引用本文： 刘欢, 丁其瑞, 马成, 秦豪男, 魏易凡, 任永信. 两种小鼠膝关节骨软骨损伤模型制备方法比较研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(7): 862-867. doi: 10.7507/1002-1892.202101098 复制
骨软骨损伤是一种临床常见关节疾病，关节软骨由于缺乏血管，损伤后软骨祖细胞无法及时迁移至损伤部位[1]，自身愈合能力较差，最终可能发展为骨关节炎。因此，此类损伤修复是临床一个重大挑战，其修复方法及作用机制也成为重要研究课题，而动物模型是重要研究对象。
目前，采用犬、羊、猪和马等大型动物制备的关节骨软骨缺损模型已广泛用于软骨再生研究，此类模型具有膝关节面较大以及关节结构、组成与特性等与人类相似的优势，而且造模相对容易。但是，在大型动物中难以进行基因修饰，影响了对软骨修复机制的深入研究[2-3]。而小鼠可以在其体内进行基因修饰，目前已广泛应用于各种分子机制研究中。
近年来，有学者采用小鼠制备模型行膝关节骨软骨损伤研究[4-5]，主要采用注射器针头在股骨髁间沟纵形划伤关节软骨制备模型。该操作较简单，但是注射器尖端硬度相对较低，接触软骨下骨后容易发生变形，且尖端为一坡面，采用不同方向造成的骨软骨损伤其宽度也不同，导致造模结果不一致、可重复性不高。为此，我们将上述方法中使用的注射器针头改为电钻笔配合钨钢麻花钻头。钨钢麻花钻头硬度高，钻头不易变形，并且钻头在高速旋转时为一个圆柱体，制备的骨软骨损伤宽度一致，最大程度降低了器械本身对造模结果造成的误差。本研究将该方法与传统注射器针头方法进行比较，进一步探讨钨钢麻花钻头制备小鼠骨软骨损伤模型的效果，以期为骨软骨损伤相关研究提供一种较理想的动物模型制备方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄雄性 C57BL/6 小鼠 75 只，体质量 20～22 g，平均 21 g，饲养于南京医科大学实验动物中心。
苏木素染液、伊红染液（南京建成生物工程研究所）；甲苯胺蓝染液（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅱ型胶原抗体（Abcam 公司，英国）。电钻笔（安徽阿斯珈工具有限公司）；钨钢麻花钻头（Kuangxia 公司，日本）；1 mL 无菌注射器（上海康德莱医疗器械股份有限公司）；NSZ-608T 手术体视显微镜（河南新星光学有限公司）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）；切片机、摊片机（Leica 公司，德国）；光学显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 实验分组及方法
将 75 只小鼠随机均分为 3 组（n=25），A 组采用 26G 注射器针头进行造模；B 组采用钨钢麻花钻头进行造模；C 组为假手术组。
3 组小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）麻醉后，右后肢脱毛、消毒、铺单。在膝关节内侧切开皮肤，暴露关节囊，沿髌骨内侧缘切开关节囊，并从股四头肌内侧头和长头间隙钝性分离，将髌骨向外侧推移并完全屈曲膝关节，以暴露股骨滑车沟。
A 组：使用自制尖端限深的 26G 注射器针头，沿滑车沟稍用力划破关节软骨（以有阻力感为判定标准）。B 组：采用电钻笔和尖端限深、直径为 0.2 mm 的钨钢麻花钻头，冷生理盐水冲洗下以 7 000 r/min 速度沿滑车沟划破软骨全层，损伤部位有血液渗出提示损伤达软骨下骨。手术体视显微镜下去除残留软骨碎片，将脱位的髌骨复位，分别缝合股四头肌内侧头、关节囊和皮肤。C 组：仅切开皮肤及关节囊，关节软骨不作处理。见图 1、2。
图1
动物模型制备工具
a. 注射器针头；b. 钨钢麻花钻头和电钻笔
Figure1. Equipment for animal model preparationa. Needle; b. Tungsten drill and electronic drill pen
图2
造模后关节面大体形态
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure2. Morphology of the joint surface after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察小鼠术后存活、切口愈合以及膝关节活动度恢复情况。
1.3.2 组织学观察
造模后 1 d 及 1、2、4、8 周，每组取 5 只小鼠，以颈椎脱位法处死后分离右后肢，剥离膝关节附着肌肉及其他软组织，如标本存在明显感染或者髌骨脱位排除研究。将纳入标本置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，于 EDTA 螯合剂中脱钙 21～28 d，梯度脱水、浸蜡、包埋，切片机制作 5 μm 厚切片。
组织切片经脱蜡、梯度乙醇水化后，取造模后 1 d 及 1、2、4、8 周切片常规 HE 染色，光镜下观察骨软骨损伤愈合情况；取 A、B 组造模后 1 d 时切片，采用 Image J 软件测量骨软骨损伤部位形态学参数，包括深度、宽度、横截面积，并计算损伤部位深度占关节软骨厚度的百分比（深度/厚度）。其中，宽度为骨软骨损伤部位两侧外缘距离，深度为损伤最低点至软骨面距离。
取造模后 8 周切片，分别行甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光镜下分别观察修复区域组织甲苯胺蓝着色及Ⅱ型胶原表达情况。基于切片 HE 染色、甲苯胺蓝染色，参照国际软骨研究协会（ICRS）评分标准[6]，对 A、B 组骨软骨损伤愈合情况进行评分。
1.4 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
所有小鼠均存活至实验完成。术后一般情况良好，自由进食、饮水；切口愈合良好，无红肿、感染征象；膝关节活动度可，无明显受限。所有标本均纳入研究。
2.2 组织学观察
2.2.1 HE 染色观察
C 组为正常软骨形态。造模后 1 d，A 组损伤仅突破软骨层达软骨下骨，未进入骨髓腔；B 组损伤已完全突破软骨和软骨下骨，到达骨髓腔。A 组损伤部位深度、宽度、横截面积和深度/厚度均小于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。造模后 1、2、4、8 周，A 组损伤部位均未见明显组织填充，而 B 组损伤部位已逐渐被组织填充。见图 3。
表1
A、B 组造模 1 d 骨软骨损伤部位形态学参数比较（n=5，
）
Table1.
Comparison of morphological parameters of osteochondral injury at 1 day after modeling between group A and group B (n=5, 
)
图3
造模后各组 HE 染色观察（×100）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 造模后 1 d；b. 造模后 1 周；c. 造模后 2 周；d. 造模后4 周；e. 造模后 8 周
Figure3. HE staining in each group after modeling (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. One day after modeling; b. One week after modeling; c. Two weeks after modeling; d. Four weeks after modeling; e. Eight weeks after modeling
2.2.2 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察
造模后 8 周，A 组损伤部位未见甲苯胺蓝着色以及Ⅱ型胶原表达；而 B 组损伤部位填充组织可见甲苯胺蓝着色及Ⅱ型胶原表达。见图 4、5。A 组 ICRS 评分为（8.2±1.3）分，低于 B 组（13.6±0.9）分，差异有统计学意义（t=−7.637，P=0.000）。
图4
造模后 8 周各组甲苯胺蓝染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure4. Toluidine blue staining in each group at 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图5
造模后 8 周各组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Immunohistochemical staining for collagen typeⅡat 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 讨论
体内动物模型研究在从体外实验到转化至临床治疗过程中起着至关重要作用。由于每种动物模型都有优点和缺点，所以在设计动物实验时需要对每种可用动物模型进行综合分析，包括成本效益、解剖结构、关节生物力学以及术后方案。理想的动物模型应包括以下特征：① 造模较简单，稳定性好，变异小，在适当时间内可重现；② 动物易于饲养和处理，价格合理，并且可以评估不同遗传学、生物化学和影像学标志物；③ 基于动物模型的研究结果可以特异地转化为人类医学的病理和治疗[7]。但是，目前尚不存在绝对理想动物模型。
在软骨修复和再生领域，对于体内机制研究、可行性研究和新疗法的初步探索，鼠类动物模型是最有效模型[8]。鼠类包括大鼠和小鼠，易于饲养和处理，并且价格低廉，常用于软骨损伤修复的研究。相对于小鼠，大鼠关节更大，可以提高研究可行性和重复性，且与临床相关性更大[9]，在既往研究中应用相对较多[10-11]。无胸腺的大鼠品系还可用于包括生物材料在内的异种移植物修复骨软骨损伤研究[12]。但是目前在大鼠体内尚无法进行基因水平修饰。小鼠在国内外已有严格质量控制标准，近年来一直作为生物医学动物模型的主要动物品种，并且基因组测序表明小鼠 85% 基因序列与人类一致[13]。总的来说，鼠类动物可以获得免疫豁免和转基因或基因敲除动物模型，有利于骨软骨缺损研究，而且药物干预成本较低。
软骨修复定义为通过软骨细胞增殖并合成新的细胞外基质来修复受损软骨的过程。最近研究表明，软骨下骨髓腔的 MSCs 是修复损伤关节软骨的重要细胞来源。MSCs 迁移至损伤部位，在相关因子作用下分化为软骨细胞，并分泌特定的细胞外基质，包括Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖，最终修复损伤软骨[14-15]。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖是软骨细胞标志物，其表达水平与软骨细胞数量和活力成正比[16]。软骨修复在很大程度上取决于损伤深度和宽度。目前多数观点认为，关节软骨损伤只有当突破软骨层和软骨下骨到达骨髓腔时，才有可能自发性愈合[17-18]。本研究 B 组采用钨钢麻花钻头穿透软骨下骨到达骨髓腔，通过有血液从损伤部位渗出予以确认，组织学染色进一步确认软骨下骨损伤，骨髓腔与关节腔相通。采用注射器针头突破关节软骨全层触及软骨下骨时，其尖端很容易变钝，难以保证针头突破软骨下骨，A 组造模过程中均未见到明显血液渗出，组织学染色显示软骨下骨仅有表层被损伤，软骨下骨全层没有被突破。美国材料试验学会（ASTM）建议软骨损伤大小不应超过关节表面的 15%～20%，或髁间宽度的 50%～60%[19]。我们使用的钨钢麻花钻头直径为 0.2 mm，约为髁间宽度的 25%（髁间宽度约为 0.8 mm），而注射器针头损伤宽度约为髁间宽度的 15%。虽然，与注射器针头相比，钨钢麻花钻头对软骨及软骨下骨造成的损伤宽度和横截面积均更大，但是损伤部位可以更快地被修复组织填充，并且修复组织甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性，表明其为再生的软骨组织。而注射器针头造成的损伤虽然较小，但是由于未突破软骨下骨到达骨髓腔，其愈合较差。因此，在软骨损伤宽度较小的情况下，损伤深度对是否自发愈合至关重要。另外，本研究采用的钨钢麻花钻头还有其他直径（0.1～1.0 mm），未来我们将探究不同损伤宽度对骨软骨损伤愈合的影响，也为组织工程修复骨软骨损伤等相关研究提供合适的动物模型和研究基础。
采用钨钢麻花钻头制备骨软骨损伤模型时，需注意以下事项：第一，小鼠膝关节需充分屈曲，暴露股骨远端，并牢固固定；第二，钻头使用时处于高速运转状态，操作者应将其牢固握住，且钻头应垂直于髁间软骨最低点匀速前进，切忌左右晃动；第三，高速运转钻头与软骨下骨摩擦会产生大量热量，容易对周围正常软骨造成额外热力损伤，操作时予以冷生理盐水持续冲洗降温；第四，钻头损伤软骨后不能完全将碎片带出，操作者需在体视显微镜下将残留的软骨碎片完全清除，排除损伤部位残留软骨组织对结果的影响；第五，需明确损伤部位血液渗出，提示钻头突破软骨下骨进入骨髓腔；第六，采用钻头造模难度大于注射器针头，需要操作者多练习。
综上述，我们建立的小鼠膝关节骨软骨损伤模型制备方法可行，采用该方法得到控制良好、一致且可重复的关节骨软骨损伤结果。相对于注射器针头，钨钢麻花钻头可轻松突破软骨下骨，还可以更改钻头直径模拟不同大小骨软骨损伤。
作者贡献：刘欢、任永信负责实验设计；刘欢、丁其瑞负责实验操作、论文撰写；马成、秦豪男、魏易凡负责数据整理及统计分析；任永信负责论文审核。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究经南京医科大学实验动物伦理委员会批准（IACUC-1903009）。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2016-0015。
骨软骨损伤是一种临床常见关节疾病，关节软骨由于缺乏血管，损伤后软骨祖细胞无法及时迁移至损伤部位[1]，自身愈合能力较差，最终可能发展为骨关节炎。因此，此类损伤修复是临床一个重大挑战，其修复方法及作用机制也成为重要研究课题，而动物模型是重要研究对象。
目前，采用犬、羊、猪和马等大型动物制备的关节骨软骨缺损模型已广泛用于软骨再生研究，此类模型具有膝关节面较大以及关节结构、组成与特性等与人类相似的优势，而且造模相对容易。但是，在大型动物中难以进行基因修饰，影响了对软骨修复机制的深入研究[2-3]。而小鼠可以在其体内进行基因修饰，目前已广泛应用于各种分子机制研究中。
近年来，有学者采用小鼠制备模型行膝关节骨软骨损伤研究[4-5]，主要采用注射器针头在股骨髁间沟纵形划伤关节软骨制备模型。该操作较简单，但是注射器尖端硬度相对较低，接触软骨下骨后容易发生变形，且尖端为一坡面，采用不同方向造成的骨软骨损伤其宽度也不同，导致造模结果不一致、可重复性不高。为此，我们将上述方法中使用的注射器针头改为电钻笔配合钨钢麻花钻头。钨钢麻花钻头硬度高，钻头不易变形，并且钻头在高速旋转时为一个圆柱体，制备的骨软骨损伤宽度一致，最大程度降低了器械本身对造模结果造成的误差。本研究将该方法与传统注射器针头方法进行比较，进一步探讨钨钢麻花钻头制备小鼠骨软骨损伤模型的效果，以期为骨软骨损伤相关研究提供一种较理想的动物模型制备方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄雄性 C57BL/6 小鼠 75 只，体质量 20～22 g，平均 21 g，饲养于南京医科大学实验动物中心。
苏木素染液、伊红染液（南京建成生物工程研究所）；甲苯胺蓝染液（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅱ型胶原抗体（Abcam 公司，英国）。电钻笔（安徽阿斯珈工具有限公司）；钨钢麻花钻头（Kuangxia 公司，日本）；1 mL 无菌注射器（上海康德莱医疗器械股份有限公司）；NSZ-608T 手术体视显微镜（河南新星光学有限公司）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）；切片机、摊片机（Leica 公司，德国）；光学显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 实验分组及方法
将 75 只小鼠随机均分为 3 组（n=25），A 组采用 26G 注射器针头进行造模；B 组采用钨钢麻花钻头进行造模；C 组为假手术组。
3 组小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）麻醉后，右后肢脱毛、消毒、铺单。在膝关节内侧切开皮肤，暴露关节囊，沿髌骨内侧缘切开关节囊，并从股四头肌内侧头和长头间隙钝性分离，将髌骨向外侧推移并完全屈曲膝关节，以暴露股骨滑车沟。
A 组：使用自制尖端限深的 26G 注射器针头，沿滑车沟稍用力划破关节软骨（以有阻力感为判定标准）。B 组：采用电钻笔和尖端限深、直径为 0.2 mm 的钨钢麻花钻头，冷生理盐水冲洗下以 7 000 r/min 速度沿滑车沟划破软骨全层，损伤部位有血液渗出提示损伤达软骨下骨。手术体视显微镜下去除残留软骨碎片，将脱位的髌骨复位，分别缝合股四头肌内侧头、关节囊和皮肤。C 组：仅切开皮肤及关节囊，关节软骨不作处理。见图 1、2。
图1
动物模型制备工具
a. 注射器针头；b. 钨钢麻花钻头和电钻笔
Figure1. Equipment for animal model preparationa. Needle; b. Tungsten drill and electronic drill pen
图2
造模后关节面大体形态
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure2. Morphology of the joint surface after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察小鼠术后存活、切口愈合以及膝关节活动度恢复情况。
1.3.2 组织学观察
造模后 1 d 及 1、2、4、8 周，每组取 5 只小鼠，以颈椎脱位法处死后分离右后肢，剥离膝关节附着肌肉及其他软组织，如标本存在明显感染或者髌骨脱位排除研究。将纳入标本置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，于 EDTA 螯合剂中脱钙 21～28 d，梯度脱水、浸蜡、包埋，切片机制作 5 μm 厚切片。
组织切片经脱蜡、梯度乙醇水化后，取造模后 1 d 及 1、2、4、8 周切片常规 HE 染色，光镜下观察骨软骨损伤愈合情况；取 A、B 组造模后 1 d 时切片，采用 Image J 软件测量骨软骨损伤部位形态学参数，包括深度、宽度、横截面积，并计算损伤部位深度占关节软骨厚度的百分比（深度/厚度）。其中，宽度为骨软骨损伤部位两侧外缘距离，深度为损伤最低点至软骨面距离。
取造模后 8 周切片，分别行甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光镜下分别观察修复区域组织甲苯胺蓝着色及Ⅱ型胶原表达情况。基于切片 HE 染色、甲苯胺蓝染色，参照国际软骨研究协会（ICRS）评分标准[6]，对 A、B 组骨软骨损伤愈合情况进行评分。
1.4 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
所有小鼠均存活至实验完成。术后一般情况良好，自由进食、饮水；切口愈合良好，无红肿、感染征象；膝关节活动度可，无明显受限。所有标本均纳入研究。
2.2 组织学观察
2.2.1 HE 染色观察
C 组为正常软骨形态。造模后 1 d，A 组损伤仅突破软骨层达软骨下骨，未进入骨髓腔；B 组损伤已完全突破软骨和软骨下骨，到达骨髓腔。A 组损伤部位深度、宽度、横截面积和深度/厚度均小于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。造模后 1、2、4、8 周，A 组损伤部位均未见明显组织填充，而 B 组损伤部位已逐渐被组织填充。见图 3。
表1
A、B 组造模 1 d 骨软骨损伤部位形态学参数比较（n=5，）
Table1.
Comparison of morphological parameters of osteochondral injury at 1 day after modeling between group A and group B (n=5, )
图3
造模后各组 HE 染色观察（×100）
从左至右分别为 A、B、C 组 a. 造模后 1 d；b. 造模后 1 周；c. 造模后 2 周；d. 造模后4 周；e. 造模后 8 周
Figure3. HE staining in each group after modeling (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. One day after modeling; b. One week after modeling; c. Two weeks after modeling; d. Four weeks after modeling; e. Eight weeks after modeling
2.2.2 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察
造模后 8 周，A 组损伤部位未见甲苯胺蓝着色以及Ⅱ型胶原表达；而 B 组损伤部位填充组织可见甲苯胺蓝着色及Ⅱ型胶原表达。见图 4、5。A 组 ICRS 评分为（8.2±1.3）分，低于 B 组（13.6±0.9）分，差异有统计学意义（t=−7.637，P=0.000）。
图4
造模后 8 周各组甲苯胺蓝染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure4. Toluidine blue staining in each group at 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图5
造模后 8 周各组Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Immunohistochemical staining for collagen typeⅡat 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 讨论
体内动物模型研究在从体外实验到转化至临床治疗过程中起着至关重要作用。由于每种动物模型都有优点和缺点，所以在设计动物实验时需要对每种可用动物模型进行综合分析，包括成本效益、解剖结构、关节生物力学以及术后方案。理想的动物模型应包括以下特征：① 造模较简单，稳定性好，变异小，在适当时间内可重现；② 动物易于饲养和处理，价格合理，并且可以评估不同遗传学、生物化学和影像学标志物；③ 基于动物模型的研究结果可以特异地转化为人类医学的病理和治疗[7]。但是，目前尚不存在绝对理想动物模型。
在软骨修复和再生领域，对于体内机制研究、可行性研究和新疗法的初步探索，鼠类动物模型是最有效模型[8]。鼠类包括大鼠和小鼠，易于饲养和处理，并且价格低廉，常用于软骨损伤修复的研究。相对于小鼠，大鼠关节更大，可以提高研究可行性和重复性，且与临床相关性更大[9]，在既往研究中应用相对较多[10-11]。无胸腺的大鼠品系还可用于包括生物材料在内的异种移植物修复骨软骨损伤研究[12]。但是目前在大鼠体内尚无法进行基因水平修饰。小鼠在国内外已有严格质量控制标准，近年来一直作为生物医学动物模型的主要动物品种，并且基因组测序表明小鼠 85% 基因序列与人类一致[13]。总的来说，鼠类动物可以获得免疫豁免和转基因或基因敲除动物模型，有利于骨软骨缺损研究，而且药物干预成本较低。
软骨修复定义为通过软骨细胞增殖并合成新的细胞外基质来修复受损软骨的过程。最近研究表明，软骨下骨髓腔的 MSCs 是修复损伤关节软骨的重要细胞来源。MSCs 迁移至损伤部位，在相关因子作用下分化为软骨细胞，并分泌特定的细胞外基质，包括Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖，最终修复损伤软骨[14-15]。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖是软骨细胞标志物，其表达水平与软骨细胞数量和活力成正比[16]。软骨修复在很大程度上取决于损伤深度和宽度。目前多数观点认为，关节软骨损伤只有当突破软骨层和软骨下骨到达骨髓腔时，才有可能自发性愈合[17-18]。本研究 B 组采用钨钢麻花钻头穿透软骨下骨到达骨髓腔，通过有血液从损伤部位渗出予以确认，组织学染色进一步确认软骨下骨损伤，骨髓腔与关节腔相通。采用注射器针头突破关节软骨全层触及软骨下骨时，其尖端很容易变钝，难以保证针头突破软骨下骨，A 组造模过程中均未见到明显血液渗出，组织学染色显示软骨下骨仅有表层被损伤，软骨下骨全层没有被突破。美国材料试验学会（ASTM）建议软骨损伤大小不应超过关节表面的 15%～20%，或髁间宽度的 50%～60%[19]。我们使用的钨钢麻花钻头直径为 0.2 mm，约为髁间宽度的 25%（髁间宽度约为 0.8 mm），而注射器针头损伤宽度约为髁间宽度的 15%。虽然，与注射器针头相比，钨钢麻花钻头对软骨及软骨下骨造成的损伤宽度和横截面积均更大，但是损伤部位可以更快地被修复组织填充，并且修复组织甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性，表明其为再生的软骨组织。而注射器针头造成的损伤虽然较小，但是由于未突破软骨下骨到达骨髓腔，其愈合较差。因此，在软骨损伤宽度较小的情况下，损伤深度对是否自发愈合至关重要。另外，本研究采用的钨钢麻花钻头还有其他直径（0.1～1.0 mm），未来我们将探究不同损伤宽度对骨软骨损伤愈合的影响，也为组织工程修复骨软骨损伤等相关研究提供合适的动物模型和研究基础。
采用钨钢麻花钻头制备骨软骨损伤模型时，需注意以下事项：第一，小鼠膝关节需充分屈曲，暴露股骨远端，并牢固固定；第二，钻头使用时处于高速运转状态，操作者应将其牢固握住，且钻头应垂直于髁间软骨最低点匀速前进，切忌左右晃动；第三，高速运转钻头与软骨下骨摩擦会产生大量热量，容易对周围正常软骨造成额外热力损伤，操作时予以冷生理盐水持续冲洗降温；第四，钻头损伤软骨后不能完全将碎片带出，操作者需在体视显微镜下将残留的软骨碎片完全清除，排除损伤部位残留软骨组织对结果的影响；第五，需明确损伤部位血液渗出，提示钻头突破软骨下骨进入骨髓腔；第六，采用钻头造模难度大于注射器针头，需要操作者多练习。
综上述，我们建立的小鼠膝关节骨软骨损伤模型制备方法可行，采用该方法得到控制良好、一致且可重复的关节骨软骨损伤结果。相对于注射器针头，钨钢麻花钻头可轻松突破软骨下骨，还可以更改钻头直径模拟不同大小骨软骨损伤。
作者贡献：刘欢、任永信负责实验设计；刘欢、丁其瑞负责实验操作、论文撰写；马成、秦豪男、魏易凡负责数据整理及统计分析；任永信负责论文审核。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究经南京医科大学实验动物伦理委员会批准（IACUC-1903009）。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2016-0015。
