2 培养箱（Thermo 公司，美国）；Bioplotter 3D 生物打印机（Envition tec 公司，德国）；倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；PCR 仪（Eppendorf 公司，德国）；LightCycler R 480Ⅱ实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系统（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c 微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；多功能酶标仪（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 hADSCs 分离、培养和鉴定
取脂肪组织加等体积 0.2%Ⅰ型胶原酶消化 60 min，离心后弃去含大量脂滴的上层及中间培养基层，加等体积 PBS 吹洗，100 μm 细胞滤网过滤；再次离心，弃上清，沉淀用适量完全培养基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基）重悬，接种于培养皿中，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，每 2～3 天更换培养基。待细胞生长至 80% 融合时，以 0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA 消化后按 1∶3 比例传代。取第 3 代细胞，倒置显微镜观察细胞形态。
细胞鉴定：① 流式细胞术鉴定：采用人 MSCs 流式检测试剂盒检测细胞表面标志物 CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45 表达。② 诱导分化鉴定：取第 3 代细胞接种至 6 孔板中，完全培养基培养 72 h 后分别更换为成脂和成骨诱导培养基培养 21 d，行油红 O 染色和茜素红染色观察；取第 3 代细胞置于 15 mL 离心管中，成软骨诱导培养基培养 21 d，取细胞球制作石蜡切片，阿利新蓝染色观察。
1.3 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架
采用完全培养基将 GelMA 配制成 10%（W/V）溶液，于 75℃ 水浴加热至充分溶解后，用 0.22 μm 针头过滤器过滤除菌，与第 3 代 hADSCs 和光引发剂（2.5%LAP）均匀混合，配置成细胞终浓度为 4×106个/mL 的生物墨水。将打印温度设置为 21℃，气压 0.4 bar，打印线宽 320 μm，线间距 1.2 mm，打印的方形支架大小约为 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。按照上述参数逐层打印，每层打印后用 405 nm 紫外光光照交联 3～5 s，使载细胞 GelMA 水凝胶充分固化，得到 hADSCs-GelMA 复合支架，将其转移至培养皿中，加入完全培养基，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。48 h 后更换为成软骨诱导培养基培养。
1.4 观测指标
1.4.1 大体及扫描电镜观察
大体观察 hADSCs-GelMA 复合支架外观；于完全培养基培养 1 d 及成软骨诱导培养 14 d 行扫描电镜观察。
1.4.2 复合支架中细胞存活率检测
分别于培养 1、4、7 d 取 hADSCs-GelMA 复合支架样本，采用活/死细胞活力检测试剂盒进行活/死细胞染色，共聚焦荧光显微镜观察，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。每个样本任意选取图片中 5 个不同区域进行平均量化分析，用 Image pro plus 6.0 软件对图像进行色彩分类计数，按以下公式计算细胞存活率：活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。同时采用共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描（垂直间隔 100 μm）多层拟合图像，观察样本整体细胞分布及细胞密度变化。
1.4.3 复合支架中细胞增殖检测
培养 1、4、7 d 采用 CCK-8 法检测细胞增殖情况，每个时间点检测 3 个样本，每个样本设 3 个复孔。以 10%CCK-8 溶液作为空白对照，酶标仪上测定 450 nm 波长处每孔吸光度（A）值，以所测 A 值减去空白对照A值作为样本 A 值。
1.4.4 qRT-PCR 检测成软骨基因表达
取成软骨诱导培养 14 d 的复合支架为实验组，以 L-DMEM 完全培养基培养 14 d 的复合支架为对照组，用 Trizol 法提取复合支架中的总 RNA，NanoDrop 检测 RNA 浓度及纯度，并用一步法逆转录试剂盒行逆转录反应（1 000 ng RNA 体系），得到 cDNA。SYBR GREEN 法进行 qRT-PCR 检测软骨基质基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、成软骨调节因子 SOX9、软骨特异性基因Ⅱ型胶原蛋白（collagen typeⅡA1，COLⅡA1）、软骨肥大标志基因Ⅹ型胶原蛋白（collagen typeⅩA1，COLⅩA1）mRNA 的相对表达量，以 GAPDH 作为内参基因，对样本进行标准化校正，用 2–ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量，结果以实验组相比对照组基因表达量倍数表示。基因引物序列见表1。
表1
各基因引物序列（5'3'）
Table1.
Primer sequences of genes (5'3')
1.4.5 裸鼠皮下植入实验
取 20 只裸鼠经腹膜内注射 1% 戊巴比妥溶液麻醉后，于背部中线作一长约 1.2 cm 纵切口，向两侧侧腹部皮下分离形成囊袋，一侧植入体外成软骨诱导培养 14 d 的 3D 打印 hADSCs-GelMA 复合支架（实验组），另一侧植入不含细胞的空白 GelMA 水凝胶支架（对照组），4-0 可吸收线缝合切口。4 周后颈椎脱臼法处死裸鼠后取材，大体观察两组支架形态、大小和色泽，是否降解，以及与周围组织反应情况；两组样本以 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚 3 μm，常规行番红 O、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，评估组织结构和软骨细胞外基质沉积。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Turkey 法；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hADSCs 形态学观察及鉴定
倒置显微镜观察示，第 3 代细胞呈长梭形贴壁生长（图1）。流式细胞术鉴定示细胞表面标志物 CD73、CD90、CD105 表达为阳性，CD34、CD11b、CD19、CD45 表达为阴性（图2）。成脂、成骨、成软骨诱导培养 21 d，油红 O 染色可见大量脂滴，茜素红染色可见红色钙结节，阿利新蓝染色可见细胞间质蓝染（图3）。经鉴定，培养细胞为 hADSCs。
图1
第 3 代 hADSCs 形态观察（倒置显微镜×100）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hADSCs (Inverted microscope×100)
图2
hADSCs 流式细胞术鉴定
a. CD73；b. CD90；c. CD105；d. CD34、CD11b、CD19、CD45
Figure2. Flow cytometric identification of hADSCsa. CD73; b. CD90; c. CD105; d. CD34, CD11b, CD19, CD45
图3
诱导培养 21 d hADSCs 三系分化鉴定（倒置显微镜×100）
a. 油红 O 染色；b. 茜素红染色；c. 阿利新蓝染色
Figure3. Adipogenic, osteogenic, and chondrogenic induction of hADSCs after 21 days of culture (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining; b. Alizarin red staining; c. Alcian blue staining
2.2 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架相关观测
2.2.1 大体及扫描电镜观察
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架大小约 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，呈网格状，色半透明，质软；光镜下观察网格形状规则，线宽及间隔均匀（图4a）。扫描电镜观察示，完全培养基培养 1 d，支架形态稳定，网格状结构清晰规则，支架表面较光滑，未见明显孔隙；成软骨诱导培养 14 d，支架网格状结构仍清晰可见，但线宽和网格孔隙均缩小，细胞外基质紧密且均匀包裹支架，镜下形成凹凸不平的表面（图4b、c）。
图4
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架大体及扫描电镜观察
a. 大体观察；b. 培养 1 d 扫描电镜观察（×300）；c. 成软骨诱导培养 14 d 扫描电镜观察（×300）
Figure4. Gross and scanning electron microscope observation of 3D bioprinted hADSCs-GelMA composite scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation after cultured for 1 day (×300); c. Scanning electron microscope observation after chondrogenic induction cultured for 14 days (×300)
2.2.2 复合支架中细胞存活率检测
培养 1、4、7 d 支架内细胞存活率分别为 83.20%±1.27%、89.13%±1.36%、79.80%±1.97%，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描多层拟合图像示，支架内细胞分布均匀，培养 7 d 与 1 d 时比较，支架内细胞数量增加、密度增高（图6）。
图5
培养各时间点 hADSCs-GelMA 复合支架活/死细胞染色（共聚焦荧光显微镜×100）
a. 1 d；b. 4 d；c. 7 d
Figure5. Live/dead staining of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for different time points (Confocal fluorescence microscope×100)a. One day; b. Four days; c. Seven days
图6
hADSCs-GelMA 复合支架培养 1、7 d 共聚焦荧光显微镜全景拼图扫描多层拟合图像（×100）
a. 1 d；b. 7 d
Figure6. Confocal fluorescence microscope panoramic mosaic scanning multilayer fitting image of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for 1 and 7 days (×100)a. One day; b. Seven days
2.2.3 复合支架中细胞增殖检测
CCK-8 法检测示，培养 1、4、7 d 样本 A 值分别为 0.155±0.002、0.325±0.026、0.410±0.004，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2.4 qRT-PCR 检测成软骨基因表达
培养 14 d qRT-PCR 检测示，实验组 ACAN、SOX9、COLⅡA1 和 COLⅩA1 mRNA 相对表达量分别为（6.976±2.739）×10-3、（2.641±1.250）×10-4、（1.712±0.491）×10-3、（2.337±0.013）×10-4，对照组分别为（6.203±1.395）×10-4、（1.821±0.085）×10-4、（1.034±0.056）×10-4、（3.570±0.141）×10-4，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组上述基因相对表达量分别为对照组的（11.5±0.1）、（1.5±0.1）、（17.0±1.0）和（0.7±0.0）倍。
2.2.5 裸鼠皮下植入实验
支架植入 4 周后大体观察示，两组裸鼠皮下植入区域仍可见方块状隆起。取材可见实验组支架较植入时略缩小变薄，呈白色，网格间隙中可见组织形成，韧性增强，剥离表面软组织可见有血管长入其中；对照组支架较植入时缩小变薄，呈半透明不规则凝胶状。见图7。
图7
支架植入裸鼠体内 4 周后大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Gross observation after 4 weeks of scaffold implanted into nude micea. Control group; b. Experimental group
番红 O 染色和阿利辛蓝染色示，实验组支架中分别可见红染和蓝染的软骨基质；对照组仅见材料染色，未见软骨细胞或基质沉积。免疫组织化学染色示，实验组支架中可见棕黄色Ⅱ型胶原特异性染色，且可见有软骨陷窝形成；对照组仅见材料非特异性染色。见图8。
图8
支架植入裸鼠后 4 周组织学和免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×200）
上、下分别为实验组和对照组 a. 番红 O 染色；b. 阿利新蓝染色；c. Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
Figure8. Histological and immunohistochemical observations after 4 weeks of scaffold implanted into nude mice (Inverted fluorescence microscope×200)The upper and lower for the experimental group and the control group, respectively a. Safranin O staining; b. Alcian blue staining; c. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining
3 讨论
耳廓再造是整形外科医生面临的最大挑战之一。目前主要方法是基于自体软骨或人工合成支架的耳廓再造术。然而，自体移植物存在吸收和供区并发症问题，人工合成的硅酮或聚乙烯移植物存在感染、挤压、生物相容性差和长期耐久性不确定等风险[12]。3D 生物打印是组织工程技术发展过程中兴起的一种新型增材制造技术，应用细胞、生物材料和生物分子在计算机辅助下进行分层打印，能够形成大小和形状精确、分辨率高、细胞分布均匀的具有生物学活性的三维组织结构，在软骨组织工程中具有巨大研究价值和应用前景。与其他组织工程研究的关键问题相似，选择理想的生物材料和种子细胞组合用于软骨生物打印是至关重要的一环。Kilian 等[13]应用人软骨细胞与一种基于海藻酸盐-甲基纤维素的生物墨水混合进行 3D 生物打印，证实在体外培养条件下有软骨细胞外基质产生，但细胞存活率仅 45%～75%。干细胞具有良好的增殖和分化潜能，为生物打印载细胞软骨支架提供了新的细胞类型，但打印过程中的细胞损伤给细胞存活、增殖和分化能力带来的影响亦不容忽视。
早期研究表明，光敏化水凝胶 GelMA 支持 BMSCs 的增殖和成软骨分化[14-15]，10%（W/V）GelMA 在打印后能维持良好的物理结构，并使 BMSCs 和人软骨细胞保持高细胞活性[16-17]。De Moor 等[18]采用高通量微孔培养系统培养人 BMSCs 球体，混合 GelMA 进行生物打印，结果表明 GelMA 具有良好的适打印性，且能维持人 BMSCs 球体的活性和软骨形成表型；该研究还表明，较低的水凝胶硬度可以进一步促进打印后的成软骨分化。因此，本研究选用 10%（W/V）GelMA 作为细胞载体构建 hADSCs-GelMA 复合支架，结果表明，3D 生物打印复合支架体外培养 14 d 三维结构稳定，未发生明显变形或塌陷；7 d 内细胞存活率保持在约 80%。本研究中，该复合支架细胞存活率先上升后下降，考虑与更换诱导分化培养基和静态培养方式有关，也可能是随体外培养时间延长，细胞外基质的沉积导致材料孔隙率下降，从而影响支架内部物质交换，进而导致长期培养后细胞死亡增加。
在种子细胞选择方面，本研究选用 hADSCs 进行成软骨研究。虽然目前国内外软骨组织工程研究多采用软骨细胞和 BMSCs 作为种子细胞，但二者在临床应用的转化均受到不同限制。健康人软骨细胞来源受限，往往需要获取大量自体软骨组织才能获得足够细胞进行组织构建，将会造成供区部位组织缺损和功能障碍，违背了研究的初衷。BMSCs 的优点在于可持续扩增，保持良好的多向分化潜能，但抽取骨髓既存在一定风险又给患者带来痛苦，且每个成人能获取的骨髓量有限（10～20 mL），因此限制了其应用。而 ADSCs 则具有以下优越性：① 脂肪组织容易获得，创伤小；② 相同培养条件下 ADSCs 增殖率更高；③ 在疾病微环境中，ADSCs 能够更好地维持细胞状态，发挥调节微环境的作用[19]；④ ADSCs 的人类白细胞抗原-ABC 表达较少，免疫排斥反应更低，更适用于同种异体移植[20]。在适打印性方面，本研究结果显示，hADSCs 在打印后细胞存活率与类似应用 BMSCs 的文献一致[16，21-22]，表明其细胞活力受打印过程剪切力、温度及光交联等因素影响不大，适用于 3D 生物打印。此外，本研究通过检测成软骨相关基因的表达，分析了 hADSCs 在打印后的分化能力。成软骨诱导培养 14 d 后，复合支架的软骨基质基因 ACAN、成软骨调节因子 SOX9 和软骨特异性基因 COLⅡA1 表达均显著上调，表明 hADSCs 在打印后仍具有良好的成软骨分化能力。而软骨肥大标志基因 ColⅩA1 表达下调，表明在成软骨诱导培养条件下，复合支架内的 hADSCs 分化形成的软骨细胞能够维持其表型，未出现早期肥大化的问题，可用于软骨组织工程支架的制备。
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 复合支架的体内成软骨能力也通过动物实验得到了证实。支架植入裸鼠体内 4 周后，实验组和对照组支架均较植入时缩小、变薄，虽然经组织学和免疫组织化学染色提示实验组有软骨细胞及基质形成，但软骨组织生成的速度较缓慢，与此同时水凝胶材料在动物体内被吸收并且发生降解，所以当材料的吸收和降解速度快于新生组织生成速度时，支架即可能出现体积缩小和形态变化的现象。因此，材料降解和吸收速度与组织形成速度不匹配是其作为组织工程材料需解决的一大难题。同时，本研究中制备的复合支架为胶冻状，虽三维结构稳定，但其力学强度远远未达到临床转化耳软骨的要求。有其他研究在生物墨水中加入磷酸三钙、生物玻璃、纳米纤维素和纳米复合材料等，以增强打印体的力学强度[23-26]。本研究可在此基础上进一步优化生物墨水材料及配比，以改进材料的生物力学性能，降低降解速率。我们也将继续评估支架内细胞的表型和迁移、蛋白水解活性以及材料吸收和降解速率，并与新的软骨组织形成相关联，以更好地理解 hADSCs 和交联 GelMA 水凝胶之间的相互作用，进一步解决组织形成和材料吸收降解速率相匹配的难题。
综上述，本研究通过 3D 生物打印技术制备了 hADSCs-GelMA 复合支架，其结构稳定，细胞存活率高，可于体内、外成软骨分化形成软骨组织，为应用 3D 生物打印技术构建组织工程软骨提供了一定的思路和研究基础。
作者贡献：穆琳负责实验设计、实施及文章撰写；曾今实参与实验设计与实施；黄元亮、林燕娴参与原材料的收集及制备，实验细胞的培养；滕利、蒋海越负责实验设计与评估以及文章审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中国医学科学院整形外科医院医学伦理委员会批准［（2021）注册第（2）号］。实验动物使用许可证号：SYXK（京）2020-0018。
