引用本文： 施剑明, 殷明. 人BMSCs成神经分化过程中Wnt/β-catenin信号通路调控作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(10): 1276-1283. doi: 10.7507/1002-1892.202306017 复制
目前，神经细胞移植是中枢神经系统疾病或神经损伤最佳治疗方法，但种子细胞来源问题尚未解决。胚胎干细胞和神经干细胞可分化为成熟神经细胞[1-2]，但因涉及伦理、免疫和分离提取等问题，应用受到一定限制。在特定实验条件下，BMSCs能够克服生殖胚层障碍，从内胚层分化为肝细胞[3]和从外胚层分化为神经细胞[4-5]，在组织工程和基因治疗方面具有广阔应用前景。
研究表明，bFGF和EGF均能诱导BMSCs分化为神经细胞[6-8]，但两者是否具有协同作用及具体作用机制尚未明确。研究发现Wnt/β-catenin信号通路在维持中枢神经系统功能及胚胎干细胞、神经干细胞的成神经分化中发挥重要作用[9-10]，但是否参与人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成神经分化尚不清楚。为此，本研究拟探讨bFGF和/或EGF诱导hBMSCs成神经分化的效果，并在此基础上明确Wnt/β-catenin信号通路在分化过程中的作用，以期为临床应用hBMSCs修复神经缺损提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
第2代hBMSCs（江阴齐氏生物科技有限公司）。α-MEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1；Wnt/β-catenin 通路抑制剂）、bFGF、EGF（Peprotech公司，美国）；GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；HiFi-MMLV cDNA 逆转录试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱生物有限公司）；NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo Scientific公司，美国）；DyLight 488-SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗神经元特异性烯醇化酶 （neuron-specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β-catenin一抗（Proteintech公司，美国）；鼠抗β肌动蛋白（β-actin）一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗、DAPI（Sigma-Aldrich公司，美国）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（Jackson公司，美国）；兔抗磷酸化β-catenin（phosphorylation β-catenin，P-β-catenin；Ser33/37/Thr41）、β-微管蛋白（β-tubulin）一抗（CST公司，美国）。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
TS100-F倒置荧光相差显微镜（Nikon公司，日本）；BIO-BEST200E凝胶成像系统、恒温细胞培养箱（SIM公司，美国）；PCR基因扩增仪（西安天隆科技有限公司）。
1.2 实验分组及方法
将第2代hBMSCs复苏后进行传代培养，取第4代经鉴定的hBMSCs[11]接种于6孔板，每孔1×104个细胞。根据不同诱导条件分为对照组（A组）、EGF诱导组（B组）、bFGF诱导组（C组）、EGF+bFGF诱导组（D组）以及EGF+bFGF+DKK-1诱导组（E组）。其中，A组采用正常诱导培养基（含1% FBS的α-MEM培养基）；B～E组在正常诱导培养基中分别加入20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF，以及20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+100 ng/mLDKK-1。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中贴壁培养，每2天换液1次，诱导培养7 d后取各组细胞行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 细胞形态观察
倒置荧光相差显微镜下观察各组细胞形态变化。
1.3.2 RT-PCR检测
采用RT-PCR检测神经干细胞标志巢蛋白（Nestin）、神经细胞标志NSE和微管相关蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2）、神经胶质细胞标志GFAP，以及Wnt/β-catenin信号通路关键组件β-catenin和Cyclin D1基因表达变化。取各组细胞采用GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒提取总RNA，并通过HiFi-MMLV cDNA 逆转录试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒将RNA逆转录成cDNA，进行PCR扩增反应。反应条件：94℃预变性1.5 min；94℃变性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min（重复28～36个循坏）；72℃延伸5 min。扩增后产物经1.0%琼脂糖凝胶100 V恒压电泳20～40 min，置于凝胶成像系统拍照，Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度值分析，以目的基因与内参基因（β-actin）的灰度比值作为目的基因相对表达量。引物序列、产物大小及反应条件见表1。实验重复3次。
表1
RT-PCR引物序列和反应条件
Table1.
Primer sequence and reaction conditions of RT-PCR
1.3.3 细胞免疫荧光染色观察
采用细胞免疫荧光染色观察神经细胞标志蛋白（NSE、GFAP）表达变化。将各组细胞依次以4%多聚甲醛溶液固定30 min、0.3% TritonX-100通透细胞膜10 min、PBS洗涤3次后，10%正常山羊血清室温封闭20 min；添加兔抗NSE、GFAP一抗（均以1∶50稀释）于4℃孵育过夜，然后更换生物素标记山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀释）室温孵育2 h，DyLight 488-SABC以缓冲液1∶200稀释室温孵育30 min后，加入DAPI染细胞核。倒置荧光相差显微镜下观察，并随机选择10个非重叠视野，分别计算NSE、GFAP表达阳性细胞比例（阳性率）。实验重复3次。
1.3.4 Western blot检测
采用Western blot检测神经细胞（NSE、GFAP）及Wnt/β-catenin信号通路关键组件 ［β-catenin、P-β-catenin、细胞胞质β-catenin（Cytoplasmic β-catenin）及细胞核内β-catenin（Nuclear β-catenin）］ 蛋白水平表达变化。采用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白、采用NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒提取细胞质蛋白及核蛋白，并通过BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度，每孔蛋白上样30 μg后进行SDS-PAGE凝胶电泳。5%脱脂牛奶封闭2 h后一抗（稀释比例：兔抗NSE 1∶500、兔抗GFAP 1∶100、兔抗β-catenin 1∶2 000、兔抗P-β-catenin 1∶500、小鼠抗β-actin 1∶5 000、兔抗β-tubulin 1∶500）4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗工作液（山羊抗兔1∶10 000、山羊抗小鼠1∶5 000）室温孵育2 h后曝光，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析，以目的蛋白和对应内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。同时计算β-catenin核质比（Nuclear β-catenin/Cytoplasmic β-catenin）。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态观察
诱导培养7 d后A、B组细胞仍为长梭形，呈漩涡状排列；C～E组部分细胞胞体变小、呈双极和复杂多极，折光性增强，逐渐向四周伸出突起且与相邻细胞突触连接，提示hBMSCs分化成典型神经样细胞形态；D组细胞上述变化较C、E组更明显。见图1。
图1
诱导培养7 d倒置荧光相差显微镜观察
a～e. A～E组细胞形态（×200）；f. D组细胞间可见突触连接（箭头）（×400）
Figure1. Cell morphology observation by inverted fluorescence phase contrast microscopy after 7 days of induced culturea-e. Cell morphology of groups A-E, respectively (×200); f. Synaptic connections (arrow) were clearly visible between neural-like cells in group D (×400)
2.2 RT-PCR检测
2.2.1 神经细胞相关基因
与A组比较，C～E组Nestin、NSE、MAP-2，D、E组GFAP及B组NSE基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与C组比较，D组NSE、MAP-2、GFAP基因相对表达量升高，Nestin基因相对表达量下降；与E组比较，D组Nestin、NSE、MAP-2、GFAP基因相对表达量均升高；差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2a～d。
图2
RT-PCR检测各组神经细胞以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达
a. Nestin；b. NSE；c. MAP-2；d. GFAP；e. β-catenin；f. Cyclin D1
Figure2. Expressions of genes related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway in each group by RT-PCRa. Nestin; b. NSE; c. MAP-2; d. GFAP; e. β-catenin; f. Cyclin D1
2.2.2 Wnt/β-catenin信号通路相关基因
与A组比较，C、D组β-catenin以及B~D组Cyclin D1基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与E组比较，D组β-catenin、Cyclin D1基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2e、f。
2.3 细胞免疫荧光染色观察
倒置荧光相差显微镜观察示，C～E组均有部分细胞发出绿色荧光信号。与A组比较，C～E组NSE、GFAP阳性率均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；D组两指标均高于C、E组，差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
各组细胞免疫荧光染色观察
a. NSE免疫荧光染色（倒置荧光相差显微镜×200） 从左至右分别为A～E组，从上至下分别为NSE染色、DAPI染色以及两者重叠；b. NSE阳性率；c. GFAP免疫荧光染色（倒置荧光相差显微镜×200） 从左至右分别为A～E组，从上至下分别为GFAP染色、DAPI染色以及两者重叠；d. GFAP阳性率
Figure3. Observation of cellular immunofluorescence staining for each groupa. NSE immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for NSE staining, DAPI staining, and merge of NSE and DAPI staining, respectively; b. Ratio of NSE-positive cells; c. GFAP immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for GFAP staining, DAPI staining, and merge of GFAP and DAPI staining, respectively; d. Ratio of GFAP-positive cells
2.4 Western blot检测
2.4.1 神经细胞标志蛋白
与A组比较，C、D组NSE蛋白及C～E组GFAP蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与C组比较，D组NSE蛋白相对表达量升高；与E组比较，D组NSE、GFAP蛋白相对表达量均升高；差异有统计学意义（P<0.05）。见图4a、b。
图4
Western blot检测各组神经细胞标志蛋白以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达
1～5：A～E组 a、b. 神经细胞标志蛋白电泳图及相对表达量；c、d. Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白电泳图及相对表达量
Figure4. Expressions of proteins related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway detected by Western blot1-5: Groups A-E a, b. Electropherogram and relative expressions for proteins related to neural cells; c, d. Electropherogram and relative expressions for proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway
2.4.2 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白
与A组比较，C、D组β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相对表达量以及β-catenin核质比均升高，P-β-catenin蛋白相对表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。与E组比较，D组β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相对表达量以及β-catenin核质比均升高，P-β-catenin蛋白相对表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4c、d。
3 讨论
创伤性神经损伤、中风和许多神经系统疾病多伴随神经细胞丢失或功能丧失。虽然研究已证实神经干细胞的存在，但由于其迁移性差及自我更新和分化能力低，使得受损神经组织自我恢复能力非常有限。因此，干细胞疗法被认为是治疗神经退行性疾病和神经损伤的有效方法[12]。研究表明，BMSCs可以在体内外分化为神经样细胞，因此BMSCs成神经分化条件及其机制研究备受关注。
作为重要的有丝分裂和神经营养因子，bFGF和EGF在促进神经干细胞自我更新、调控神经干细胞分化和多能干细胞神经样细胞分化中起重要作用[13-14]。因此，众多学者利用bFGF和/或EGF刺激多能干细胞向神经样细胞分化[8, 13, 15]。本研究发现与A组比较，C、D组神经细胞标志基因均升高（C组GFAP除外），B组则无明显变化（除NSE轻度升高外）；与C组比较，D组神经干细胞标志基因Nestin表达下调，神经细胞标志基因NSE、MAP-2和神经胶质细胞标志基因GFAP表达上调。提示bFGF可单独诱导hBMSCs成神经细胞分化，而EGF无此作用，但EGF可增强bFGF诱导hBMSCs成神经细胞分化表型。这可能是因为bFGF促进神经干细胞自我更新[16]和分化[17]，主要用于诱导多能干细胞向神经细胞分化。而EGF主要用于促进神经前体细胞分化及轴突生长[18]，且这一过程中EGF通过与神经前体细胞中的EGF响应元件EGFR结合而发挥作用。有研究发现， BMSCs被诱导成神经细胞分化后EGFR表达水平显著增加，且bFGF的存在也可促进EGF与EGFR的结合[19]。这一定程度上解释了我们研究发现EGF不具备单独诱导hBMSCs向神经细胞分化，但可协同增强bFGF诱导hBMSCs向神经细胞分化。虽然如此，bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs向神经细胞分化的具体作用机制仍有待进一步研究。
研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在BMSCs增殖、衰老及分化中发挥着重要作用[20-21]。此外，该通路还参与调控神经发育多个方面，如神经导管形成、神经干细胞增殖及分化、轴突及树突的发生和突触间连接的建立[22-23]。β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路中起着至关重要作用。在缺乏Wnt信号情况下，游离细胞质β-catenin被磷酸化，然后被泛素-蛋白酶体系统降解。在Wnt信号存在情况下，未磷酸化的β-catenin在细胞质中积累并易位到细胞核中，促进多种靶基因（如C-myc和Cyclin D1）的转录[24]。为了明确Wnt/β-catenin信号通路与hBMSCs成神经分化之间的关系，我们通过RT-PCR和Western blot检测了β-catenin 基因和蛋白的表达。结果表明，与A组比较，C、D组细胞质和细胞核中β-catenin的表达均增加，且细胞核与细胞质表达比值升高，支持了Wnt/β-catenin信号通路激活介导bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs向神经细胞分化的假设。与A组比较，D、E组神经标志基因及蛋白表达均升高，且D组高于E组，提示对Wnt/β-catenin信号通路通过特异性阻滞剂DKK-1进行阻滞后，bFGF联合EGF诱导hBMSCs成神经分化作用削弱但不完全抑制，提示除Wnt/β-catenin信号通路外，可能存在其他信号通路参与bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs成神经分化，这有待进一步研究。
综上述，bFGF可诱导hBMSCs向神经细胞分化，EGF则不能，但EGF能够增强bFGF诱导作用；Wnt/β-catenin信号通路在这一过程发挥正向调控作用。本研究结果为hBMSCs运用于临床神经退行性疾病治疗和神经损伤修复提供了新靶点。
利益冲突 在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突
作者贡献声明 施剑明：研究设计及实验，数据收集及统计分析，论文撰写；殷明：研究设计并对文章的知识性内容进行批评性审阅
目前，神经细胞移植是中枢神经系统疾病或神经损伤最佳治疗方法，但种子细胞来源问题尚未解决。胚胎干细胞和神经干细胞可分化为成熟神经细胞[1-2]，但因涉及伦理、免疫和分离提取等问题，应用受到一定限制。在特定实验条件下，BMSCs能够克服生殖胚层障碍，从内胚层分化为肝细胞[3]和从外胚层分化为神经细胞[4-5]，在组织工程和基因治疗方面具有广阔应用前景。
研究表明，bFGF和EGF均能诱导BMSCs分化为神经细胞[6-8]，但两者是否具有协同作用及具体作用机制尚未明确。研究发现Wnt/β-catenin信号通路在维持中枢神经系统功能及胚胎干细胞、神经干细胞的成神经分化中发挥重要作用[9-10]，但是否参与人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成神经分化尚不清楚。为此，本研究拟探讨bFGF和/或EGF诱导hBMSCs成神经分化的效果，并在此基础上明确Wnt/β-catenin信号通路在分化过程中的作用，以期为临床应用hBMSCs修复神经缺损提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
第2代hBMSCs（江阴齐氏生物科技有限公司）。α-MEM培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1；Wnt/β-catenin 通路抑制剂）、bFGF、EGF（Peprotech公司，美国）；GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；HiFi-MMLV cDNA 逆转录试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱生物有限公司）；NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo Scientific公司，美国）；DyLight 488-SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗神经元特异性烯醇化酶 （neuron-specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β-catenin一抗（Proteintech公司，美国）；鼠抗β肌动蛋白（β-actin）一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗、DAPI（Sigma-Aldrich公司，美国）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（Jackson公司，美国）；兔抗磷酸化β-catenin（phosphorylation β-catenin，P-β-catenin；Ser33/37/Thr41）、β-微管蛋白（β-tubulin）一抗（CST公司，美国）。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
TS100-F倒置荧光相差显微镜（Nikon公司，日本）；BIO-BEST200E凝胶成像系统、恒温细胞培养箱（SIM公司，美国）；PCR基因扩增仪（西安天隆科技有限公司）。
1.2 实验分组及方法
将第2代hBMSCs复苏后进行传代培养，取第4代经鉴定的hBMSCs[11]接种于6孔板，每孔1×104个细胞。根据不同诱导条件分为对照组（A组）、EGF诱导组（B组）、bFGF诱导组（C组）、EGF+bFGF诱导组（D组）以及EGF+bFGF+DKK-1诱导组（E组）。其中，A组采用正常诱导培养基（含1% FBS的α-MEM培养基）；B～E组在正常诱导培养基中分别加入20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF，以及20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+100 ng/mLDKK-1。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中贴壁培养，每2天换液1次，诱导培养7 d后取各组细胞行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 细胞形态观察
倒置荧光相差显微镜下观察各组细胞形态变化。
1.3.2 RT-PCR检测
采用RT-PCR检测神经干细胞标志巢蛋白（Nestin）、神经细胞标志NSE和微管相关蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2）、神经胶质细胞标志GFAP，以及Wnt/β-catenin信号通路关键组件β-catenin和Cyclin D1基因表达变化。取各组细胞采用GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒提取总RNA，并通过HiFi-MMLV cDNA 逆转录试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒将RNA逆转录成cDNA，进行PCR扩增反应。反应条件：94℃预变性1.5 min；94℃变性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min（重复28～36个循坏）；72℃延伸5 min。扩增后产物经1.0%琼脂糖凝胶100 V恒压电泳20～40 min，置于凝胶成像系统拍照，Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度值分析，以目的基因与内参基因（β-actin）的灰度比值作为目的基因相对表达量。引物序列、产物大小及反应条件见表1。实验重复3次。
表1
RT-PCR引物序列和反应条件
Table1.
Primer sequence and reaction conditions of RT-PCR
1.3.3 细胞免疫荧光染色观察
采用细胞免疫荧光染色观察神经细胞标志蛋白（NSE、GFAP）表达变化。将各组细胞依次以4%多聚甲醛溶液固定30 min、0.3% TritonX-100通透细胞膜10 min、PBS洗涤3次后，10%正常山羊血清室温封闭20 min；添加兔抗NSE、GFAP一抗（均以1∶50稀释）于4℃孵育过夜，然后更换生物素标记山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀释）室温孵育2 h，DyLight 488-SABC以缓冲液1∶200稀释室温孵育30 min后，加入DAPI染细胞核。倒置荧光相差显微镜下观察，并随机选择10个非重叠视野，分别计算NSE、GFAP表达阳性细胞比例（阳性率）。实验重复3次。
1.3.4 Western blot检测
采用Western blot检测神经细胞（NSE、GFAP）及Wnt/β-catenin信号通路关键组件 ［β-catenin、P-β-catenin、细胞胞质β-catenin（Cytoplasmic β-catenin）及细胞核内β-catenin（Nuclear β-catenin）］ 蛋白水平表达变化。采用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白、采用NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒提取细胞质蛋白及核蛋白，并通过BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度，每孔蛋白上样30 μg后进行SDS-PAGE凝胶电泳。5%脱脂牛奶封闭2 h后一抗（稀释比例：兔抗NSE 1∶500、兔抗GFAP 1∶100、兔抗β-catenin 1∶2 000、兔抗P-β-catenin 1∶500、小鼠抗β-actin 1∶5 000、兔抗β-tubulin 1∶500）4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗工作液（山羊抗兔1∶10 000、山羊抗小鼠1∶5 000）室温孵育2 h后曝光，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析，以目的蛋白和对应内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。同时计算β-catenin核质比（Nuclear β-catenin/Cytoplasmic β-catenin）。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态观察
诱导培养7 d后A、B组细胞仍为长梭形，呈漩涡状排列；C～E组部分细胞胞体变小、呈双极和复杂多极，折光性增强，逐渐向四周伸出突起且与相邻细胞突触连接，提示hBMSCs分化成典型神经样细胞形态；D组细胞上述变化较C、E组更明显。见图1。
图1
诱导培养7 d倒置荧光相差显微镜观察
a～e. A～E组细胞形态（×200）；f. D组细胞间可见突触连接（箭头）（×400）
Figure1. Cell morphology observation by inverted fluorescence phase contrast microscopy after 7 days of induced culturea-e. Cell morphology of groups A-E, respectively (×200); f. Synaptic connections (arrow) were clearly visible between neural-like cells in group D (×400)
2.2 RT-PCR检测
2.2.1 神经细胞相关基因
与A组比较，C～E组Nestin、NSE、MAP-2，D、E组GFAP及B组NSE基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与C组比较，D组NSE、MAP-2、GFAP基因相对表达量升高，Nestin基因相对表达量下降；与E组比较，D组Nestin、NSE、MAP-2、GFAP基因相对表达量均升高；差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2a～d。
图2
RT-PCR检测各组神经细胞以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达
a. Nestin；b. NSE；c. MAP-2；d. GFAP；e. β-catenin；f. Cyclin D1
Figure2. Expressions of genes related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway in each group by RT-PCRa. Nestin; b. NSE; c. MAP-2; d. GFAP; e. β-catenin; f. Cyclin D1
2.2.2 Wnt/β-catenin信号通路相关基因
与A组比较，C、D组β-catenin以及B~D组Cyclin D1基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与E组比较，D组β-catenin、Cyclin D1基因相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2e、f。
2.3 细胞免疫荧光染色观察
倒置荧光相差显微镜观察示，C～E组均有部分细胞发出绿色荧光信号。与A组比较，C～E组NSE、GFAP阳性率均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；D组两指标均高于C、E组，差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
各组细胞免疫荧光染色观察
a. NSE免疫荧光染色（倒置荧光相差显微镜×200） 从左至右分别为A～E组，从上至下分别为NSE染色、DAPI染色以及两者重叠；b. NSE阳性率；c. GFAP免疫荧光染色（倒置荧光相差显微镜×200） 从左至右分别为A～E组，从上至下分别为GFAP染色、DAPI染色以及两者重叠；d. GFAP阳性率
Figure3. Observation of cellular immunofluorescence staining for each groupa. NSE immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for NSE staining, DAPI staining, and merge of NSE and DAPI staining, respectively; b. Ratio of NSE-positive cells; c. GFAP immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for GFAP staining, DAPI staining, and merge of GFAP and DAPI staining, respectively; d. Ratio of GFAP-positive cells
2.4 Western blot检测
2.4.1 神经细胞标志蛋白
与A组比较，C、D组NSE蛋白及C～E组GFAP蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与C组比较，D组NSE蛋白相对表达量升高；与E组比较，D组NSE、GFAP蛋白相对表达量均升高；差异有统计学意义（P<0.05）。见图4a、b。
图4
Western blot检测各组神经细胞标志蛋白以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达
1～5：A～E组 a、b. 神经细胞标志蛋白电泳图及相对表达量；c、d. Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白电泳图及相对表达量
Figure4. Expressions of proteins related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway detected by Western blot1-5: Groups A-E a, b. Electropherogram and relative expressions for proteins related to neural cells; c, d. Electropherogram and relative expressions for proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway
2.4.2 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白
与A组比较，C、D组β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相对表达量以及β-catenin核质比均升高，P-β-catenin蛋白相对表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。与E组比较，D组β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相对表达量以及β-catenin核质比均升高，P-β-catenin蛋白相对表达量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4c、d。
3 讨论
创伤性神经损伤、中风和许多神经系统疾病多伴随神经细胞丢失或功能丧失。虽然研究已证实神经干细胞的存在，但由于其迁移性差及自我更新和分化能力低，使得受损神经组织自我恢复能力非常有限。因此，干细胞疗法被认为是治疗神经退行性疾病和神经损伤的有效方法[12]。研究表明，BMSCs可以在体内外分化为神经样细胞，因此BMSCs成神经分化条件及其机制研究备受关注。
作为重要的有丝分裂和神经营养因子，bFGF和EGF在促进神经干细胞自我更新、调控神经干细胞分化和多能干细胞神经样细胞分化中起重要作用[13-14]。因此，众多学者利用bFGF和/或EGF刺激多能干细胞向神经样细胞分化[8, 13, 15]。本研究发现与A组比较，C、D组神经细胞标志基因均升高（C组GFAP除外），B组则无明显变化（除NSE轻度升高外）；与C组比较，D组神经干细胞标志基因Nestin表达下调，神经细胞标志基因NSE、MAP-2和神经胶质细胞标志基因GFAP表达上调。提示bFGF可单独诱导hBMSCs成神经细胞分化，而EGF无此作用，但EGF可增强bFGF诱导hBMSCs成神经细胞分化表型。这可能是因为bFGF促进神经干细胞自我更新[16]和分化[17]，主要用于诱导多能干细胞向神经细胞分化。而EGF主要用于促进神经前体细胞分化及轴突生长[18]，且这一过程中EGF通过与神经前体细胞中的EGF响应元件EGFR结合而发挥作用。有研究发现， BMSCs被诱导成神经细胞分化后EGFR表达水平显著增加，且bFGF的存在也可促进EGF与EGFR的结合[19]。这一定程度上解释了我们研究发现EGF不具备单独诱导hBMSCs向神经细胞分化，但可协同增强bFGF诱导hBMSCs向神经细胞分化。虽然如此，bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs向神经细胞分化的具体作用机制仍有待进一步研究。
研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在BMSCs增殖、衰老及分化中发挥着重要作用[20-21]。此外，该通路还参与调控神经发育多个方面，如神经导管形成、神经干细胞增殖及分化、轴突及树突的发生和突触间连接的建立[22-23]。β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路中起着至关重要作用。在缺乏Wnt信号情况下，游离细胞质β-catenin被磷酸化，然后被泛素-蛋白酶体系统降解。在Wnt信号存在情况下，未磷酸化的β-catenin在细胞质中积累并易位到细胞核中，促进多种靶基因（如C-myc和Cyclin D1）的转录[24]。为了明确Wnt/β-catenin信号通路与hBMSCs成神经分化之间的关系，我们通过RT-PCR和Western blot检测了β-catenin 基因和蛋白的表达。结果表明，与A组比较，C、D组细胞质和细胞核中β-catenin的表达均增加，且细胞核与细胞质表达比值升高，支持了Wnt/β-catenin信号通路激活介导bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs向神经细胞分化的假设。与A组比较，D、E组神经标志基因及蛋白表达均升高，且D组高于E组，提示对Wnt/β-catenin信号通路通过特异性阻滞剂DKK-1进行阻滞后，bFGF联合EGF诱导hBMSCs成神经分化作用削弱但不完全抑制，提示除Wnt/β-catenin信号通路外，可能存在其他信号通路参与bFGF单独或联合EGF诱导hBMSCs成神经分化，这有待进一步研究。
综上述，bFGF可诱导hBMSCs向神经细胞分化，EGF则不能，但EGF能够增强bFGF诱导作用；Wnt/β-catenin信号通路在这一过程发挥正向调控作用。本研究结果为hBMSCs运用于临床神经退行性疾病治疗和神经损伤修复提供了新靶点。
利益冲突 在课题研究及文章撰写过程中不存在利益冲突
作者贡献声明 施剑明：研究设计及实验，数据收集及统计分析，论文撰写；殷明：研究设计并对文章的知识性内容进行批评性审阅
