引用本文： 詹翼, 周翔, 梁晶, 李旭博, 李雯雯, 杨宇童, 潘福顺, 戚剑. 隐匿型穿支皮瓣动物模型血流动力学的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(1): 46-51. doi: 10.7507/1002-1892.202208081 复制
传统观点认为穿支皮瓣供区无直径≥0.5 mm穿支血管时，应放弃选择该皮瓣[1]。2010年Koshima等提出将直径<0.5 mm的穿支血管称为“毛细血管型穿支”，但毛细血管平均直径为 6～9 μm，故该“毛细血管型穿支”概念值得商榷[2-3]。结合临床吻合直径≤0.3 mm血管时需要使用特殊显微器械及能放大50倍以上的显微镜[4-5]，以及目前CT血管造影只能显示直径≥0.3 mm的穿支血管[6]，我们认为将直径<0.3 mm的穿支血管称为“隐匿型穿支”更准确。
由于“毛细血管型穿支”或“隐匿型穿支”血管细小，为保证成活，以其为蒂制备的穿支皮瓣面积亦较小，如何增加此类型穿支皮瓣的成活面积也成为研究焦点。Koshima等[3]提出在切取毛细血管型胸背动脉穿支皮瓣时，可适当携带部分肌肉，因为肌肉内的毛细血管网与胸背动脉存在交通，为较大皮瓣成活奠定了血供基础。本课题组前期研究了小型猪隐动脉穿支皮瓣的解剖学特点以及动物模型隐匿型穿支皮瓣成活特点[7-8]，本次研究拟采用多普勒超声监测小型猪隐匿型穿支皮瓣血流动力学变化特点，探索通过穿支血管携带肌膜增加毛细血管网来改善皮瓣血供的效果。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器、药物
7月龄普通级广西巴马实验小型猪7只，雌性4只、雄性3只，体质量20～25 kg，由广州明珠生物技术有限公司提供。迈瑞M9多普勒超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），探头类型L10-3s，频率2.7～10.5 MHz；呼吸机（Matrx公司，美国）；Photoshop C5图像处理软件（Adobe公司，美国）。舒泰50（维克公司，法国）；盐酸赛拉嗪（敦化市圣达动物药品有限公司）。
1.2 实验方法
实验分为3组，分别为隐动脉穿支皮瓣组（A组，n=4），隐动脉隐匿型穿支皮瓣组（B组，n=5），隐动脉隐匿型穿支皮瓣+肌膜组（C组，n=5）。
1.2.1 麻醉方法
于7只实验动物颈背部肌肉注射舒泰50（2.5 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（2.2 mg/kg）混悬液进行麻醉诱导。于耳缘静脉置留置针，以备术中输液用。气管内插管，连接呼吸机。呼吸机设置：潮气量10 mg/kg，呼吸频率15次/min，以100%O2和1.5%异氟醚混合气体进行机械通气维持麻醉。
1.2.2 皮瓣设计
在每只实验动物双后肢内侧设计一梯形皮瓣，共制备14侧皮瓣。以大腿内侧根部与髋臼外缘连线为皮瓣上缘，髋臼外缘与前踝中点连线为皮瓣外缘，大腿内侧根部与跟腱止点连线为皮瓣内缘，跟腱止点与前踝中点连线为皮瓣下缘（图1a）。
图1
皮瓣设计及制备示意图
a. 皮瓣设计；b. A组隐动脉穿支皮瓣 黄色箭头示穿支血管；c. B组隐动脉隐匿型穿支皮瓣（隐动脉携带深筋膜）；d. C组隐动脉隐匿型穿支皮瓣+肌膜；e. 显微镜下显示穿支血管 黄色箭头示直径≥0.3 mm穿支血管，黑色箭头示直径<0.3 mm穿支血管；f. 显微镜下结扎直径≥0.3 mm穿支血管；g. 原位缝合皮瓣
Figure1. Schematic diagram of flap design and preparationa. Flap design; b. Saphenous artery perforator flap of group A Yellow arrow indicated the perforator; c. Saphenous artery concealed perforator flap of group B (saphenous artery combined with deep fascia); d. Saphenous artery concealed perforator flap combined with sarcolemma of group C; e. The perforators under microscope Yellow arrow indicated the perforator with diameter ≥0.3 mm, black arrow indicated the perforator with diameter <0.3 mm; f. The perforator with diameter ≥0.3 mm was ligated under microscope; g. The flap after
1.2.3 皮瓣模型制备
沿皮瓣设计线切至深筋膜平面。从隐动脉两侧深筋膜平面下分离筋膜，以隐动脉携血管两侧筋膜，在踝关节水平结扎隐静脉。A组：随机取4侧后肢皮瓣，保留隐动脉所有穿支血管。B组：随机取5侧后肢皮瓣，切断膝关节以下与隐动脉相连的筋膜及所有穿支，仅保留膝关节以上宽约5.5 cm筋膜蒂及穿支血管；显微镜下丝线结扎筋膜内所有直径≥0.3 mm的穿支动、静脉。C组：随机取5侧后肢皮瓣，在B组处理基础上携带部分肌膜。见图1b～g。3组进行上述处理后将皮瓣原位缝合。术中静脉滴注含60万U青霉素的100 mL生理盐水，术后3 d内每12小时颈背部肌肉注射青霉素60万U预防感染。
1.3 观测指标
1.3.1 皮瓣成活观测
术后观察实验动物存活以及皮瓣成活情况。术后5 d皮瓣拍照后，扫描图片并将数据导入Photoshop CS5图像处理软件，计算整块皮瓣像素值（N1），然后描绘坏死区域并计算对应区域像素值（N2）。最后按照以下公式计算皮瓣成活面积百分比，公式：（N1–N2）/N1×100%。
1.3.2 血流动力学观测
于术前及术后即刻、3 d、5 d，采用迈瑞M9多普勒超声诊断仪对实验动物双后肢隐动、静脉进行血流动力学评估。检测条件设置为下肢静脉条件。检测指标：隐动脉包括内径、收缩期峰值流速、阻力指数、血流量，隐静脉包括内径、最大流速、血流量，记录皮瓣血流动力学变化情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料经正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组多时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 皮瓣成活情况
术后1 d 1只实验动物因感染死亡，其余实验动物均存活至实验完成。最终A组3侧、B组4侧、C组5侧后肢皮瓣纳入观测。术后3组皮瓣均出现肿胀，3 d时最显著，且B组皮瓣出现部分瘀紫和坏死；5 d时，A、C组皮瓣基本成活，B组皮瓣坏死面积进一步增大（图2）。术后5 d A、B、C组皮瓣成活面积百分比分别为99.7%±0.5%、74.8%±26.4%、100%，B组低于A、C组，差异有统计学意义（P<0.05），A、C组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
3组皮瓣大体观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 术前；b. 术后即刻；c. 术后3 d；d. 术后5 d
Figure2. Gross observation of flap in 3 groupsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Before operation; b. Immediately after operation; c. At 3 days after operation; d. At 5 days after operation
2.2 血流动力学观测
3组组内各时间点间皮瓣隐动脉的内径、收缩期峰值流速、阻力指数、血流量以及隐静脉的内径、最大流速及血流量差异均有统计学意义（P<0.05）；各时间点组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2及图3。
表1
3组皮瓣隐动脉检测指标比较（
）
Table1.
Comparison of hemodynamic indicators of saphenous artery between groups (
)
表2
3组皮瓣隐静脉检测指标比较（
）
Table2.
Comparison of hemodynamic indicators of saphenous vein between groups (
)
图3
3组皮瓣血流动力学指标变化趋势
a. 隐动脉；b. 隐静脉
Figure3. The change trends of hemodynamic indicators in 3 groupsa. Saphenous artery; b. Saphenous vein
3 讨论
目前常见皮瓣实验动物模型的研究方法有血管造影、临床观察、组织学分析或多普勒超声监测等[7-12]。CT血管造影分辨率高且三维重建后能直观观察血管，但只能提供皮瓣血管分布信息，不能用于实时评估皮瓣血流动力学改变、坏死皮瓣测量，且存在辐射风险、费用高、操作复杂等缺点[8, 11]。MRI血管造影虽然无辐射风险，但操作复杂且费用较高[6]。吲哚氰绿血管造影能进行定性和定量观测，有助于了解不同类型皮瓣血流动力学，但使用和研究缺乏标准化[12]。多普勒超声可了解穿支血管位置、走行、流速和流量，且属于无侵入性操作，近年来常用于皮瓣动物模型血流监测[11, 13-14]。故本次研究选择多普勒超声观察小型猪皮瓣血流动力学变化情况。
传统穿支皮瓣血供来源于穿支血管，但隐匿型穿支皮瓣血供来源于血管网。深筋膜上可见许多细小穿支血管，在深筋膜表面发出3～5个放射状分支形成错综复杂的血管网。在缺乏传统穿支情况下，穿支皮瓣血供可选择这种血管网。本研究结果显示，3组组内不同时间点间皮瓣主干动、静脉血流动力学指标比较差异均有统计学意义，但同时间点组间比较差异无统计学意义；3组间皮瓣成活面积百分比差异有统计学意义，且C组明显大于B组并与A组相似。上述结果提示皮瓣血管蒂处理方式对隐匿型皮瓣成活至关重要，C组将筋膜、肌膜和隐动脉一起切取，可能大大增加了毛细血管网面积，从而改善微循环，使术后皮瓣成活面积百分比提高。
目前，改善皮瓣血供、提高皮瓣成活面积的方法多种多样。刘族安等[15]指出静脉超引流有利于减少皮瓣术后静脉危象，减轻皮瓣水肿和渗出，提高皮瓣成活率。研究表明与静脉超引流相比，动脉增压主要通过促进血管生成和防止缺血-再灌注损伤，更有利于穿支皮瓣成活[16-17]。某些药物和外科延迟术能促进Choke Ⅱ区血管生成、扩张以及改善微循环，促进皮瓣成活[18-21]。柳志锦等[22]报道可以通过穿支血管携带筋膜蒂以改善皮瓣血供。隐匿型穿支皮瓣血供来源于主干血管与深筋膜连接处的微小动脉，这些微小动脉内径小、血流量小，但理论上只要筋膜蒂足够宽、有足够多微动脉和微静脉，仍然可以为皮瓣提供充足血供和静脉回流。
本研究存在一定局限性。首先，与数字血管减影造影和CT血管造影相比，多普勒超声探测血管精度有限。本次使用的多普勒超声机器无法探测直径<0.3 mm的穿支血管。其次，本研究样本量少。第三，未分析多普勒超声监测血流动力学指标与隐匿型皮瓣坏死大小面积的相关性。第四，由于多普勒超声检测动物皮瓣模型时必须先麻醉动物方可进行，无法做到皮瓣模型实时、动态检测。
综上述，多普勒超声血流监测提示两种不同类型设计的隐匿型穿支皮瓣均可获得稳定血流，但隐动脉隐匿型穿支皮瓣联合肌膜类型的皮瓣成活面积显著高于单纯隐动脉隐匿型穿支皮瓣。由于本研究样本量小，该结论仍需进一步研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；项目经费支持没有影响文章观点和研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经中山大学附属第一医院临床科研和实验动物伦理委员会批准（伦审［2022］224号）；实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0061，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2022-0108
作者贡献声明 詹翼、潘福顺、戚剑：实验设计、实施，撰写文章；詹翼、周翔、梁晶、李旭博、李雯雯、杨宇童：动物实验、收集整理及统计分析数据；潘福顺：多普勒超声检测
传统观点认为穿支皮瓣供区无直径≥0.5 mm穿支血管时，应放弃选择该皮瓣[1]。2010年Koshima等提出将直径<0.5 mm的穿支血管称为“毛细血管型穿支”，但毛细血管平均直径为 6～9 μm，故该“毛细血管型穿支”概念值得商榷[2-3]。结合临床吻合直径≤0.3 mm血管时需要使用特殊显微器械及能放大50倍以上的显微镜[4-5]，以及目前CT血管造影只能显示直径≥0.3 mm的穿支血管[6]，我们认为将直径<0.3 mm的穿支血管称为“隐匿型穿支”更准确。
由于“毛细血管型穿支”或“隐匿型穿支”血管细小，为保证成活，以其为蒂制备的穿支皮瓣面积亦较小，如何增加此类型穿支皮瓣的成活面积也成为研究焦点。Koshima等[3]提出在切取毛细血管型胸背动脉穿支皮瓣时，可适当携带部分肌肉，因为肌肉内的毛细血管网与胸背动脉存在交通，为较大皮瓣成活奠定了血供基础。本课题组前期研究了小型猪隐动脉穿支皮瓣的解剖学特点以及动物模型隐匿型穿支皮瓣成活特点[7-8]，本次研究拟采用多普勒超声监测小型猪隐匿型穿支皮瓣血流动力学变化特点，探索通过穿支血管携带肌膜增加毛细血管网来改善皮瓣血供的效果。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要仪器、药物
7月龄普通级广西巴马实验小型猪7只，雌性4只、雄性3只，体质量20～25 kg，由广州明珠生物技术有限公司提供。迈瑞M9多普勒超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），探头类型L10-3s，频率2.7～10.5 MHz；呼吸机（Matrx公司，美国）；Photoshop C5图像处理软件（Adobe公司，美国）。舒泰50（维克公司，法国）；盐酸赛拉嗪（敦化市圣达动物药品有限公司）。
1.2 实验方法
实验分为3组，分别为隐动脉穿支皮瓣组（A组，n=4），隐动脉隐匿型穿支皮瓣组（B组，n=5），隐动脉隐匿型穿支皮瓣+肌膜组（C组，n=5）。
1.2.1 麻醉方法
于7只实验动物颈背部肌肉注射舒泰50（2.5 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（2.2 mg/kg）混悬液进行麻醉诱导。于耳缘静脉置留置针，以备术中输液用。气管内插管，连接呼吸机。呼吸机设置：潮气量10 mg/kg，呼吸频率15次/min，以100%O2和1.5%异氟醚混合气体进行机械通气维持麻醉。
1.2.2 皮瓣设计
在每只实验动物双后肢内侧设计一梯形皮瓣，共制备14侧皮瓣。以大腿内侧根部与髋臼外缘连线为皮瓣上缘，髋臼外缘与前踝中点连线为皮瓣外缘，大腿内侧根部与跟腱止点连线为皮瓣内缘，跟腱止点与前踝中点连线为皮瓣下缘（图1a）。
图1
皮瓣设计及制备示意图
a. 皮瓣设计；b. A组隐动脉穿支皮瓣 黄色箭头示穿支血管；c. B组隐动脉隐匿型穿支皮瓣（隐动脉携带深筋膜）；d. C组隐动脉隐匿型穿支皮瓣+肌膜；e. 显微镜下显示穿支血管 黄色箭头示直径≥0.3 mm穿支血管，黑色箭头示直径<0.3 mm穿支血管；f. 显微镜下结扎直径≥0.3 mm穿支血管；g. 原位缝合皮瓣
Figure1. Schematic diagram of flap design and preparationa. Flap design; b. Saphenous artery perforator flap of group A Yellow arrow indicated the perforator; c. Saphenous artery concealed perforator flap of group B (saphenous artery combined with deep fascia); d. Saphenous artery concealed perforator flap combined with sarcolemma of group C; e. The perforators under microscope Yellow arrow indicated the perforator with diameter ≥0.3 mm, black arrow indicated the perforator with diameter <0.3 mm; f. The perforator with diameter ≥0.3 mm was ligated under microscope; g. The flap after
1.2.3 皮瓣模型制备
沿皮瓣设计线切至深筋膜平面。从隐动脉两侧深筋膜平面下分离筋膜，以隐动脉携血管两侧筋膜，在踝关节水平结扎隐静脉。A组：随机取4侧后肢皮瓣，保留隐动脉所有穿支血管。B组：随机取5侧后肢皮瓣，切断膝关节以下与隐动脉相连的筋膜及所有穿支，仅保留膝关节以上宽约5.5 cm筋膜蒂及穿支血管；显微镜下丝线结扎筋膜内所有直径≥0.3 mm的穿支动、静脉。C组：随机取5侧后肢皮瓣，在B组处理基础上携带部分肌膜。见图1b～g。3组进行上述处理后将皮瓣原位缝合。术中静脉滴注含60万U青霉素的100 mL生理盐水，术后3 d内每12小时颈背部肌肉注射青霉素60万U预防感染。
1.3 观测指标
1.3.1 皮瓣成活观测
术后观察实验动物存活以及皮瓣成活情况。术后5 d皮瓣拍照后，扫描图片并将数据导入Photoshop CS5图像处理软件，计算整块皮瓣像素值（N1），然后描绘坏死区域并计算对应区域像素值（N2）。最后按照以下公式计算皮瓣成活面积百分比，公式：（N1–N2）/N1×100%。
1.3.2 血流动力学观测
于术前及术后即刻、3 d、5 d，采用迈瑞M9多普勒超声诊断仪对实验动物双后肢隐动、静脉进行血流动力学评估。检测条件设置为下肢静脉条件。检测指标：隐动脉包括内径、收缩期峰值流速、阻力指数、血流量，隐静脉包括内径、最大流速、血流量，记录皮瓣血流动力学变化情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料经正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组多时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 皮瓣成活情况
术后1 d 1只实验动物因感染死亡，其余实验动物均存活至实验完成。最终A组3侧、B组4侧、C组5侧后肢皮瓣纳入观测。术后3组皮瓣均出现肿胀，3 d时最显著，且B组皮瓣出现部分瘀紫和坏死；5 d时，A、C组皮瓣基本成活，B组皮瓣坏死面积进一步增大（图2）。术后5 d A、B、C组皮瓣成活面积百分比分别为99.7%±0.5%、74.8%±26.4%、100%，B组低于A、C组，差异有统计学意义（P<0.05），A、C组间差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
3组皮瓣大体观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 术前；b. 术后即刻；c. 术后3 d；d. 术后5 d
Figure2. Gross observation of flap in 3 groupsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Before operation; b. Immediately after operation; c. At 3 days after operation; d. At 5 days after operation
2.2 血流动力学观测
3组组内各时间点间皮瓣隐动脉的内径、收缩期峰值流速、阻力指数、血流量以及隐静脉的内径、最大流速及血流量差异均有统计学意义（P<0.05）；各时间点组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2及图3。
表1
3组皮瓣隐动脉检测指标比较（）
Table1.
Comparison of hemodynamic indicators of saphenous artery between groups ()
表2
3组皮瓣隐静脉检测指标比较（）
Table2.
Comparison of hemodynamic indicators of saphenous vein between groups ()
图3
3组皮瓣血流动力学指标变化趋势
a. 隐动脉；b. 隐静脉
Figure3. The change trends of hemodynamic indicators in 3 groupsa. Saphenous artery; b. Saphenous vein
3 讨论
目前常见皮瓣实验动物模型的研究方法有血管造影、临床观察、组织学分析或多普勒超声监测等[7-12]。CT血管造影分辨率高且三维重建后能直观观察血管，但只能提供皮瓣血管分布信息，不能用于实时评估皮瓣血流动力学改变、坏死皮瓣测量，且存在辐射风险、费用高、操作复杂等缺点[8, 11]。MRI血管造影虽然无辐射风险，但操作复杂且费用较高[6]。吲哚氰绿血管造影能进行定性和定量观测，有助于了解不同类型皮瓣血流动力学，但使用和研究缺乏标准化[12]。多普勒超声可了解穿支血管位置、走行、流速和流量，且属于无侵入性操作，近年来常用于皮瓣动物模型血流监测[11, 13-14]。故本次研究选择多普勒超声观察小型猪皮瓣血流动力学变化情况。
传统穿支皮瓣血供来源于穿支血管，但隐匿型穿支皮瓣血供来源于血管网。深筋膜上可见许多细小穿支血管，在深筋膜表面发出3～5个放射状分支形成错综复杂的血管网。在缺乏传统穿支情况下，穿支皮瓣血供可选择这种血管网。本研究结果显示，3组组内不同时间点间皮瓣主干动、静脉血流动力学指标比较差异均有统计学意义，但同时间点组间比较差异无统计学意义；3组间皮瓣成活面积百分比差异有统计学意义，且C组明显大于B组并与A组相似。上述结果提示皮瓣血管蒂处理方式对隐匿型皮瓣成活至关重要，C组将筋膜、肌膜和隐动脉一起切取，可能大大增加了毛细血管网面积，从而改善微循环，使术后皮瓣成活面积百分比提高。
目前，改善皮瓣血供、提高皮瓣成活面积的方法多种多样。刘族安等[15]指出静脉超引流有利于减少皮瓣术后静脉危象，减轻皮瓣水肿和渗出，提高皮瓣成活率。研究表明与静脉超引流相比，动脉增压主要通过促进血管生成和防止缺血-再灌注损伤，更有利于穿支皮瓣成活[16-17]。某些药物和外科延迟术能促进Choke Ⅱ区血管生成、扩张以及改善微循环，促进皮瓣成活[18-21]。柳志锦等[22]报道可以通过穿支血管携带筋膜蒂以改善皮瓣血供。隐匿型穿支皮瓣血供来源于主干血管与深筋膜连接处的微小动脉，这些微小动脉内径小、血流量小，但理论上只要筋膜蒂足够宽、有足够多微动脉和微静脉，仍然可以为皮瓣提供充足血供和静脉回流。
本研究存在一定局限性。首先，与数字血管减影造影和CT血管造影相比，多普勒超声探测血管精度有限。本次使用的多普勒超声机器无法探测直径<0.3 mm的穿支血管。其次，本研究样本量少。第三，未分析多普勒超声监测血流动力学指标与隐匿型皮瓣坏死大小面积的相关性。第四，由于多普勒超声检测动物皮瓣模型时必须先麻醉动物方可进行，无法做到皮瓣模型实时、动态检测。
综上述，多普勒超声血流监测提示两种不同类型设计的隐匿型穿支皮瓣均可获得稳定血流，但隐动脉隐匿型穿支皮瓣联合肌膜类型的皮瓣成活面积显著高于单纯隐动脉隐匿型穿支皮瓣。由于本研究样本量小，该结论仍需进一步研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；项目经费支持没有影响文章观点和研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经中山大学附属第一医院临床科研和实验动物伦理委员会批准（伦审［2022］224号）；实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0061，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2022-0108
作者贡献声明 詹翼、潘福顺、戚剑：实验设计、实施，撰写文章；詹翼、周翔、梁晶、李旭博、李雯雯、杨宇童：动物实验、收集整理及统计分析数据；潘福顺：多普勒超声检测
