引用本文： 熊伟, 袁灵梅, 王梁霞, 钱国文, 梁超轶, 潘斌, 郭灵, 魏文强, 邱勋祥, 邓文芳, 曾志奎. 黄连素-柚皮苷双重载药复合微球的制备及其抗菌-成骨性能评估研究. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(12): 1505-1513. doi: 10.7507/1002-1892.202308054 复制
骨感染导致的大段骨缺损是临床治疗难题，采用生物材料修复是极具发展前景的治疗策略。然而，植入材料通常缺乏抗菌能力，植入人体后易发生细菌感染，而且大多缺乏生物活性，成骨效能欠佳，难以与宿主骨良好融合，最终导致骨修复失败[1-4]。为避免材料植入后发生感染，临床常联合全身应用抗生素方法，但存在因损伤部位局部血运不佳，难以达到有效杀菌浓度[5-7]，以及高浓度药物不但具有严重毒副作用，还可能导致细菌耐药，增加感染控制难度[8-10]等问题。因此，研发一种在修复骨缺损同时能有效杀死细菌、抑制感染的骨植入材料具有重要临床意义。
载药纳米微球在克服现有感染性骨缺损修复方式缺点方面表现出巨大潜力[11-14]。介孔生物玻璃微球（mesoporous bioactive glasses，MBG）是骨组织工程研究常用的可降解载药微球，具有高比表面积、介孔结构和良好生物相容性优点[15-17]，将药物吸附于微球表面与介孔结构中，可实现缓慢释放。聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂层易于合成且具有优异生物相容性及降解性能，用其对MBG进行表面改性后，通过在PDA涂层与微球中吸附离子或药物，可构建具有多重功能的复合微球[18-20]。
黄连素（berberine，BBR）是中药黄连的一种天然单体化合物，具有广谱、强效抗菌功能[21-23]。柚皮苷（naringin，NG）是补肾壮骨中药骨碎补的主要活性单体，能有效调节骨代谢、促进骨损伤修复，以及能诱导BMSCs向成骨分化[24-27]。基于上述既往研究结果，本课题组设计了一种BBR-NG双重载药复合微球（NG-MBG@PDA-BBR），首先将促成骨药物NG负载于MBG，然后将抗菌药物BBR混合于PDA后对载药的MBG进行表面改性，以期通过缓慢释放上述两种中药活性成分，实现抗菌和促成骨双重目的，为临床治疗感染性骨缺损提供一种新材料。本次研究旨在测试该复合微球中NG和BBR的负载与释放行为，评估其体外抗菌性能、细胞相容性及成骨性能，为下一步体内研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
乙醇、氨水（广州化学试剂厂）；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、正硅酸盐四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、四水硝酸钙（calcium nitrate tetrahydrate，CN）、PDA、BBR、NG（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠BMSCs、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（江西理工大学实验室保存）；FBS、青霉素和链霉素（广州赛业生物科技有限公司）；ALP染色试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、活/死细胞染色试剂盒（武汉亚科因生物技术有限公司）；DMEM培养基、茜素红染色液、胰蛋白酶、PBS缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司）。
X射线衍射仪（Bruker公司，德国）；傅里叶红外光谱仪（Thermoelectrics公司，美国）；比表面积及孔容分析仪（Micromeritics公司，美国）；全自动定量绘图酶标仪（Thermo Scientific公司，美国）；JEM-F200透射电镜（JEOL公司，日本）；EVO18扫描电镜（ZEISS公司，德国）；荧光倒置显微镜（Olympus公司，日本）；Image J软件（美国国立卫生研究院）；CHT210R高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。
1.2 NG-MBG@PDA-BBR的制备
1.2.1 MBG制备
首先取1.5 mL浓氨水、25 mL无水乙醇和50 mL去离子水制备混合溶液，然后加入0.5 g CTAB于35℃剧烈搅拌，待CTAB溶解后每间隔30 min依次加入2 mL TEOS与0.9 g CN，继续搅拌24 h后，以离心半径15 cm、10 000 r/min 离心10 min。 收集白色沉淀物，无水乙醇洗涤3次后超声分散在200 mL去离子水中，转移至高压釜中，于120℃条件下保存12 h。取出样品待自然冷却至室温后，同上法离心后收集白色沉淀物；去离子水洗涤3次，再次同上法离心后收集白色沉淀物，并转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48 h后，转移至坩埚中在马弗炉内煅烧，升温速度设置为5℃/min，至550℃后维持温度6 h，自然冷却至常温，将样品研磨成细粉末即获得MBG微球。
1.2.2 NG-MBG制备
称取30 mg NG与100 mg MBG，依次加入100 mL去离子水中，超声分散后将溶液在室温下搅拌24 h。收集溶液转移至离心管中，同上法离心后收集底层沉淀物，于50℃干燥箱内烘干12 h后，获得NG-MBG微球。
1.2.3 MBG@PDA制备
称取500 mg PDA与500 mg MBG，加入100 mL去离子水，室温下磁力搅拌1 h后添加NaOH调节溶液pH值至10左右，继续搅拌24 h，收集溶液转移至离心管中，同上法离心后收集沉淀物，去离子水与乙醇各冲洗3次，干燥后获得MBG@PDA微球。
1.2.4 NG-MBG@PDA制备
称取500 mg PDA与500 mg NG-MBG，同1.2.3 MBG@PDA制备方法，获得NG-MBG@PDA微球。
1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制备
称取500 mg PDA、500 mg NG-MBG和200 mg BBR，同1.2.3 MBG@PDA制备方法，获得复合微球NG-MBG@PDA-BBR。见图1。
图1
NG-MBG@PDA-BBR制备流程示意图
Figure1.
Schematic of NG-MBG@PDA-BBR preparation
1.3 观测指标
1.3.1 微球理化性能表征
① 采用扫描电镜观察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR样品表面形貌和结构。② 比表面积及孔容分析仪测定MBG比表面积。③ X射线衍射仪测定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR化学组成；同时采用小角度X射线衍射观察MBG和NG-MBG，分析NG是否成功负载于MBG介孔结构。④ 傅里叶红外光谱仪测定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR分子化学键的吸收峰。
1.3.2 复合微球药物载药率及释放量
① NG载药率测定：称取5、10、15、20、25、30 mg NG，分别置于100 mL烧杯，加入去离子水溶解并定容至100 mL，NG溶液理论浓度分别为50、100、150、200、250、300 μg/mL。用移液枪分别取上述不同浓度的NG溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶标仪测定283 nm吸收波长处各组溶液吸光度（A）值，计算并绘制NG标准浓度曲线。取1.2.2 NG-MBG制备步骤离心后上清液，同上法测定A值，根据NG标准浓度曲线计算NG剩余量（M1）；同时收集离心沉淀物，用去离子水与乙醇超声各冲洗3次，干燥后称取粉末质量（M2），根据以下公式计算NG载药率： NG载药率=（30−M1）/［100+（30−M2）］×100%。实验重复测量3次。
② BBR载药率测定：称取2、4、6、8、10、12 mg BBR，分别置于100 mL烧杯中，加入去离子水溶解并定容至100 mL，BBR溶液理论浓度分别为20、40、60、80、100、120 μg/mL。用移液枪分别取上述不同浓度的BBR溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶标仪测定346 nm吸收波长处各组溶液A值，计算并绘制BBR标准浓度曲线。取1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制备步骤离心后的上清液，测量346 nm吸收波长处A值，根据BBR标准曲线计算BBR剩余量（M3）；同时收集离心沉淀物，用去离子水与乙醇超声各冲洗3次，干燥后称取粉末质量（M4），根据以下公式计算BBR负载率：BBR载药率=（200−M3）/M4×100%。实验重复测量3次。
③ NG与BBR释放量测定：将10 mg NG-MBG@PDA-BBR浸入10 mL去离子水中，每天更换去离子水，持续14 d。将每天获得的浸泡液以离心半径15 cm、10 000 r/min 离心5 min后，收集上清液，采用酶标仪分别在283、346 nm吸收波长处测量A值，根据NG、BBR标准浓度曲线计算NG、BBR释放量。实验重复测量3次。
1.3.3 复合微球抗菌性能评价
实验分为4组，分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组取对应微球样品与去离子水按照一定比例（样品∶去离子水=10 mg∶1 mL）混合后静置24 h，吸取样品溶液置于96孔板，每孔100 μL，每组3孔；空白对照组添加相同体积去离子水。各孔中分别添加10 μL金黄色葡萄球菌与大肠杆菌细菌悬液（浓度为1×106 CFU/mL），于37℃恒温培养箱中孵育24 h后，各组取50 μL细菌悬液稀释10 000倍配置为工作液后，接种于营养琼脂板；于37℃恒温培养箱中继续孵育12 h后，用Image J软件计数菌落，根据以下公式计算抑菌率：抑菌率=（菌落数空白对照组−菌落数其他实验组）/菌落数空白对照组×100%。实验重复测量3次。
1.3.4 复合微球生物相容性评价
实验分组方法同1.3.3。采用CCK-8法与活/死细胞荧光染色法测定样品对大鼠BMSCs增殖的影响。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组样品紫外光照射24 h灭菌后，与细胞培养基（含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基）混合（样品∶培养基=10 mg∶1 mL），置于 37 ℃、5%CO2培养箱中24 h，获得各样品浸提液。
将大鼠BMSCs接种于96孔板，每孔3×103个；空白对照组添加150 μL细胞培养基，其余各组添加等体积样品浸提液。于37℃、5%CO2培养箱中培养24、72 h后，各组分别取5孔参照试剂盒说明书行CCK-8检测与活/死细胞荧光染色观察。其中，CCK-8检测以450 nm吸收波长处A值表示细胞活性。活/死细胞荧光染色后于荧光倒置显微镜下观察染色结果，以绿色荧光为活细胞、红色荧光为死细胞。
1.3.5 复合微球促成骨性能评价
实验分组方法同1.3.3。将大鼠BMSCs接种于6孔板，每孔3×104个；空白对照组加入3 mL细胞培养基，其余各组添加等体积1.3.4中制备的样品浸提液。于37℃、5%CO2培养箱中培养7、14 d后，各组分别取3孔，吸弃培养基，多聚甲醛固定1 h，PBS溶液冲洗；室温下ALP染色（培养7 d）与茜素红染色（培养14 d）24 h后，光镜下观察染色结果，随机取5个视野以Image J软件对ALP阳性面积和钙结节数量进行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示；组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 微球理化性能表征
2.1.1 扫描电镜观察
MBG呈粒径分布均匀的球形结构，表面光滑且各微球集聚成团；MBG@PDA为球状黏附沉积物；NG-MBG@PDA与MBG@PDA形貌相似，呈现为聚合的球状沉积物，PDA涂层均匀分布在微球表面，将各微球紧密聚合；NG-MBG@PDA-BBR微球表面粗糙，存在不规则粗糙片层结构。见图2a～d。
图2
微球理化性能表征
a～d. 扫描电镜观察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR（×10 k）；e. MBG的N2吸附-脱附曲线；f. X射线衍射图谱；g. 小角度X射线衍射图谱；h. 傅里叶红外光谱
Figure2. Characterization of physical and chemical properties of the microspheresa-d. Scanning electron microscopy observations (×10 k) of MBG, MBG@PDA, NG-MBG@PDA, and NG-MBG@PDA-BBR, respectively; e. N2 adsorption-desorption curves of MBG microspheres; f. X-ray diffraction patterns; g. Low-angle X-ray diffraction patterns; h. Fourier transform infrared spectra
2.1.2 比表面积及孔容分析仪测定
MBG的N2吸附-脱附曲线为典型Ⅳ型等温线，存在明显滞后环，提示该微球具有介孔结构，是理想的药物载体（图2e）。
2.1.3 X射线衍射测定
X射线衍射图谱示，MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA和NG-MBG@PDA-BBR均可见位于衍射角22° 附近宽带，为非晶硅酸盐材料X射线衍射图谱典型特征（图2f）。小角度X射线衍射图谱显示NG-MBG微球介孔结构相关的特殊衍射峰（衍射角 2°）与MBG相比明显下降，提示MBG通过其介孔结构实现对NG的负载。见图2g。
2.1.4 傅里叶红外光谱仪测定
红外光谱示MBG在800 cm−1处存在Si-O-Si特征吸收峰；MBG@PDA该特征峰峰强较MBG略下降，可能与PDA的包裹有关； NG-MBG@PDA在800 cm−1附近特征峰则较MBG略上升，分析与NG在821 cm−1处存在苯环特征吸收峰相关；NG-MBG@PDA-BBR在1 500 cm−1处出现了BBR芳香环骨架振动吸收峰，提示微球中存在BBR。见图2h。
2.2 复合微球药物载药率及释放量
NG-MBG的NG载药率为22.4%±0.5%，NG-MBG@PDA-BBR的BBR载药率为25.1%±0.7%。释放量观测示，负载于PDA涂层中的BBR在第1天时展现出快速释放行为，释放率达42.7%±1.2%；之后随时间延长，释放逐渐放缓并趋于稳定，14 d时累计释放率达90.2%±1.2%；负载于MBG微球中的NG前3天释放较稳定，均在10%～15%；第4天时出现1个释放高峰，当日释放率达22.9%±0.7%，之后释放逐渐放缓并趋于稳定，14 d时累计释放率达60.4%±0.8%。见图3。
图3
复合微球药物释放曲线
a. 药物释放率；b. 药物累计释放率
Figure3. Drug release curves of composite microspheresa. Drug release rate; b. Cumulative drug release rate
2.3 复合微球抗菌性能评价
与两种细菌悬液共培养24 h后，与空白对照组相比，MBG@PDA组菌落数未见明显变化（P>0.05）；NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组菌落数均下降，其中NG-MBG@PDA-BBR组下降最明显，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组对金黄色葡萄球菌抑菌率分别为4.6%±0.7%、56.0%±1.7%、78.8%±1.5%，对大肠杆菌抑菌率分别为5.0%±0.6%、55.7%±2.1%、91.5%±2.2%。见图4。
图4
复合微球抗菌性能评价
a. 各组培养24 h后金黄色葡萄球菌（上）、大肠杆菌（下）菌落观察 从左至右分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组；b. 各组金黄色葡萄球菌菌落计数比较；c. 各组大肠杆菌菌落计数比较
Figure4. Antibacterial capability evaluation of composite microspheresa. Colony observation of
2.4 复合微球生物相容性评价
培养24 h，各组活细胞数量相似，组间A值差异均无统计学意义（P>0.05）。72 h时，与空白对照组相比，MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组及NG-MBG@PDA-BBR组活细胞数量均增加，A值均上升且差异有统计学意义（P<0.05）；其中NG-MBG@PDA组A值最高（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR组较NG-MBG@PDA组略下降，但差异无统计学意义（P>0.05），MBG@PDA组A值最低（P<0.05）。见图5。
图5
复合微球生物相容性评价
a. 培养24（上）、72 h（下）活/死细胞荧光染色观察（荧光倒置显微镜×20） 从左至右分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组；b. CCK-8检测细胞
a. Fluorescence staining observation of living/dead cells at 24 (top) and 72 hours (bottom) (Fluorescence inverted microscope×20) From left to right for the blank control group, MBG@PDA group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b.
2.5 复合微球促成骨性能评价
与空白对照组相比，MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组与NG-MBG@PDA-BBR组的ALP阳性面积和钙结节数量均提高（P<0.05）。各微球组中，NG-MBG@PDA组最多（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR组次之但与前者差异无统计学意义（P>0.05），NGMBG@PDA组最少（P<0.05）。见图6。
图6
复合微球促成骨性能评价
a. ALP（上）及茜素红（下）染色观察（×20） 从左至右分别为空白对照组、NG-MBG组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组； b. ALP阳性面积相对值； c. 钙结节计数相对值
Figure6. Osteogenesis evaluation of composite microspheresa. ALP (top) and alizarin red (bottom) staining observation (×20) From left to right for the blank control group, NG-MBG group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b. Relative value of ALP activity-positive area; c. Relative value of calcium nodule counting
3 讨论
感染性骨缺损修复是目前骨科棘手难题，通过发挥骨组织工程材料在功能多样化方面的优势，有望彻底解决该难题。多功能介孔载药微球在该领域极具应用潜力，借助介孔微球释放促成骨分化和强抗菌性药物成为感染性骨缺损修复领域的研究热门。
本研究制备的MBG微球展现出良好药物负载能力，并可通过介孔结构的屏障作用，有效减缓NG释放速率，实现药物持续释放。此外，通过掺杂BBR的PDA涂层对NG-MBG微球进行二次修饰，实现了复合微球对NG与BBR的双重负载，NG-MBG@PDA-BBR对NG与BBR的载药率分别达22.4%±0.5%和25.1%±0.7%。药物释放率结果表明NG与BBR均可实现14 d持续释放，累计释放率分别达60.4%±0.8%与90.2%±1.2%。
BBR是传统中药黄连的主要活性生物碱，具有抑菌能力优异、广谱抗菌与不易产生耐药性等优势，对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌表现出较强的抑菌作用，其在低浓度时可抑制细菌生长，高浓度时则可杀灭细菌。本研究通过在复合载药微球表面修饰BBR，赋予微球抑菌能力。在体外细菌实验中，NG-MBG@PDA-BBR组对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抑菌率达78.8%±1.5%与91.5%±2.2%，明显高于其余实验组。而优异且持续的抗菌性能对复合微球在临床中的应用推广具有重要价值[28]。
良好的生物相容性是评估复合微球综合性能的基础[29]。NG-MBG/PDA-BBR的主要成分包括MBG、NG、PDA和BBR，均已被证实为低细胞毒性材料，同时MBG与PDA作为载体和表面修饰材料在组织工程修复领域应用广泛，安全性和可靠性均得到证实。在体外细胞实验中，与大鼠BMSCs共培养后，相较于空白对照组，MBG@PDA、NG-MBG@PDA与NG-MBG@PDA-BBR组24 h时细胞增殖速率无明显变化，72 h时细胞数量展现出增加趋势，说明各组微球均具备良好的生物相容性。
ALP与茜素红染色常用于评估材料的成骨分化性能[30]。研究表明MBG与PDA不仅有良好的生物相容性，还具备生物可降解性；MBG的离子降解产物，如硅离子、钙离子与磷离子，一定程度可促进大鼠BMSCs增殖，诱导其成骨分化以加速骨组织修复重建。NG作为骨碎补的主要活性单体，可通过调控多条信号通路参与骨代谢调控，促进BMSCs成骨分化，同时抑制破骨细胞活性，以促进骨再生。本研究结果表明，与空白对照组和MBG@PDA组相比，NG-MBG@PDA-BBR组BMSCs 的ALP阳性面积和钙结节生成数量显著提高。同时在MBG@PDA颗粒诱导成骨的基础上，负载NG可进一步增强诱导成骨性能。
综上述，本实验成功制备具有抗菌与成骨性能的多功能复合载药微球NG-MBG@PDA-BBR。通过体外实验验证了该复合微球优异的抗菌能力与诱导成骨分化性能，可实现药物的持续释放，后续将进一步采用动物体内实验以评估复合微球的综合抗菌与成骨性能。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
作者贡献声明 熊伟：文章构思与设计、资料收集及论文撰写；曾志奎：文章构思与设计、审校；钱国文：文章构思与设计；袁灵梅、梁超轶：资料收集；王梁霞、潘斌、郭灵、魏文强、邱勋祥、邓文芳：数据分析
骨感染导致的大段骨缺损是临床治疗难题，采用生物材料修复是极具发展前景的治疗策略。然而，植入材料通常缺乏抗菌能力，植入人体后易发生细菌感染，而且大多缺乏生物活性，成骨效能欠佳，难以与宿主骨良好融合，最终导致骨修复失败[1-4]。为避免材料植入后发生感染，临床常联合全身应用抗生素方法，但存在因损伤部位局部血运不佳，难以达到有效杀菌浓度[5-7]，以及高浓度药物不但具有严重毒副作用，还可能导致细菌耐药，增加感染控制难度[8-10]等问题。因此，研发一种在修复骨缺损同时能有效杀死细菌、抑制感染的骨植入材料具有重要临床意义。
载药纳米微球在克服现有感染性骨缺损修复方式缺点方面表现出巨大潜力[11-14]。介孔生物玻璃微球（mesoporous bioactive glasses，MBG）是骨组织工程研究常用的可降解载药微球，具有高比表面积、介孔结构和良好生物相容性优点[15-17]，将药物吸附于微球表面与介孔结构中，可实现缓慢释放。聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂层易于合成且具有优异生物相容性及降解性能，用其对MBG进行表面改性后，通过在PDA涂层与微球中吸附离子或药物，可构建具有多重功能的复合微球[18-20]。
黄连素（berberine，BBR）是中药黄连的一种天然单体化合物，具有广谱、强效抗菌功能[21-23]。柚皮苷（naringin，NG）是补肾壮骨中药骨碎补的主要活性单体，能有效调节骨代谢、促进骨损伤修复，以及能诱导BMSCs向成骨分化[24-27]。基于上述既往研究结果，本课题组设计了一种BBR-NG双重载药复合微球（NG-MBG@PDA-BBR），首先将促成骨药物NG负载于MBG，然后将抗菌药物BBR混合于PDA后对载药的MBG进行表面改性，以期通过缓慢释放上述两种中药活性成分，实现抗菌和促成骨双重目的，为临床治疗感染性骨缺损提供一种新材料。本次研究旨在测试该复合微球中NG和BBR的负载与释放行为，评估其体外抗菌性能、细胞相容性及成骨性能，为下一步体内研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
乙醇、氨水（广州化学试剂厂）；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、正硅酸盐四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、四水硝酸钙（calcium nitrate tetrahydrate，CN）、PDA、BBR、NG（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠BMSCs、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（江西理工大学实验室保存）；FBS、青霉素和链霉素（广州赛业生物科技有限公司）；ALP染色试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、活/死细胞染色试剂盒（武汉亚科因生物技术有限公司）；DMEM培养基、茜素红染色液、胰蛋白酶、PBS缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司）。
X射线衍射仪（Bruker公司，德国）；傅里叶红外光谱仪（Thermoelectrics公司，美国）；比表面积及孔容分析仪（Micromeritics公司，美国）；全自动定量绘图酶标仪（Thermo Scientific公司，美国）；JEM-F200透射电镜（JEOL公司，日本）；EVO18扫描电镜（ZEISS公司，德国）；荧光倒置显微镜（Olympus公司，日本）；Image J软件（美国国立卫生研究院）；CHT210R高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。
1.2 NG-MBG@PDA-BBR的制备
1.2.1 MBG制备
首先取1.5 mL浓氨水、25 mL无水乙醇和50 mL去离子水制备混合溶液，然后加入0.5 g CTAB于35℃剧烈搅拌，待CTAB溶解后每间隔30 min依次加入2 mL TEOS与0.9 g CN，继续搅拌24 h后，以离心半径15 cm、10 000 r/min 离心10 min。 收集白色沉淀物，无水乙醇洗涤3次后超声分散在200 mL去离子水中，转移至高压釜中，于120℃条件下保存12 h。取出样品待自然冷却至室温后，同上法离心后收集白色沉淀物；去离子水洗涤3次，再次同上法离心后收集白色沉淀物，并转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48 h后，转移至坩埚中在马弗炉内煅烧，升温速度设置为5℃/min，至550℃后维持温度6 h，自然冷却至常温，将样品研磨成细粉末即获得MBG微球。
1.2.2 NG-MBG制备
称取30 mg NG与100 mg MBG，依次加入100 mL去离子水中，超声分散后将溶液在室温下搅拌24 h。收集溶液转移至离心管中，同上法离心后收集底层沉淀物，于50℃干燥箱内烘干12 h后，获得NG-MBG微球。
1.2.3 MBG@PDA制备
称取500 mg PDA与500 mg MBG，加入100 mL去离子水，室温下磁力搅拌1 h后添加NaOH调节溶液pH值至10左右，继续搅拌24 h，收集溶液转移至离心管中，同上法离心后收集沉淀物，去离子水与乙醇各冲洗3次，干燥后获得MBG@PDA微球。
1.2.4 NG-MBG@PDA制备
称取500 mg PDA与500 mg NG-MBG，同1.2.3 MBG@PDA制备方法，获得NG-MBG@PDA微球。
1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制备
称取500 mg PDA、500 mg NG-MBG和200 mg BBR，同1.2.3 MBG@PDA制备方法，获得复合微球NG-MBG@PDA-BBR。见图1。
图1
NG-MBG@PDA-BBR制备流程示意图
Figure1.
Schematic of NG-MBG@PDA-BBR preparation
1.3 观测指标
1.3.1 微球理化性能表征
① 采用扫描电镜观察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR样品表面形貌和结构。② 比表面积及孔容分析仪测定MBG比表面积。③ X射线衍射仪测定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR化学组成；同时采用小角度X射线衍射观察MBG和NG-MBG，分析NG是否成功负载于MBG介孔结构。④ 傅里叶红外光谱仪测定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR分子化学键的吸收峰。
1.3.2 复合微球药物载药率及释放量
① NG载药率测定：称取5、10、15、20、25、30 mg NG，分别置于100 mL烧杯，加入去离子水溶解并定容至100 mL，NG溶液理论浓度分别为50、100、150、200、250、300 μg/mL。用移液枪分别取上述不同浓度的NG溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶标仪测定283 nm吸收波长处各组溶液吸光度（A）值，计算并绘制NG标准浓度曲线。取1.2.2 NG-MBG制备步骤离心后上清液，同上法测定A值，根据NG标准浓度曲线计算NG剩余量（M1）；同时收集离心沉淀物，用去离子水与乙醇超声各冲洗3次，干燥后称取粉末质量（M2），根据以下公式计算NG载药率： NG载药率=（30−M1）/［100+（30−M2）］×100%。实验重复测量3次。
② BBR载药率测定：称取2、4、6、8、10、12 mg BBR，分别置于100 mL烧杯中，加入去离子水溶解并定容至100 mL，BBR溶液理论浓度分别为20、40、60、80、100、120 μg/mL。用移液枪分别取上述不同浓度的BBR溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶标仪测定346 nm吸收波长处各组溶液A值，计算并绘制BBR标准浓度曲线。取1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制备步骤离心后的上清液，测量346 nm吸收波长处A值，根据BBR标准曲线计算BBR剩余量（M3）；同时收集离心沉淀物，用去离子水与乙醇超声各冲洗3次，干燥后称取粉末质量（M4），根据以下公式计算BBR负载率：BBR载药率=（200−M3）/M4×100%。实验重复测量3次。
③ NG与BBR释放量测定：将10 mg NG-MBG@PDA-BBR浸入10 mL去离子水中，每天更换去离子水，持续14 d。将每天获得的浸泡液以离心半径15 cm、10 000 r/min 离心5 min后，收集上清液，采用酶标仪分别在283、346 nm吸收波长处测量A值，根据NG、BBR标准浓度曲线计算NG、BBR释放量。实验重复测量3次。
1.3.3 复合微球抗菌性能评价
实验分为4组，分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组取对应微球样品与去离子水按照一定比例（样品∶去离子水=10 mg∶1 mL）混合后静置24 h，吸取样品溶液置于96孔板，每孔100 μL，每组3孔；空白对照组添加相同体积去离子水。各孔中分别添加10 μL金黄色葡萄球菌与大肠杆菌细菌悬液（浓度为1×106 CFU/mL），于37℃恒温培养箱中孵育24 h后，各组取50 μL细菌悬液稀释10 000倍配置为工作液后，接种于营养琼脂板；于37℃恒温培养箱中继续孵育12 h后，用Image J软件计数菌落，根据以下公式计算抑菌率：抑菌率=（菌落数空白对照组−菌落数其他实验组）/菌落数空白对照组×100%。实验重复测量3次。
1.3.4 复合微球生物相容性评价
实验分组方法同1.3.3。采用CCK-8法与活/死细胞荧光染色法测定样品对大鼠BMSCs增殖的影响。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组样品紫外光照射24 h灭菌后，与细胞培养基（含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基）混合（样品∶培养基=10 mg∶1 mL），置于 37 ℃、5%CO2培养箱中24 h，获得各样品浸提液。
将大鼠BMSCs接种于96孔板，每孔3×103个；空白对照组添加150 μL细胞培养基，其余各组添加等体积样品浸提液。于37℃、5%CO2培养箱中培养24、72 h后，各组分别取5孔参照试剂盒说明书行CCK-8检测与活/死细胞荧光染色观察。其中，CCK-8检测以450 nm吸收波长处A值表示细胞活性。活/死细胞荧光染色后于荧光倒置显微镜下观察染色结果，以绿色荧光为活细胞、红色荧光为死细胞。
1.3.5 复合微球促成骨性能评价
实验分组方法同1.3.3。将大鼠BMSCs接种于6孔板，每孔3×104个；空白对照组加入3 mL细胞培养基，其余各组添加等体积1.3.4中制备的样品浸提液。于37℃、5%CO2培养箱中培养7、14 d后，各组分别取3孔，吸弃培养基，多聚甲醛固定1 h，PBS溶液冲洗；室温下ALP染色（培养7 d）与茜素红染色（培养14 d）24 h后，光镜下观察染色结果，随机取5个视野以Image J软件对ALP阳性面积和钙结节数量进行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示；组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 微球理化性能表征
2.1.1 扫描电镜观察
MBG呈粒径分布均匀的球形结构，表面光滑且各微球集聚成团；MBG@PDA为球状黏附沉积物；NG-MBG@PDA与MBG@PDA形貌相似，呈现为聚合的球状沉积物，PDA涂层均匀分布在微球表面，将各微球紧密聚合；NG-MBG@PDA-BBR微球表面粗糙，存在不规则粗糙片层结构。见图2a～d。
图2
微球理化性能表征
a～d. 扫描电镜观察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR（×10 k）；e. MBG的N2吸附-脱附曲线；f. X射线衍射图谱；g. 小角度X射线衍射图谱；h. 傅里叶红外光谱
Figure2. Characterization of physical and chemical properties of the microspheresa-d. Scanning electron microscopy observations (×10 k) of MBG, MBG@PDA, NG-MBG@PDA, and NG-MBG@PDA-BBR, respectively; e. N2 adsorption-desorption curves of MBG microspheres; f. X-ray diffraction patterns; g. Low-angle X-ray diffraction patterns; h. Fourier transform infrared spectra
2.1.2 比表面积及孔容分析仪测定
MBG的N2吸附-脱附曲线为典型Ⅳ型等温线，存在明显滞后环，提示该微球具有介孔结构，是理想的药物载体（图2e）。
2.1.3 X射线衍射测定
X射线衍射图谱示，MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA和NG-MBG@PDA-BBR均可见位于衍射角22° 附近宽带，为非晶硅酸盐材料X射线衍射图谱典型特征（图2f）。小角度X射线衍射图谱显示NG-MBG微球介孔结构相关的特殊衍射峰（衍射角 2°）与MBG相比明显下降，提示MBG通过其介孔结构实现对NG的负载。见图2g。
2.1.4 傅里叶红外光谱仪测定
红外光谱示MBG在800 cm−1处存在Si-O-Si特征吸收峰；MBG@PDA该特征峰峰强较MBG略下降，可能与PDA的包裹有关； NG-MBG@PDA在800 cm−1附近特征峰则较MBG略上升，分析与NG在821 cm−1处存在苯环特征吸收峰相关；NG-MBG@PDA-BBR在1 500 cm−1处出现了BBR芳香环骨架振动吸收峰，提示微球中存在BBR。见图2h。
2.2 复合微球药物载药率及释放量
NG-MBG的NG载药率为22.4%±0.5%，NG-MBG@PDA-BBR的BBR载药率为25.1%±0.7%。释放量观测示，负载于PDA涂层中的BBR在第1天时展现出快速释放行为，释放率达42.7%±1.2%；之后随时间延长，释放逐渐放缓并趋于稳定，14 d时累计释放率达90.2%±1.2%；负载于MBG微球中的NG前3天释放较稳定，均在10%～15%；第4天时出现1个释放高峰，当日释放率达22.9%±0.7%，之后释放逐渐放缓并趋于稳定，14 d时累计释放率达60.4%±0.8%。见图3。
图3
复合微球药物释放曲线
a. 药物释放率；b. 药物累计释放率
Figure3. Drug release curves of composite microspheresa. Drug release rate; b. Cumulative drug release rate
2.3 复合微球抗菌性能评价
与两种细菌悬液共培养24 h后，与空白对照组相比，MBG@PDA组菌落数未见明显变化（P>0.05）；NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组菌落数均下降，其中NG-MBG@PDA-BBR组下降最明显，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组对金黄色葡萄球菌抑菌率分别为4.6%±0.7%、56.0%±1.7%、78.8%±1.5%，对大肠杆菌抑菌率分别为5.0%±0.6%、55.7%±2.1%、91.5%±2.2%。见图4。
图4
复合微球抗菌性能评价
a. 各组培养24 h后金黄色葡萄球菌（上）、大肠杆菌（下）菌落观察 从左至右分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组；b. 各组金黄色葡萄球菌菌落计数比较；c. 各组大肠杆菌菌落计数比较
Figure4. Antibacterial capability evaluation of composite microspheresa. Colony observation of
2.4 复合微球生物相容性评价
培养24 h，各组活细胞数量相似，组间A值差异均无统计学意义（P>0.05）。72 h时，与空白对照组相比，MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组及NG-MBG@PDA-BBR组活细胞数量均增加，A值均上升且差异有统计学意义（P<0.05）；其中NG-MBG@PDA组A值最高（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR组较NG-MBG@PDA组略下降，但差异无统计学意义（P>0.05），MBG@PDA组A值最低（P<0.05）。见图5。
图5
复合微球生物相容性评价
a. 培养24（上）、72 h（下）活/死细胞荧光染色观察（荧光倒置显微镜×20） 从左至右分别为空白对照组、MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组；b. CCK-8检测细胞
a. Fluorescence staining observation of living/dead cells at 24 (top) and 72 hours (bottom) (Fluorescence inverted microscope×20) From left to right for the blank control group, MBG@PDA group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b.
2.5 复合微球促成骨性能评价
与空白对照组相比，MBG@PDA组、NG-MBG@PDA组与NG-MBG@PDA-BBR组的ALP阳性面积和钙结节数量均提高（P<0.05）。各微球组中，NG-MBG@PDA组最多（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR组次之但与前者差异无统计学意义（P>0.05），NGMBG@PDA组最少（P<0.05）。见图6。
图6
复合微球促成骨性能评价
a. ALP（上）及茜素红（下）染色观察（×20） 从左至右分别为空白对照组、NG-MBG组、NG-MBG@PDA组、NG-MBG@PDA-BBR组； b. ALP阳性面积相对值； c. 钙结节计数相对值
Figure6. Osteogenesis evaluation of composite microspheresa. ALP (top) and alizarin red (bottom) staining observation (×20) From left to right for the blank control group, NG-MBG group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b. Relative value of ALP activity-positive area; c. Relative value of calcium nodule counting
3 讨论
感染性骨缺损修复是目前骨科棘手难题，通过发挥骨组织工程材料在功能多样化方面的优势，有望彻底解决该难题。多功能介孔载药微球在该领域极具应用潜力，借助介孔微球释放促成骨分化和强抗菌性药物成为感染性骨缺损修复领域的研究热门。
本研究制备的MBG微球展现出良好药物负载能力，并可通过介孔结构的屏障作用，有效减缓NG释放速率，实现药物持续释放。此外，通过掺杂BBR的PDA涂层对NG-MBG微球进行二次修饰，实现了复合微球对NG与BBR的双重负载，NG-MBG@PDA-BBR对NG与BBR的载药率分别达22.4%±0.5%和25.1%±0.7%。药物释放率结果表明NG与BBR均可实现14 d持续释放，累计释放率分别达60.4%±0.8%与90.2%±1.2%。
BBR是传统中药黄连的主要活性生物碱，具有抑菌能力优异、广谱抗菌与不易产生耐药性等优势，对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌表现出较强的抑菌作用，其在低浓度时可抑制细菌生长，高浓度时则可杀灭细菌。本研究通过在复合载药微球表面修饰BBR，赋予微球抑菌能力。在体外细菌实验中，NG-MBG@PDA-BBR组对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抑菌率达78.8%±1.5%与91.5%±2.2%，明显高于其余实验组。而优异且持续的抗菌性能对复合微球在临床中的应用推广具有重要价值[28]。
良好的生物相容性是评估复合微球综合性能的基础[29]。NG-MBG/PDA-BBR的主要成分包括MBG、NG、PDA和BBR，均已被证实为低细胞毒性材料，同时MBG与PDA作为载体和表面修饰材料在组织工程修复领域应用广泛，安全性和可靠性均得到证实。在体外细胞实验中，与大鼠BMSCs共培养后，相较于空白对照组，MBG@PDA、NG-MBG@PDA与NG-MBG@PDA-BBR组24 h时细胞增殖速率无明显变化，72 h时细胞数量展现出增加趋势，说明各组微球均具备良好的生物相容性。
ALP与茜素红染色常用于评估材料的成骨分化性能[30]。研究表明MBG与PDA不仅有良好的生物相容性，还具备生物可降解性；MBG的离子降解产物，如硅离子、钙离子与磷离子，一定程度可促进大鼠BMSCs增殖，诱导其成骨分化以加速骨组织修复重建。NG作为骨碎补的主要活性单体，可通过调控多条信号通路参与骨代谢调控，促进BMSCs成骨分化，同时抑制破骨细胞活性，以促进骨再生。本研究结果表明，与空白对照组和MBG@PDA组相比，NG-MBG@PDA-BBR组BMSCs 的ALP阳性面积和钙结节生成数量显著提高。同时在MBG@PDA颗粒诱导成骨的基础上，负载NG可进一步增强诱导成骨性能。
综上述，本实验成功制备具有抗菌与成骨性能的多功能复合载药微球NG-MBG@PDA-BBR。通过体外实验验证了该复合微球优异的抗菌能力与诱导成骨分化性能，可实现药物的持续释放，后续将进一步采用动物体内实验以评估复合微球的综合抗菌与成骨性能。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
作者贡献声明 熊伟：文章构思与设计、资料收集及论文撰写；曾志奎：文章构思与设计、审校；钱国文：文章构思与设计；袁灵梅、梁超轶：资料收集；王梁霞、潘斌、郭灵、魏文强、邱勋祥、邓文芳：数据分析
