引用本文： 丛雨轩, 张斌飞, 付亚辉, 魏星, 王虎, 邓洪利, 庄岩, 张堃, 雷金来. 重组人BMP-2/多孔磷酸钙人工骨/自体骨结合富血小板血浆在Masquelet技术修复兔大段骨缺损中的应用研究. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(10): 1288-1295. doi: 10.7507/1002-1892.202204112 复制
骨缺损刻有创伤、感染、结核、骨肿瘤切除等原因导致，是临床常见疾病之一[1]。大段骨缺损无法通过自身修复重建愈合[2]，进而造成肢体功能障碍，严重影响患者生活质量。Masquelet技术因具有术后愈合快、负重时间早、无需显微外科吻合血管、治疗费用少等优点，尤其适用于治疗创伤后大段骨缺损[3]。但该技术二期需植入大量自体松质骨，而自体松质骨来源有限，制约了其在临床上的广泛应用。磷酸钙人工骨（calcium phosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性和降解性能，能促进新骨生成，固化后成分转化为低结晶度羟基磷酸钙，与正常人体骨骼无机盐成分相似[4]。重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）可以促进BMSCs分化为成骨样细胞，并促进成骨细胞增殖，从而诱导成骨[5]。将rhBMP-2和多孔CPC（porous CPC，PCPC）固化体通过低温吸附冻干保护技术制成rhBMP-2/PCPC复合材料，可以控制rhBMP-2 的释放速度，使其更好地发挥生物活性，有效促进骨生长，加速骨折愈合，可用于骨缺损的填充[6]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）含有高浓度生长因子[7]，可以促进骨折愈合，已在创伤修复领域得到广泛应用。
本研究拟通过动物实验，采用rhBMP-2/PCPC复合材料与自体骨混合物作为Masquelet技术二期植骨材料，探索其具有最佳成骨能力时的混合比例，从而减少植骨过程中自体骨的使用，解决自体骨来源不足的问题；同时将PRP与rhBMP-2/PCPC、自体骨结合，以期解决混合材料成骨能力不足的缺点，为大段骨缺损修复探索一种有效治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔54只，雌雄不限，体质量3.0～3.8 kg，平均3.5 kg，由天津裕达实验动物养殖有限公司提供。实验动物以标准饮食单笼饲养，研究期间可自由活动。
rhBMP-2/PCPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；ALP活性检测试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）。TE2000-U光学显微镜（Nikon公司，日本）；紫外可见光分光光度计（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HY-0230机械试验机（上海衡翼精密仪器有限公司）。
1.2 确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
1.2.1 骨缺损模型建立
取36只实验动物，以速眠新（0.2 mL/kg）肌肉注射麻醉后固定于手术台，右前肢备皮，常规消毒、铺巾，作前肢侧向4～5 cm长切口，切开皮肤及皮下浅、深筋膜，尽量避开皮下血管，沿肌肉间隙分离，逐步暴露尺骨。剥离尺骨骨膜，在尺骨中段用无菌小摆锯锯开，生理盐水冲洗以减少骨坏死；再向近端距第1条截骨线约2.5 cm处作第2条截骨线，连同骨膜去除两线之间的骨段，制备2 cm长骨缺损模型。
1.2.2 Masquelet技术治疗过程
生理盐水冲洗断端骨碎屑、淤血及骨髓腔内骨髓组织等，按照Masquelet技术第一阶段方案，用聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）骨水泥填充骨缺损，冲洗后缝合软组织及皮肤。因桡骨为兔的主要负重骨，可以提供足够稳定性，故尺骨无需固定。术后禁食、水12 h，单笼饲养，并给予抗生素（青霉素40万U/只，肌肉注射，2次/d，连续3 d）预防感染。术后3、5 d切口换药；检查体温、体质量和一般情况，直至切口愈合。术后实验动物可正常负重，活动不受限制。
术后4周对实验动物同上法麻醉后，从左侧髂骨翼取自体骨（15 mm×4 mm×2 mm），制成自体骨颗粒备用。沿右上肢原切口切开皮肤及软组织，按照Masquelet技术第二阶段方案切开已形成的诱导膜，取出PMMA骨水泥；于诱导膜内植入不同质量比的自体骨和rhBMP-2/PCPC混合物，缝合诱导膜、软组织及皮肤。见图1。术后护理同前。
图1
骨缺损模型建立及Masquelet技术治疗过程
a. 沿右前肢侧向切开逐层显露尺骨；b. 用小摆锯截骨形成骨缺损；c. PMMA骨水泥填充骨缺损；d. 4周后取出PMMA骨水泥，保留诱导膜；e. 植入自体骨与rhBMP-2/PCPC混合物
Figure1. Process of bone defect model establishment and Masquelet technique treatmenta. Lateral incision along the right forelimb to reveal the ulna; b. Osteotomy to form the bone defect; c. PMMA cement filling of the bone defect; d. Removal of PMMA cement after 4 weeks, preserving the induced membrane; e. Implantation of autologous bone with rhBMP-2/PCPC mixture
1.2.3 实验分组
根据植入自体骨及rhBMP-2/PCPC质量比不同，将36只已造模的实验动物随机分为4组，每组9只。A组：自体骨（100%）；B组：25%自体骨+75%rhBMP-2/PCPC；C组：50%自体骨+50%rhBMP-2/PCPC；D组：75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC。
1.2.4 观测指标
分别于术后4、8、12周同上法麻醉，每组处死实验动物3只。① 大体观察：术后各时间点于右尺骨原手术部位取材，大体观察骨缺损愈合情况。② 影像学检查：术后各时间点摄尺骨标本正侧位X线片，观察骨缺损愈合情况。③ 组织学观察：术后各时间点取尺骨标本，经生理盐水冲洗、固定、脱水后，石蜡包埋、切片（厚5 μm），常规HE染色，光镜下观察。④ ALP活性检测：术后各时间点取尺骨标本，按照ALP活性检测试剂盒操作方法，使用紫外可见光分光光度计检测570 nm波长下吸光度（A）值，根据标准曲线计算样本ALP活性。⑤ 三点弯曲生物力学试验：术后各时间点取各组完整右上肢标本，维持22℃、62%相对湿度环境下，将标本放置于间距为20 mm的2个支架上，使用机械试验机以5 mm/min恒定位移率在缺损中点施加弯曲载荷直至样本破损，自动记录此时的最大载荷。通过上述观测指标结果确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例。
1.3 最佳比例混合骨结合PRP成骨能力检测
1.3.1 PRP制备
取18只实验动物，同上法麻醉，抽取兔耳中央静脉血10 mL，以179×g离心10 min；离心产物分为3层，弃下层红细胞，将中间层（白细胞和炎症细胞因子）和上层（血浆）再次以1 029×g离心10 min；产物分为2层，弃上层透明血浆层，最终得到下层约1 mL血小板和白细胞沉积层，即为PRP。
1.3.2 实验分组
将18只实验动物同上法制备尺骨骨缺损模型并采用Masquelet技术治疗后，随机分为2组，每组9只。对照组植入最佳混合比例自体骨+rhBMP-2/PCPC，实验组植入最佳混合比例自体骨+rhBMP-2/PCPC+PRP。
1.3.3 观测指标
分别于术后4、8、12周同上法麻醉，每组处死实验动物3只，同1.2.4方法进行各项指标观测。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，多组间比较以及组内多时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，两组间比较比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以M（Q1，Q3）表示，组间及组内比较采用Mann-Whitney U检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
2.1.1 大体观察
术后新西兰大白兔均成活至实验完成。2只动物出现切口部分裂开，经换药后痊愈；无感染发生。术后4周，A、C、D组均可观察到尺骨缺损处断端膨大，B组断端局部出现凹陷；8周，各组均可见骨痂形成，断端无明显缺损；12周，各组均可见缺损处新骨与两侧骨皮质发生连接，B组缺损处被软组织包绕，断端膨大。见图2。
图2
术后12周A～D组大体观察
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure2. General observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.2 影像学检查
术后4周，各组X线片示骨缺损断端均有新骨生长，新骨密度较低；8周，各组新骨生长较4周时强烈，两端与正常宿主骨质形成桥接，骨密度低于正常骨组织，侧位X线片示B组新骨横向宽度最细；12周，各组形成新骨重塑，与两端宿主骨皮质连续，新骨密度同正常部位骨密度一致，侧位X线片示B组单侧骨皮质连续。见图3。
图3
术后12周A～D组X线片
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure3. X-ray flims of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.3 组织学观察
术后4周，各组均可观察到骨细胞、纤维结缔组织、透明软骨、少量新骨、部分新生不规则血管结构，其中B、C组可见较多纤维结缔组织和透明软骨。8周，各组可见新形成编织骨、毛细血管增多，并可见新骨内骨髓腔形成，纤维结缔组织、透明软骨减少。12周，A、D组可见成熟骨组织形成，具有良好骨髓、血管等结构；B、C组新形成骨组织较其他组少，可见纤维结缔组织、透明软骨。见图4。
图4
术后12周A～D组组织学观察（HE×200）
黑箭头示新生骨组织，蓝箭头示髓腔结构，白箭头示纤维结缔组织，红箭头示软骨组织 a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure4. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed marrow cavity structure, white arrow showed fibrous connective tissue, red arrow showed cartilage tissue a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.4 ALP活性检测
随时间延长，各组ALP活性均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点A组ALP活性显著高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1
A～D组术后ALP活性检测比较（n=3，
，U/gprot）
Table1.
Comparison of ALP activity after operation between groups A-D (n=3, 
, U/gprot)
2.1.5 生物力学检测
随时间延长，各组最大载荷均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点A、D组最大载荷显著高于B、C组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2
A～D组术后三点弯曲试验最大载荷比较（n=3，
，N）
Table2.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between groups A-D (n=3, 
, N)
根据上述检测，得出最佳混合比例为75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC。
2.2 最佳比例混合骨结合PRP成骨能力检测
2.2.1 大体观察
术后4周，两组均可见缺损断端膨大；8周，两组均可见骨痂及软组织增生包绕缺损处；12周，两组均可见缺损处新骨与两端皮质骨连续，其中实验组有少量软组织包绕，轻微膨大。见图5。
图5
术后12周对照组和实验组大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure5. General observation of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.2 影像学检查
术后4周，两组X线片示骨缺损处被骨痂包绕，新骨形成；8周，新骨与两端正常宿主骨质形成桥接；12周，新骨与两端宿主骨骨皮质连续，其中实验组骨质膨大。见图6。
图6
术后12周对照组和实验组X线片
a. 对照组；b. 实验组
Figure6. X-ray films of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.3 组织学观察
术后4周，两组骨细胞、纤维结缔组织、新骨、新生血管等无明显差别；8、12周，与对照组相比，实验组可见更多骨组织、更少纤维结缔组织。见图7。
图7
术后12周对照组和实验组组织学观察（HE×200）
黑箭头示新生骨组织，蓝箭头示髓腔结构 a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Histological observation of control and experimental groups at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed the structure of the medullary cavity a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 ALP活性检测
随时间延长，两组ALP活性均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点实验组ALP活性均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
表3
实验组和对照组术后ALP活性检测比较（n=3，
，U/gprot）
Table3.
Comparison of ALP activity after operation between experimental and control groups (n=3, 
, U/gprot)
2.2.5 生物力学检测
随时间延长，两组最大载荷均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点实验组最大载荷均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。与术后12周A组最大载荷比较，术后12周实验组最大载荷显著增加，差异有统计学意义（t=−72.975，P<0.001）。
表4
实验组和对照组术后三点弯曲试验最大载荷比较（n=3，
，N）
Table4.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between experimental and control groups (n=3, 
, N)
3 讨论
大段骨缺损的治疗是骨科医生面临的重大临床挑战[8]。Masquelet技术是目前解决大段骨缺损的有效方法之一，而制约其临床应用的最主要因素是在第二阶段手术中需要填充大量自体松质骨。自体骨是治疗骨缺损的金标准[9]，但其来源及取骨量有限。作为自体骨的替代物，人工骨材料无免疫排斥反应、来源广泛，是临床重要的骨修复重建材料[10]。PCPC具有优良生物相容性、可降解和易成型的优点，但无骨诱导活性；将其与rhBMP-2复合后，不仅具有骨传导性，还具骨诱导活性，能够提高组织工程骨的成骨能力[11]，是目前应用较多的提高骨缺损修复效果手段[5，12]。
自体骨与同种异体骨混合移植的方式，可以减少自体骨使用。在Masquelet技术第二阶段手术中，有研究表明自体骨与同种异体骨混合比例需超过3∶1[13]。张一等[14]将硫酸钙颗粒与自体松质骨混合填入骨缺损中，结果显示硫酸钙颗粒与自体松质骨比例可超过1∶3，甚至可完全由硫酸钙颗粒填充（骨缺损<5 cm）。rhBMP-2/PCPC与自体骨的最佳混合比例目前尚无相关研究。本研究结果显示，D组75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC成骨能力最佳。以A组100%自体骨作为实验验证标准，虽然D组与A组在ALP活性及生物力学性能上存在一定差距，但大体观察及影像学检查结果显示D组样本填充骨缺损后均达到骨愈合，组织学观察也表明缺损处新骨形成并连接两侧断端骨皮质，骨组织结构及血管结构与A组无明显差异。rhBMP-2/PCPC占25%的比例无法再提高，我们分析原因是PCPC具有骨传导性但无骨诱导性，虽然复合rhBMP-2后具备了一定骨诱导活性，但成骨细胞等仍需由自体骨组织提供，当自体骨含量比例较小时，成骨相关细胞数量不足会影响成骨能力。
在骨缺损治疗中常提到“钻石学说”[15]，该学说的四要素包括稳定的力学环境、骨传导支架、成骨细胞与生长因子。生长因子的使用有利于骨缺损愈合，在自体骨相对不足情况下，可以通过复合生长因子来提高骨愈合率。BMP-2与BMP-7是目前临床上常用的两种生长因子，有研究表明单独BMP-2治疗骨缺损患者的愈合率高于接受BMP-7治疗的患者[16]。PCPC的自身特点使其可以充当BMP的理想载体。当与PCPC结合时，rhBMP-2保留时间可以延长，以避免蛋白酶的酶解。本研究将PCPC和rhBMP-2复合，与自体骨植入Masquelet兔尺骨缺损模型，术后12周B～D组可观察到新生骨组织形成，影像学观察达到骨愈合标准，说明PCPC与rhBMP-2发挥了良好成骨能力，在动物实验中与不同比例自体骨混合均可以修复大段骨缺损。D组与A组在ALP活性及生物力学测试上仍存在差距，如果将实验时间延长，这种区别能否缩小需要进一步研究。
PRP是通过离心方法从自体血中提取的血小板浓缩物，含有高浓度血小板、白细胞和纤维蛋白。血小板激活后能释放出多种生长因子，这些生长因子可促进细胞增殖分化，促进骨与软组织修复；高浓度白细胞能起到较好的抗感染作用；纤维蛋白可为组织修复提供良好网络结构，为修复细胞的爬行提供支架。目前研究表明，PRP可以促进骨愈合，治疗骨不连[17]，其作用于骨缺损局部，使得PDGF及TGF-β含量增加，成骨细胞数量增加，并使巨噬细胞聚集到骨折断端，持续释放生长因子，使生长因子在3个月内维持较高水平，从而达到促进新骨形成的作用。Kanthan等[18]制作了兔胫骨骨折延迟愈合模型，发现PRP复合人工骨能促进骨修复，而单独使用PRP却不能达到最好效果；Dong等[19]也在新西兰白兔实验模型中证实自体PRP能有效促进组织工程骨愈合过程中血管发生和骨形成，具有潜在临床应用意义。
本研究将PRP与最佳混合比例植骨组（75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC）联合应用，结果表明实验组ALP活性明显高于对照组；在生物力学研究中，术后8、12周实验组最大载荷明显优于对照组，12周时实验组最大载荷明显高于A组（100%自体骨）。表明在PRP促进下，实验组骨强度已超过A组，PRP明显改善了新生骨的力学强度。我们分析原因是PRP可与诱导膜内微血管系统和成骨相关因子发挥协同作用，共同促进移植骨再血管化，诱导成骨细胞增殖，加快骨缺损区骨痂形成和植骨后骨愈合质量，通过增加新骨强度对长骨缺损发挥治疗作用[20]。由于血管生成和血管内皮细胞穿透软骨痂是由促血管生成因子刺激的，PRP可能启动骨折愈合过程，并且PRP中存在或释放的生长因子可能提供了诱导新骨形成的细胞信号，在骨愈合早期阶段起作用[21]。BMP的诱导作用是个级联过程，因此BMP在骨愈合中起主要作用[22-23]。联合BMP和自体PRP治疗骨缺损，在骨愈合的各个时期促进成骨，是目前可提供的最优治疗选择[24-25]。
本研究仍存在一些不足之处。首先，实验动物样本量较少，数据容易产生偏倚，进而影响实验结果；其次，PRP与rhBMP-2/PCPC复合材料及自体骨进行混合，PRP的最佳浓度和使用剂量尚不能明确；最后，rhBMP-2/PCPC复合材料与自体骨混合，需要更长期观察来验证其最佳混合比例。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经西安交通大学医学院动物伦理委员会批准（2019-175-115）；实验动物生产许可证批准号：SCXK（津）2021-0001，使用许可证批准号：SYXK2021-0015
作者贡献声明 丛雨轩：研究设计及实施、文章撰写；张斌飞、付亚辉：研究实施，数据收集；魏星：统计分析；王虎：文献回顾，起草文章；庄岩：对文章的知识性内容作批评性审阅；张堃：行政支持；雷金来：研究设计，经费支持；邓洪利：文献回顾
骨缺损刻有创伤、感染、结核、骨肿瘤切除等原因导致，是临床常见疾病之一[1]。大段骨缺损无法通过自身修复重建愈合[2]，进而造成肢体功能障碍，严重影响患者生活质量。Masquelet技术因具有术后愈合快、负重时间早、无需显微外科吻合血管、治疗费用少等优点，尤其适用于治疗创伤后大段骨缺损[3]。但该技术二期需植入大量自体松质骨，而自体松质骨来源有限，制约了其在临床上的广泛应用。磷酸钙人工骨（calcium phosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性和降解性能，能促进新骨生成，固化后成分转化为低结晶度羟基磷酸钙，与正常人体骨骼无机盐成分相似[4]。重组人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）可以促进BMSCs分化为成骨样细胞，并促进成骨细胞增殖，从而诱导成骨[5]。将rhBMP-2和多孔CPC（porous CPC，PCPC）固化体通过低温吸附冻干保护技术制成rhBMP-2/PCPC复合材料，可以控制rhBMP-2 的释放速度，使其更好地发挥生物活性，有效促进骨生长，加速骨折愈合，可用于骨缺损的填充[6]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）含有高浓度生长因子[7]，可以促进骨折愈合，已在创伤修复领域得到广泛应用。
本研究拟通过动物实验，采用rhBMP-2/PCPC复合材料与自体骨混合物作为Masquelet技术二期植骨材料，探索其具有最佳成骨能力时的混合比例，从而减少植骨过程中自体骨的使用，解决自体骨来源不足的问题；同时将PRP与rhBMP-2/PCPC、自体骨结合，以期解决混合材料成骨能力不足的缺点，为大段骨缺损修复探索一种有效治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6月龄新西兰大白兔54只，雌雄不限，体质量3.0～3.8 kg，平均3.5 kg，由天津裕达实验动物养殖有限公司提供。实验动物以标准饮食单笼饲养，研究期间可自由活动。
rhBMP-2/PCPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；ALP活性检测试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）。TE2000-U光学显微镜（Nikon公司，日本）；紫外可见光分光光度计（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HY-0230机械试验机（上海衡翼精密仪器有限公司）。
1.2 确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
1.2.1 骨缺损模型建立
取36只实验动物，以速眠新（0.2 mL/kg）肌肉注射麻醉后固定于手术台，右前肢备皮，常规消毒、铺巾，作前肢侧向4～5 cm长切口，切开皮肤及皮下浅、深筋膜，尽量避开皮下血管，沿肌肉间隙分离，逐步暴露尺骨。剥离尺骨骨膜，在尺骨中段用无菌小摆锯锯开，生理盐水冲洗以减少骨坏死；再向近端距第1条截骨线约2.5 cm处作第2条截骨线，连同骨膜去除两线之间的骨段，制备2 cm长骨缺损模型。
1.2.2 Masquelet技术治疗过程
生理盐水冲洗断端骨碎屑、淤血及骨髓腔内骨髓组织等，按照Masquelet技术第一阶段方案，用聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）骨水泥填充骨缺损，冲洗后缝合软组织及皮肤。因桡骨为兔的主要负重骨，可以提供足够稳定性，故尺骨无需固定。术后禁食、水12 h，单笼饲养，并给予抗生素（青霉素40万U/只，肌肉注射，2次/d，连续3 d）预防感染。术后3、5 d切口换药；检查体温、体质量和一般情况，直至切口愈合。术后实验动物可正常负重，活动不受限制。
术后4周对实验动物同上法麻醉后，从左侧髂骨翼取自体骨（15 mm×4 mm×2 mm），制成自体骨颗粒备用。沿右上肢原切口切开皮肤及软组织，按照Masquelet技术第二阶段方案切开已形成的诱导膜，取出PMMA骨水泥；于诱导膜内植入不同质量比的自体骨和rhBMP-2/PCPC混合物，缝合诱导膜、软组织及皮肤。见图1。术后护理同前。
图1
骨缺损模型建立及Masquelet技术治疗过程
a. 沿右前肢侧向切开逐层显露尺骨；b. 用小摆锯截骨形成骨缺损；c. PMMA骨水泥填充骨缺损；d. 4周后取出PMMA骨水泥，保留诱导膜；e. 植入自体骨与rhBMP-2/PCPC混合物
Figure1. Process of bone defect model establishment and Masquelet technique treatmenta. Lateral incision along the right forelimb to reveal the ulna; b. Osteotomy to form the bone defect; c. PMMA cement filling of the bone defect; d. Removal of PMMA cement after 4 weeks, preserving the induced membrane; e. Implantation of autologous bone with rhBMP-2/PCPC mixture
1.2.3 实验分组
根据植入自体骨及rhBMP-2/PCPC质量比不同，将36只已造模的实验动物随机分为4组，每组9只。A组：自体骨（100%）；B组：25%自体骨+75%rhBMP-2/PCPC；C组：50%自体骨+50%rhBMP-2/PCPC；D组：75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC。
1.2.4 观测指标
分别于术后4、8、12周同上法麻醉，每组处死实验动物3只。① 大体观察：术后各时间点于右尺骨原手术部位取材，大体观察骨缺损愈合情况。② 影像学检查：术后各时间点摄尺骨标本正侧位X线片，观察骨缺损愈合情况。③ 组织学观察：术后各时间点取尺骨标本，经生理盐水冲洗、固定、脱水后，石蜡包埋、切片（厚5 μm），常规HE染色，光镜下观察。④ ALP活性检测：术后各时间点取尺骨标本，按照ALP活性检测试剂盒操作方法，使用紫外可见光分光光度计检测570 nm波长下吸光度（A）值，根据标准曲线计算样本ALP活性。⑤ 三点弯曲生物力学试验：术后各时间点取各组完整右上肢标本，维持22℃、62%相对湿度环境下，将标本放置于间距为20 mm的2个支架上，使用机械试验机以5 mm/min恒定位移率在缺损中点施加弯曲载荷直至样本破损，自动记录此时的最大载荷。通过上述观测指标结果确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例。
1.3 最佳比例混合骨结合PRP成骨能力检测
1.3.1 PRP制备
取18只实验动物，同上法麻醉，抽取兔耳中央静脉血10 mL，以179×g离心10 min；离心产物分为3层，弃下层红细胞，将中间层（白细胞和炎症细胞因子）和上层（血浆）再次以1 029×g离心10 min；产物分为2层，弃上层透明血浆层，最终得到下层约1 mL血小板和白细胞沉积层，即为PRP。
1.3.2 实验分组
将18只实验动物同上法制备尺骨骨缺损模型并采用Masquelet技术治疗后，随机分为2组，每组9只。对照组植入最佳混合比例自体骨+rhBMP-2/PCPC，实验组植入最佳混合比例自体骨+rhBMP-2/PCPC+PRP。
1.3.3 观测指标
分别于术后4、8、12周同上法麻醉，每组处死实验动物3只，同1.2.4方法进行各项指标观测。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，多组间比较以及组内多时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，两组间比较比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以M（Q1，Q3）表示，组间及组内比较采用Mann-Whitney U检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 确定自体骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
2.1.1 大体观察
术后新西兰大白兔均成活至实验完成。2只动物出现切口部分裂开，经换药后痊愈；无感染发生。术后4周，A、C、D组均可观察到尺骨缺损处断端膨大，B组断端局部出现凹陷；8周，各组均可见骨痂形成，断端无明显缺损；12周，各组均可见缺损处新骨与两侧骨皮质发生连接，B组缺损处被软组织包绕，断端膨大。见图2。
图2
术后12周A～D组大体观察
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure2. General observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.2 影像学检查
术后4周，各组X线片示骨缺损断端均有新骨生长，新骨密度较低；8周，各组新骨生长较4周时强烈，两端与正常宿主骨质形成桥接，骨密度低于正常骨组织，侧位X线片示B组新骨横向宽度最细；12周，各组形成新骨重塑，与两端宿主骨皮质连续，新骨密度同正常部位骨密度一致，侧位X线片示B组单侧骨皮质连续。见图3。
图3
术后12周A～D组X线片
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure3. X-ray flims of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.3 组织学观察
术后4周，各组均可观察到骨细胞、纤维结缔组织、透明软骨、少量新骨、部分新生不规则血管结构，其中B、C组可见较多纤维结缔组织和透明软骨。8周，各组可见新形成编织骨、毛细血管增多，并可见新骨内骨髓腔形成，纤维结缔组织、透明软骨减少。12周，A、D组可见成熟骨组织形成，具有良好骨髓、血管等结构；B、C组新形成骨组织较其他组少，可见纤维结缔组织、透明软骨。见图4。
图4
术后12周A～D组组织学观察（HE×200）
黑箭头示新生骨组织，蓝箭头示髓腔结构，白箭头示纤维结缔组织，红箭头示软骨组织 a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure4. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed marrow cavity structure, white arrow showed fibrous connective tissue, red arrow showed cartilage tissue a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.4 ALP活性检测
随时间延长，各组ALP活性均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点A组ALP活性显著高于其余3组，C、D组高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1
A～D组术后ALP活性检测比较（n=3，，U/gprot）
Table1.
Comparison of ALP activity after operation between groups A-D (n=3, , U/gprot)
2.1.5 生物力学检测
随时间延长，各组最大载荷均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点A、D组最大载荷显著高于B、C组，C组高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2
A～D组术后三点弯曲试验最大载荷比较（n=3，，N）
Table2.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between groups A-D (n=3, , N)
根据上述检测，得出最佳混合比例为75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC。
2.2 最佳比例混合骨结合PRP成骨能力检测
2.2.1 大体观察
术后4周，两组均可见缺损断端膨大；8周，两组均可见骨痂及软组织增生包绕缺损处；12周，两组均可见缺损处新骨与两端皮质骨连续，其中实验组有少量软组织包绕，轻微膨大。见图5。
图5
术后12周对照组和实验组大体观察
a. 对照组；b. 实验组
Figure5. General observation of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.2 影像学检查
术后4周，两组X线片示骨缺损处被骨痂包绕，新骨形成；8周，新骨与两端正常宿主骨质形成桥接；12周，新骨与两端宿主骨骨皮质连续，其中实验组骨质膨大。见图6。
图6
术后12周对照组和实验组X线片
a. 对照组；b. 实验组
Figure6. X-ray films of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.3 组织学观察
术后4周，两组骨细胞、纤维结缔组织、新骨、新生血管等无明显差别；8、12周，与对照组相比，实验组可见更多骨组织、更少纤维结缔组织。见图7。
图7
术后12周对照组和实验组组织学观察（HE×200）
黑箭头示新生骨组织，蓝箭头示髓腔结构 a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Histological observation of control and experimental groups at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed the structure of the medullary cavity a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 ALP活性检测
随时间延长，两组ALP活性均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点实验组ALP活性均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
表3
实验组和对照组术后ALP活性检测比较（n=3，，U/gprot）
Table3.
Comparison of ALP activity after operation between experimental and control groups (n=3, , U/gprot)
2.2.5 生物力学检测
随时间延长，两组最大载荷均逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.05）。术后各时间点实验组最大载荷均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。与术后12周A组最大载荷比较，术后12周实验组最大载荷显著增加，差异有统计学意义（t=−72.975，P<0.001）。
表4
实验组和对照组术后三点弯曲试验最大载荷比较（n=3，，N）
Table4.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between experimental and control groups (n=3, , N)
3 讨论
大段骨缺损的治疗是骨科医生面临的重大临床挑战[8]。Masquelet技术是目前解决大段骨缺损的有效方法之一，而制约其临床应用的最主要因素是在第二阶段手术中需要填充大量自体松质骨。自体骨是治疗骨缺损的金标准[9]，但其来源及取骨量有限。作为自体骨的替代物，人工骨材料无免疫排斥反应、来源广泛，是临床重要的骨修复重建材料[10]。PCPC具有优良生物相容性、可降解和易成型的优点，但无骨诱导活性；将其与rhBMP-2复合后，不仅具有骨传导性，还具骨诱导活性，能够提高组织工程骨的成骨能力[11]，是目前应用较多的提高骨缺损修复效果手段[5，12]。
自体骨与同种异体骨混合移植的方式，可以减少自体骨使用。在Masquelet技术第二阶段手术中，有研究表明自体骨与同种异体骨混合比例需超过3∶1[13]。张一等[14]将硫酸钙颗粒与自体松质骨混合填入骨缺损中，结果显示硫酸钙颗粒与自体松质骨比例可超过1∶3，甚至可完全由硫酸钙颗粒填充（骨缺损<5 cm）。rhBMP-2/PCPC与自体骨的最佳混合比例目前尚无相关研究。本研究结果显示，D组75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC成骨能力最佳。以A组100%自体骨作为实验验证标准，虽然D组与A组在ALP活性及生物力学性能上存在一定差距，但大体观察及影像学检查结果显示D组样本填充骨缺损后均达到骨愈合，组织学观察也表明缺损处新骨形成并连接两侧断端骨皮质，骨组织结构及血管结构与A组无明显差异。rhBMP-2/PCPC占25%的比例无法再提高，我们分析原因是PCPC具有骨传导性但无骨诱导性，虽然复合rhBMP-2后具备了一定骨诱导活性，但成骨细胞等仍需由自体骨组织提供，当自体骨含量比例较小时，成骨相关细胞数量不足会影响成骨能力。
在骨缺损治疗中常提到“钻石学说”[15]，该学说的四要素包括稳定的力学环境、骨传导支架、成骨细胞与生长因子。生长因子的使用有利于骨缺损愈合，在自体骨相对不足情况下，可以通过复合生长因子来提高骨愈合率。BMP-2与BMP-7是目前临床上常用的两种生长因子，有研究表明单独BMP-2治疗骨缺损患者的愈合率高于接受BMP-7治疗的患者[16]。PCPC的自身特点使其可以充当BMP的理想载体。当与PCPC结合时，rhBMP-2保留时间可以延长，以避免蛋白酶的酶解。本研究将PCPC和rhBMP-2复合，与自体骨植入Masquelet兔尺骨缺损模型，术后12周B～D组可观察到新生骨组织形成，影像学观察达到骨愈合标准，说明PCPC与rhBMP-2发挥了良好成骨能力，在动物实验中与不同比例自体骨混合均可以修复大段骨缺损。D组与A组在ALP活性及生物力学测试上仍存在差距，如果将实验时间延长，这种区别能否缩小需要进一步研究。
PRP是通过离心方法从自体血中提取的血小板浓缩物，含有高浓度血小板、白细胞和纤维蛋白。血小板激活后能释放出多种生长因子，这些生长因子可促进细胞增殖分化，促进骨与软组织修复；高浓度白细胞能起到较好的抗感染作用；纤维蛋白可为组织修复提供良好网络结构，为修复细胞的爬行提供支架。目前研究表明，PRP可以促进骨愈合，治疗骨不连[17]，其作用于骨缺损局部，使得PDGF及TGF-β含量增加，成骨细胞数量增加，并使巨噬细胞聚集到骨折断端，持续释放生长因子，使生长因子在3个月内维持较高水平，从而达到促进新骨形成的作用。Kanthan等[18]制作了兔胫骨骨折延迟愈合模型，发现PRP复合人工骨能促进骨修复，而单独使用PRP却不能达到最好效果；Dong等[19]也在新西兰白兔实验模型中证实自体PRP能有效促进组织工程骨愈合过程中血管发生和骨形成，具有潜在临床应用意义。
本研究将PRP与最佳混合比例植骨组（75%自体骨+25%rhBMP-2/PCPC）联合应用，结果表明实验组ALP活性明显高于对照组；在生物力学研究中，术后8、12周实验组最大载荷明显优于对照组，12周时实验组最大载荷明显高于A组（100%自体骨）。表明在PRP促进下，实验组骨强度已超过A组，PRP明显改善了新生骨的力学强度。我们分析原因是PRP可与诱导膜内微血管系统和成骨相关因子发挥协同作用，共同促进移植骨再血管化，诱导成骨细胞增殖，加快骨缺损区骨痂形成和植骨后骨愈合质量，通过增加新骨强度对长骨缺损发挥治疗作用[20]。由于血管生成和血管内皮细胞穿透软骨痂是由促血管生成因子刺激的，PRP可能启动骨折愈合过程，并且PRP中存在或释放的生长因子可能提供了诱导新骨形成的细胞信号，在骨愈合早期阶段起作用[21]。BMP的诱导作用是个级联过程，因此BMP在骨愈合中起主要作用[22-23]。联合BMP和自体PRP治疗骨缺损，在骨愈合的各个时期促进成骨，是目前可提供的最优治疗选择[24-25]。
本研究仍存在一些不足之处。首先，实验动物样本量较少，数据容易产生偏倚，进而影响实验结果；其次，PRP与rhBMP-2/PCPC复合材料及自体骨进行混合，PRP的最佳浓度和使用剂量尚不能明确；最后，rhBMP-2/PCPC复合材料与自体骨混合，需要更长期观察来验证其最佳混合比例。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经西安交通大学医学院动物伦理委员会批准（2019-175-115）；实验动物生产许可证批准号：SCXK（津）2021-0001，使用许可证批准号：SYXK2021-0015
作者贡献声明 丛雨轩：研究设计及实施、文章撰写；张斌飞、付亚辉：研究实施，数据收集；魏星：统计分析；王虎：文献回顾，起草文章；庄岩：对文章的知识性内容作批评性审阅；张堃：行政支持；雷金来：研究设计，经费支持；邓洪利：文献回顾
