引用本文： 曾秀安, 厉孟, 杨其兵, 汪其苑, 陈永新, 罗想利, 李继东, 蓝旭. 二甲基乙二酰基甘氨酸对跨区穿支皮瓣ChokeⅡ区血管生成的影响机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(2): 224-230. doi: 10.7507/1002-1892.202107103 复制
自Koshima等[1]提出“穿支皮瓣”概念以来，跨区穿支皮瓣因可切取面积大、修复效果好、供区损伤小等特点，常被用于皮肤软组织缺损修复。Cormack等[2]将皮肤血管供区分为解剖区、血流动力学区和潜在区。跨区穿支皮瓣在解剖区和血流动力学区成活相对稳定，在潜在区易发生缺血坏死，限制了在临床上广泛应用[3-4]。因此，如何提高跨区穿支皮瓣移植后的成活率仍是需解决的问题。
相邻血管体之间相互吻合的血管称为“Choke血管”，该血管对跨区穿支皮瓣的成活极其重要[5]。Xu等[6]在多血管体穿支皮瓣研究中发现存在ChokeⅠ区和Ⅱ区，前者位于解剖区与血流动力学区之间，后者位于血流动力学区与潜在区之间；ChokeⅡ区血管生成减少和血液灌注不足是导致跨区穿支皮瓣坏死的主要原因之一。因此，促进Choke血管生成、改善血液供应等，对跨区穿支皮瓣成活至关重要[7]。
有学者提出通过手术延迟、药物干预等方式来促进跨区穿支皮瓣血管生成、改善血供[8-9]。然而，手术延迟不仅增加了手术次数和感染风险，还给患者带来较大创伤。药物干预具有损伤小、相对安全等优点，逐渐成为研究热点，并取得一定成果，但药物作用机制及最佳给药途径需进一步研究[10-11]。二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）是一种非特异性脯氨酸羟化酶抑制剂，可有效抑制脯氨酸羟化酶活性，使缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）积聚，从而激活下游VEGF、红细胞生成素等基因的表达，继而促进血管生成[12-13]。研究发现DMOG可促进皮瓣血管生成、改善血供，提高皮瓣成活率[12, 14]。但目前有关DMOG对跨区穿支皮瓣ChokeⅡ区血管生成影响的相关研究较少。本研究以大鼠为模型，观察腹腔注射DMOG对跨区穿支皮瓣ChokeⅡ区血管生成和皮瓣潜在区成活的影响，探索其作用机制，为临床采用跨区穿支皮瓣修复大面积皮肤软组织缺损、提高皮瓣成活率提供治疗思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年雄性SD大鼠126只，体质量240～300 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。DMOG、HIF-1α抑制剂YC-1（Selleck公司，美国）；多克隆抗体HIF-1α、VEGF（Abcam公司，美国）；DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组织化学染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；300 Bloom明胶、水合氯醛（天津市光复精细化工研究所）；PBS缓冲液（兰州总医院骨科研究所）；红色氧化铅（天津市致远化学试剂有限公司）；鼠HIF-1α ELISA试剂盒、鼠VEGF ELISA试剂盒（TSZ科技有限公司，美国）；聚偏氟乙烯膜、BCA蛋白定量试剂盒、高效RIPA组织细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、脱脂奶粉、滤纸、脱敏发光液（北京索来宝科技有限公司）。
荧光显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（伯腾仪器有限公司，美国）；H1650-W台式微量高速离心机、台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 实验分组及方法
采用随机数字表法将126只大鼠分为DMOG组、YC-1组、空白对照组，每组42只。3组大鼠参照文献 ［15］方法制备跨区穿支皮瓣模型。具体步骤：大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6 mg/kg）麻醉后，俯卧于操作台并四肢固定，背部脱毛处理，记号笔标记跨区穿支皮瓣区域12 cm×3 cm。聚维酮碘溶液消毒，铺无菌单，切开皮肤至深筋膜浅层，沿筋膜层向对侧缓慢分离，逐层掀起分离皮瓣，充分暴露髂腰动脉、肋间后动脉、胸背动脉。结扎并切断肋间后动脉和胸背动脉，保留髂腰动脉为皮瓣穿支血管，获得以髂腰动脉为蒂的三血管体穿支皮瓣（图1）。创面彻底结扎止血后，以4-0缝线原位间断缝合皮缘。
图1
跨区穿支皮瓣模型制备示意图
a. 皮瓣设计；b. 岛状皮瓣；c. 切取的皮瓣；d. 皮瓣原位缝合
Figure1. Schematic diagram of flap model preparationa. Flap design; b. Island flap; c. The flap was dissected; d. The flap was sutured in situ
术前1 d、2 h以及术后1、2、3 d，DMOG组腹腔注射2 mL含DMOG（40 mg/kg）的生理盐水[16]，YC-1组注射2 mL含YC-1（10 mg/kg）的生理盐水[17-18]，空白对照组给予等量生理盐水。术后大鼠均单独饲养并自由觅食、饮水。于术后3、5、7 d 取大鼠同上法麻醉后行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后观察各组大鼠皮瓣成活情况，包括皮瓣颜色、质地及是否发生坏死。术后7 d各组取6只大鼠，切取整块皮瓣组织并掀起展开，通过皮瓣透光试验观察血管生成情况；使用Image J软件测量皮瓣成活面积，计算皮瓣成活率，公式为：成活面积/总面积×100%。
1.3.2 血管造影观察
术后7 d各组取6只大鼠，采用血管造影观察皮瓣ChokeⅡ区血管生成情况。大鼠仰卧位固定，分离一侧颈总动脉以及对侧颈内静脉并用慕丝线标记。将硅胶管留置针置入颈总动脉，排尽大鼠体内血液后注入生理盐水肝素，直至颈内静脉流出清亮生理盐水。然后，将大鼠置于40℃水浴锅中，将明胶-氧化铅混合物（50 mL/kg）注入颈总动脉，直至四肢末端出现点状、斑块状颜色时停止灌注。将大鼠置于4℃冰箱，隔日剥离皮瓣，平铺拍摄X线片，观察血管生成情况。
1.3.3 组织学观察
术后7 d各组取6只大鼠，取ChokeⅡ区皮瓣组织，面积2.0 cm×0.6 cm，置于甲醛固定，常规脱水包埋切片，片厚5 μm。每只大鼠取1张切片行HE染色，在低倍镜下找到血管密集区，再在高倍镜下选取5个视野，使用Image J软件计数血管。
1.3.4 免疫组织化学染色观测
取1.3.3中制作的切片（每只大鼠取1张），置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，用中火微波处理10 min后取出自然冷却；蒸馏水清洗3次，PBS缓冲液清洗，加入0.01% Triton X-100，37℃孵育10 min；加入3%H2O2，37℃孵育10 min；加入5%牛血清白蛋白，37℃孵育20 min；加入HIF-1α、VEGF一抗（兔多克隆抗体稀释比为1∶100），4℃冰箱中过夜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30 min。取出湿盒加入SABC，37℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，甲醛固定，中性树脂封片。在40×10倍光镜下观察HIF-1α、VEGF分布，阳性染色呈棕黄色或黄褐色。
1.3.5 ELISA检测
术后3、5、7 d，各组分别取6只大鼠ChokeⅡ区皮瓣组织250 mg，加入PBS缓冲液，冰浴下研磨，以离心半径10 cm，12 000 r/min离心30 min；取上清，参照BCA蛋白定量试剂盒检测HIF-1α、VEGF蛋白总浓度。
1.3.6 Western blot检测
术后7 d各组取6只大鼠ChokeⅡ区皮瓣组织蛋白，调节蛋白浓度，凝胶电泳、湿法转膜，在50 g/L脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h，加入小鼠抗大鼠VEGF、HIF-1α一抗（稀释比1∶300），4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗（稀释比1∶4 000），室温孵育2 h。化学发光、显影，图像分析系统行灰度扫描分析，以与内参β-actin灰度值比值表示VEGF、HIF-1α蛋白相对表达量。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS23.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体及血管造影观察
术后7 d，DMOG组切口愈合良好，皮瓣远端未见明显坏死，皮瓣质地较软、未出现发黑结痂；空白对照组和YC-1组切口愈合欠佳，皮瓣发生坏死且主要位于远端，皮瓣质地较硬，可见黑色痂皮。见图2。DMOG组大鼠皮瓣成活率为90.28%±1.37%，高于YC-1组84.28%±1.45%及空白对照组85.83%±1.60%，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。皮瓣透光试验及血管造影观察显示DMOG组皮瓣ChokeⅡ区血管生成较多且结构清晰、完整；YC-1组及空白对照组Choke Ⅱ区血管较少，血管结构紊乱。见图3、4。
图2
术后7 d各组皮瓣大体观察
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure2. Gross observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
图3
术后7 d透光试验观察各组皮瓣血管生成情况
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure3. Flap angiogenesis observed by light transmission test at7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
图4
术后7 d各组皮瓣血管造影观察
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure4. Angiography observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
2.2 组织学及免疫组织化学染色观察
术后7 d，与YC-1组和空白对照组相比，DMOG组血管明显增多且管腔形态结构较完整（图5）。DMOG组、YC-1组、空白对照组血管数量分别为（25.56±1.29）、（7.38±0.54）、（14.48±0.91）条/视野。DMOG组高于其余两组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图5
术后7 d 各组皮瓣HE染色观察（×200）
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure5. HE staining of flaps in each group at 7 days after operation (×200)a. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
术后7 d，DMOG组皮瓣Choke Ⅱ区HIF-1α、VEGF表达显著，染色明显强于YC-1组、空白对照组（图6）。
图6
术后7 d各组免疫组织化学染色观察（×400）
从左至右分别为DMOG组、 YC-1组、空白对照组 a. HIF-1α；b. VEGF
Figure6. Immunohistochemical staining of flaps in each group at 7 days after operation (×400)From left to right for DMOG group, YC-1 group, and Control group a. HIF-1α; b. VEGF
2.3 ELISA检测
术后3、5、7 d DMOG组皮瓣ChokeⅡ区HIF-1α、VEGF表达量均高于YC-1组、空白对照组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图7
术后各时间点各组ELISA法检测HIF-1α及VEGF蛋白表达
a. HIF-1α；b. VEGF
Figure7. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by ELISA at each time point after operationa. HIF-1α; b. VEGF
2.4 Western blot检测
术后7 d ，DMOG组HIF-1α、VEGF蛋白相对表达量均高于空白对照组和YC-1组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图8。
图8
术后7 d Western blot检测HIF-1α、VEGF蛋白表达
a. 电泳图 1～3： DMOG组 4～6：YC-1组 7～9：空白对照组； b. 蛋白相对表达量
Figure8. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by Western blot at 7 days after operationa. Electropherogram 1-3: DMOG group 4-6: YC-1 group 7-9: Control group; b. Relative protein expressions
3 讨论
既往有研究采用不同干预方式促进皮瓣血管生成，提高皮瓣成活率。陶先耀等[12]通过腹腔注射DMOG预处理来影响大鼠跨区穿支皮瓣成活及闭塞区血管生成，发现DMOG可提高皮瓣VEGF表达，促进跨区穿支皮瓣闭塞区血管生成，进而改善皮瓣血供。习珊珊等[14]研究发现通过尾静脉注射DMOG能改善大鼠跨区皮瓣血管体区微循环，减轻皮瓣缺血及缺氧程度，提高皮瓣成活率。上述研究仅探索了DMOG处理后对皮瓣血管生成的影响，未对跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区血管生成的作用机制进行深入研究，为此我们进行了本次研究。研究结果显示DMOG组皮瓣成活面积明显大于YC-1组和空白对照组；HE染色及明胶-氧化铅血管造影观察见DMOG组Choke Ⅱ区血管结构清晰完整，血管数量明显多于其余两组；ELISA检测示DMOG组中HIF-1α和VEGF表达持续增加，且明显高于其余两组。
上述结果表明DMOG可增强跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区HIF-1α和VEGF表达，促进Choke Ⅱ区血管新生，改善皮瓣远端血液供应，扩大了跨区穿支皮瓣可切取面积，提高了穿支皮瓣成活率。分析其作用机制主要包括以下三方面：第一，DMOG可提高跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α的表达。VEGF是促进血管生成的重要因子之一，可促进血管内皮细胞增殖、分化及迁移等，进而促进血管新生与再通[19-20]。而Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α表达增加为该区血管生成提供了有利条件，改善跨区穿支皮瓣潜在区血液供应，从而扩大跨区穿支皮瓣的可切取面积、提高成活率。第二，DMOG是一种非特异性脯氨酸羟化酶抑制剂，可抑制脯氨酸羟化酶活性，模拟一种相对缺氧环境，抑制HIF-1α的降解，使HIF-1α在细胞内聚集，从而激活下游基因的转录与表达，发挥其调节作用[16]。而HIF-1α是促血管生成的主要调控因子，随细胞内氧浓度变化调控下位基因的表达与转录。在有氧条件下HIF-1α不稳定，可经脯氨酸羟化酶羟化启动泛素-蛋白酶途径将其水解；在缺氧情况下HIF-1α稳定，可转移至细胞核内与HIF-1β结合组成异二聚体，再与细胞核内染色体上的顺式作用元件相互作用，调控包括VEGF、促红细胞生成素、血管生成素1等相关基因的转录与表达[7，21] ，使上述物质在细胞内积聚增加，更大程度地发挥其促血管生成作用，降低了跨区穿支皮瓣潜在区缺血缺氧损伤。第三，本研究给药途径为腹腔注射，相对于灌胃给药，消除了药物的首过效应，更有利于药物吸收，最大限度地发挥药物作用。
综上述，DMOG能促进跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区血管生成，增加皮瓣血液供应和灌注，使皮瓣缺血、缺氧得到有效改善，提高了跨区穿支皮瓣的可切取面积和成活率。但本研究应用DMOG干预后仅检测了皮瓣Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α表达。未来还需进一步研究DMOG可能通过其他相关因子促进血管生成的通路。此外，皮瓣成活是多因素共同作用的结果，本研究仅从促血管生成角度研究对皮瓣成活的影响，其他影响因素还需进一步探索。同时，还需深入研究DMOG的毒副作用，为临床应用安全性提供实验依据。
作者贡献：曾秀安、杨其兵、汪其苑负责资料收集及实验；曾秀安负责撰写文章；杨其兵、罗想利、陈永新、李继东负责数据、图片收集整理和统计分析；厉孟、蓝旭负责研究设计、内容构思、观点形成、文章结构设计、文章修改，并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经甘肃省人民医院医学伦理委员会批准（2021-222）。实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0001；实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0029。
自Koshima等[1]提出“穿支皮瓣”概念以来，跨区穿支皮瓣因可切取面积大、修复效果好、供区损伤小等特点，常被用于皮肤软组织缺损修复。Cormack等[2]将皮肤血管供区分为解剖区、血流动力学区和潜在区。跨区穿支皮瓣在解剖区和血流动力学区成活相对稳定，在潜在区易发生缺血坏死，限制了在临床上广泛应用[3-4]。因此，如何提高跨区穿支皮瓣移植后的成活率仍是需解决的问题。
相邻血管体之间相互吻合的血管称为“Choke血管”，该血管对跨区穿支皮瓣的成活极其重要[5]。Xu等[6]在多血管体穿支皮瓣研究中发现存在ChokeⅠ区和Ⅱ区，前者位于解剖区与血流动力学区之间，后者位于血流动力学区与潜在区之间；ChokeⅡ区血管生成减少和血液灌注不足是导致跨区穿支皮瓣坏死的主要原因之一。因此，促进Choke血管生成、改善血液供应等，对跨区穿支皮瓣成活至关重要[7]。
有学者提出通过手术延迟、药物干预等方式来促进跨区穿支皮瓣血管生成、改善血供[8-9]。然而，手术延迟不仅增加了手术次数和感染风险，还给患者带来较大创伤。药物干预具有损伤小、相对安全等优点，逐渐成为研究热点，并取得一定成果，但药物作用机制及最佳给药途径需进一步研究[10-11]。二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）是一种非特异性脯氨酸羟化酶抑制剂，可有效抑制脯氨酸羟化酶活性，使缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）积聚，从而激活下游VEGF、红细胞生成素等基因的表达，继而促进血管生成[12-13]。研究发现DMOG可促进皮瓣血管生成、改善血供，提高皮瓣成活率[12, 14]。但目前有关DMOG对跨区穿支皮瓣ChokeⅡ区血管生成影响的相关研究较少。本研究以大鼠为模型，观察腹腔注射DMOG对跨区穿支皮瓣ChokeⅡ区血管生成和皮瓣潜在区成活的影响，探索其作用机制，为临床采用跨区穿支皮瓣修复大面积皮肤软组织缺损、提高皮瓣成活率提供治疗思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年雄性SD大鼠126只，体质量240～300 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。DMOG、HIF-1α抑制剂YC-1（Selleck公司，美国）；多克隆抗体HIF-1α、VEGF（Abcam公司，美国）；DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组织化学染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；300 Bloom明胶、水合氯醛（天津市光复精细化工研究所）；PBS缓冲液（兰州总医院骨科研究所）；红色氧化铅（天津市致远化学试剂有限公司）；鼠HIF-1α ELISA试剂盒、鼠VEGF ELISA试剂盒（TSZ科技有限公司，美国）；聚偏氟乙烯膜、BCA蛋白定量试剂盒、高效RIPA组织细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、脱脂奶粉、滤纸、脱敏发光液（北京索来宝科技有限公司）。
荧光显微镜（Olympus公司，日本）；酶标仪（伯腾仪器有限公司，美国）；H1650-W台式微量高速离心机、台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）。
1.2 实验分组及方法
采用随机数字表法将126只大鼠分为DMOG组、YC-1组、空白对照组，每组42只。3组大鼠参照文献 ［15］方法制备跨区穿支皮瓣模型。具体步骤：大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6 mg/kg）麻醉后，俯卧于操作台并四肢固定，背部脱毛处理，记号笔标记跨区穿支皮瓣区域12 cm×3 cm。聚维酮碘溶液消毒，铺无菌单，切开皮肤至深筋膜浅层，沿筋膜层向对侧缓慢分离，逐层掀起分离皮瓣，充分暴露髂腰动脉、肋间后动脉、胸背动脉。结扎并切断肋间后动脉和胸背动脉，保留髂腰动脉为皮瓣穿支血管，获得以髂腰动脉为蒂的三血管体穿支皮瓣（图1）。创面彻底结扎止血后，以4-0缝线原位间断缝合皮缘。
图1
跨区穿支皮瓣模型制备示意图
a. 皮瓣设计；b. 岛状皮瓣；c. 切取的皮瓣；d. 皮瓣原位缝合
Figure1. Schematic diagram of flap model preparationa. Flap design; b. Island flap; c. The flap was dissected; d. The flap was sutured in situ
术前1 d、2 h以及术后1、2、3 d，DMOG组腹腔注射2 mL含DMOG（40 mg/kg）的生理盐水[16]，YC-1组注射2 mL含YC-1（10 mg/kg）的生理盐水[17-18]，空白对照组给予等量生理盐水。术后大鼠均单独饲养并自由觅食、饮水。于术后3、5、7 d 取大鼠同上法麻醉后行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
术后观察各组大鼠皮瓣成活情况，包括皮瓣颜色、质地及是否发生坏死。术后7 d各组取6只大鼠，切取整块皮瓣组织并掀起展开，通过皮瓣透光试验观察血管生成情况；使用Image J软件测量皮瓣成活面积，计算皮瓣成活率，公式为：成活面积/总面积×100%。
1.3.2 血管造影观察
术后7 d各组取6只大鼠，采用血管造影观察皮瓣ChokeⅡ区血管生成情况。大鼠仰卧位固定，分离一侧颈总动脉以及对侧颈内静脉并用慕丝线标记。将硅胶管留置针置入颈总动脉，排尽大鼠体内血液后注入生理盐水肝素，直至颈内静脉流出清亮生理盐水。然后，将大鼠置于40℃水浴锅中，将明胶-氧化铅混合物（50 mL/kg）注入颈总动脉，直至四肢末端出现点状、斑块状颜色时停止灌注。将大鼠置于4℃冰箱，隔日剥离皮瓣，平铺拍摄X线片，观察血管生成情况。
1.3.3 组织学观察
术后7 d各组取6只大鼠，取ChokeⅡ区皮瓣组织，面积2.0 cm×0.6 cm，置于甲醛固定，常规脱水包埋切片，片厚5 μm。每只大鼠取1张切片行HE染色，在低倍镜下找到血管密集区，再在高倍镜下选取5个视野，使用Image J软件计数血管。
1.3.4 免疫组织化学染色观测
取1.3.3中制作的切片（每只大鼠取1张），置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，用中火微波处理10 min后取出自然冷却；蒸馏水清洗3次，PBS缓冲液清洗，加入0.01% Triton X-100，37℃孵育10 min；加入3%H2O2，37℃孵育10 min；加入5%牛血清白蛋白，37℃孵育20 min；加入HIF-1α、VEGF一抗（兔多克隆抗体稀释比为1∶100），4℃冰箱中过夜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30 min。取出湿盒加入SABC，37℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，甲醛固定，中性树脂封片。在40×10倍光镜下观察HIF-1α、VEGF分布，阳性染色呈棕黄色或黄褐色。
1.3.5 ELISA检测
术后3、5、7 d，各组分别取6只大鼠ChokeⅡ区皮瓣组织250 mg，加入PBS缓冲液，冰浴下研磨，以离心半径10 cm，12 000 r/min离心30 min；取上清，参照BCA蛋白定量试剂盒检测HIF-1α、VEGF蛋白总浓度。
1.3.6 Western blot检测
术后7 d各组取6只大鼠ChokeⅡ区皮瓣组织蛋白，调节蛋白浓度，凝胶电泳、湿法转膜，在50 g/L脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h，加入小鼠抗大鼠VEGF、HIF-1α一抗（稀释比1∶300），4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗（稀释比1∶4 000），室温孵育2 h。化学发光、显影，图像分析系统行灰度扫描分析，以与内参β-actin灰度值比值表示VEGF、HIF-1α蛋白相对表达量。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS23.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体及血管造影观察
术后7 d，DMOG组切口愈合良好，皮瓣远端未见明显坏死，皮瓣质地较软、未出现发黑结痂；空白对照组和YC-1组切口愈合欠佳，皮瓣发生坏死且主要位于远端，皮瓣质地较硬，可见黑色痂皮。见图2。DMOG组大鼠皮瓣成活率为90.28%±1.37%，高于YC-1组84.28%±1.45%及空白对照组85.83%±1.60%，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。皮瓣透光试验及血管造影观察显示DMOG组皮瓣ChokeⅡ区血管生成较多且结构清晰、完整；YC-1组及空白对照组Choke Ⅱ区血管较少，血管结构紊乱。见图3、4。
图2
术后7 d各组皮瓣大体观察
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure2. Gross observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
图3
术后7 d透光试验观察各组皮瓣血管生成情况
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure3. Flap angiogenesis observed by light transmission test at7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
图4
术后7 d各组皮瓣血管造影观察
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure4. Angiography observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
2.2 组织学及免疫组织化学染色观察
术后7 d，与YC-1组和空白对照组相比，DMOG组血管明显增多且管腔形态结构较完整（图5）。DMOG组、YC-1组、空白对照组血管数量分别为（25.56±1.29）、（7.38±0.54）、（14.48±0.91）条/视野。DMOG组高于其余两组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图5
术后7 d 各组皮瓣HE染色观察（×200）
a. DMOG组；b. YC-1组；c. 空白对照组
Figure5. HE staining of flaps in each group at 7 days after operation (×200)a. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
术后7 d，DMOG组皮瓣Choke Ⅱ区HIF-1α、VEGF表达显著，染色明显强于YC-1组、空白对照组（图6）。
图6
术后7 d各组免疫组织化学染色观察（×400）
从左至右分别为DMOG组、 YC-1组、空白对照组 a. HIF-1α；b. VEGF
Figure6. Immunohistochemical staining of flaps in each group at 7 days after operation (×400)From left to right for DMOG group, YC-1 group, and Control group a. HIF-1α; b. VEGF
2.3 ELISA检测
术后3、5、7 d DMOG组皮瓣ChokeⅡ区HIF-1α、VEGF表达量均高于YC-1组、空白对照组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图7
术后各时间点各组ELISA法检测HIF-1α及VEGF蛋白表达
a. HIF-1α；b. VEGF
Figure7. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by ELISA at each time point after operationa. HIF-1α; b. VEGF
2.4 Western blot检测
术后7 d ，DMOG组HIF-1α、VEGF蛋白相对表达量均高于空白对照组和YC-1组，空白对照组高于YC-1组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图8。
图8
术后7 d Western blot检测HIF-1α、VEGF蛋白表达
a. 电泳图 1～3： DMOG组 4～6：YC-1组 7～9：空白对照组； b. 蛋白相对表达量
Figure8. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by Western blot at 7 days after operationa. Electropherogram 1-3: DMOG group 4-6: YC-1 group 7-9: Control group; b. Relative protein expressions
3 讨论
既往有研究采用不同干预方式促进皮瓣血管生成，提高皮瓣成活率。陶先耀等[12]通过腹腔注射DMOG预处理来影响大鼠跨区穿支皮瓣成活及闭塞区血管生成，发现DMOG可提高皮瓣VEGF表达，促进跨区穿支皮瓣闭塞区血管生成，进而改善皮瓣血供。习珊珊等[14]研究发现通过尾静脉注射DMOG能改善大鼠跨区皮瓣血管体区微循环，减轻皮瓣缺血及缺氧程度，提高皮瓣成活率。上述研究仅探索了DMOG处理后对皮瓣血管生成的影响，未对跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区血管生成的作用机制进行深入研究，为此我们进行了本次研究。研究结果显示DMOG组皮瓣成活面积明显大于YC-1组和空白对照组；HE染色及明胶-氧化铅血管造影观察见DMOG组Choke Ⅱ区血管结构清晰完整，血管数量明显多于其余两组；ELISA检测示DMOG组中HIF-1α和VEGF表达持续增加，且明显高于其余两组。
上述结果表明DMOG可增强跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区HIF-1α和VEGF表达，促进Choke Ⅱ区血管新生，改善皮瓣远端血液供应，扩大了跨区穿支皮瓣可切取面积，提高了穿支皮瓣成活率。分析其作用机制主要包括以下三方面：第一，DMOG可提高跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α的表达。VEGF是促进血管生成的重要因子之一，可促进血管内皮细胞增殖、分化及迁移等，进而促进血管新生与再通[19-20]。而Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α表达增加为该区血管生成提供了有利条件，改善跨区穿支皮瓣潜在区血液供应，从而扩大跨区穿支皮瓣的可切取面积、提高成活率。第二，DMOG是一种非特异性脯氨酸羟化酶抑制剂，可抑制脯氨酸羟化酶活性，模拟一种相对缺氧环境，抑制HIF-1α的降解，使HIF-1α在细胞内聚集，从而激活下游基因的转录与表达，发挥其调节作用[16]。而HIF-1α是促血管生成的主要调控因子，随细胞内氧浓度变化调控下位基因的表达与转录。在有氧条件下HIF-1α不稳定，可经脯氨酸羟化酶羟化启动泛素-蛋白酶途径将其水解；在缺氧情况下HIF-1α稳定，可转移至细胞核内与HIF-1β结合组成异二聚体，再与细胞核内染色体上的顺式作用元件相互作用，调控包括VEGF、促红细胞生成素、血管生成素1等相关基因的转录与表达[7，21] ，使上述物质在细胞内积聚增加，更大程度地发挥其促血管生成作用，降低了跨区穿支皮瓣潜在区缺血缺氧损伤。第三，本研究给药途径为腹腔注射，相对于灌胃给药，消除了药物的首过效应，更有利于药物吸收，最大限度地发挥药物作用。
综上述，DMOG能促进跨区穿支皮瓣Choke Ⅱ区血管生成，增加皮瓣血液供应和灌注，使皮瓣缺血、缺氧得到有效改善，提高了跨区穿支皮瓣的可切取面积和成活率。但本研究应用DMOG干预后仅检测了皮瓣Choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α表达。未来还需进一步研究DMOG可能通过其他相关因子促进血管生成的通路。此外，皮瓣成活是多因素共同作用的结果，本研究仅从促血管生成角度研究对皮瓣成活的影响，其他影响因素还需进一步探索。同时，还需深入研究DMOG的毒副作用，为临床应用安全性提供实验依据。
作者贡献：曾秀安、杨其兵、汪其苑负责资料收集及实验；曾秀安负责撰写文章；杨其兵、罗想利、陈永新、李继东负责数据、图片收集整理和统计分析；厉孟、蓝旭负责研究设计、内容构思、观点形成、文章结构设计、文章修改，并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经甘肃省人民医院医学伦理委员会批准（2021-222）。实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0001；实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0029。
