引用本文： 张静, 张潇月, 江琪, 曲迪, 胡羽生, 戚超, 付海涛. M2型小胶质细胞移植促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(2): 198-205. doi: 10.7507/1002-1892.202311093 复制
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是严重中枢神经系统损伤疾病，主要包括血管破裂、血脊髓屏障在内的原发性损伤和一系列细胞及分子反应引起的继发性损伤[1]。由于SCI进展复杂及神经通路自我修复能力有限，目前尚无理想治疗方法。细胞移植是近年用于SCI治疗的新方法，移植后的细胞可通过自我分化以及免疫调节功能改善损伤区域微环境，修复/替代受损神经组织或分化为具有活力的神经元以重建神经网络[2]，进而改善多因素导致的SCI后兴奋毒性、神经元损伤以及胶质瘢痕组织形成等问题[3]。此外，移植细胞来源神经元衍生的轴突可以桥接脊髓断端[4]，重新构建神经元回路并恢复运动和感觉功能。目前，用于SCI治疗的细胞分离方案较多，常用细胞类型有MSCs[5-6]、胶质细胞[7]、嗅鞘细胞[8]、雪旺细胞[9-10]，植入体内后发挥调节局部微环境、营养支持、恢复受损细胞稳态、神经保护以及将神经炎症水平调节至更有益状态等作用。
小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统中的先天免疫细胞[11]，再生能力强，即使在无炎症的中枢神经系统中也能迅速增殖，并在7 d内恢复至正常密度[12]。如果MG可以移植至SCI损伤部位并发挥神经保护作用，那么中枢神经系统将获得充足的“治疗来源”。研究显示MG在内源性或病理信号影响下，可以转化分裂成众多亚型，包括经典活化的促炎表型（M1）、交替活化的抗炎表型（M2a和M2b）和获得性失活表型（M2c）[13]。MG在SCI后迅速活化，其中M1-MG表达IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子，招募炎症细胞导致原发性机械损伤后的进一步损伤[14]。相反，M2-MG可分泌IL-4、IL-10、IGF-1和TGF-β等抗炎细胞因子或趋化因子抑制过度炎症反应，促进伤口愈合[15]。IL-4 是巨噬细胞M2亚型增殖信号，已有研究证明在成年小鼠脑内注射重组IL-4可明显增强M2-MG基因表达[16]。将通过这种方法诱导获得的M2-MG移植到SCI小鼠体内，可以有效促进小鼠运动功能恢复[17]。
SCI后损伤区域星形胶质细胞显著增生并形成胶质瘢痕，阻碍轴突再生。研究表明损伤区附近的星形胶质细胞具有A1、 A2 型，分别发挥促炎效应和神经保护功能[18-20]。因此，从理论上分析抑制星形胶质细胞向A1型转化对改善SCI后的功能恢复具有重要价值。本研究旨在利用IL-4体外诱导MG分化为M2亚型，并用于小鼠SCI损伤区域，评估其对神经元轴突再生和神经功能恢复的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6周龄雌性C57BL/6小鼠42只，体质量15～18 g，由济南杰瑞康生物科技有限公司提供。新生2～3 d C57BL/6乳鼠15只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 g；新生1周C57BL/6乳鼠5只，雌雄不限，体质量5.5～6.0 g；均由本课题组自行繁育。动物实验操作按照青岛大学附属医院实验动物护理使用指南进行，实验前小鼠在控制条件下正常喂养7 d以适应环境。
偶联 Alexa Fluor 山羊抗兔二抗、偶联 Alexa Fluor 山羊抗鼠二抗、山羊抗鼠Iba1抗体以及山羊抗兔抗精氨酸酶 1（Arginase 1，Arg-1）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神经元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）、C3抗体（Abcam公司，美国）；多聚赖氨酸、重组小鼠IL-4（Sigma公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；DMEM/F12培养基、 DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）。
相差显微镜（上海巴拓仪器有限公司）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；体视显微镜、脑立体定位仪、Nanoject Ⅲ微量注射泵、小动物麻醉机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Transwell培养板（Corning公司，美国）；超速离心管、超速离心机（Beckman 公司，美国）；脊髓夹伤镊（Fine Science Tools公司，英国）。
1.2 细胞培养及鉴定
1.2.1 MG提取及鉴定
取15只新生2～3 d C57BL/6乳鼠置于75%乙醇浸泡15 min后，使用眼科剪剪下乳鼠头部获取脑组织，体视显微镜下用镊子取大脑皮质，置于0.25%胰蛋白酶消化10 min，以含15%FBS的DMEM/F12培养基重悬，将单细胞悬液通过100 μm细胞筛网，以离心半径10 cm，1 000 r/min离心5 min。置于37℃、5%CO2培养箱中培养14 d，于摇床以200 r/min震荡2 h，收集脱落的MG置于25 cm2细胞培养瓶，相差显微镜下观察细胞形态，继续培养待细胞生长至80%～90%密度时，进行Iba1免疫荧光染色鉴定其纯度。荧光显微镜下Iba1呈绿色荧光，DAPI呈蓝色荧光，两者重合部分为阳性细胞，当细胞纯度达80%时提示培养细胞为MG。
1.2.2 M2-MG诱导培养及鉴定
取生长状态稳定的MG接种于6孔板，每孔6×105个细胞，随机分为两组，每组3个复孔。实验组、对照组分别以含20 ng/mL IL-4的DMEM培养基、单纯DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养48 h后于相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况，并行Arg-1、Iba1免疫荧光染色。首先4%多聚甲醛固定细胞30 min；室温封闭30 min，与Arg-1、Iba1一抗4℃孵育过夜，复温后与偶联 Alexa Fluor 山羊抗兔二抗、偶联 Alexa Fluor 山羊抗鼠二抗共孵育1 h，PBS洗涤后加入 DAPI 复染。荧光显微镜下观察，细胞诱导为M2型后Arg-1染色呈强绿色荧光，使用Image J软件半定量分析Arg-1、Iba1荧光强度。
1.3 背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）培养及与M2-MG共培养观测
将5只新生1周C57BL/6乳鼠置于75%乙醇浸泡15 min，然后沿背部中线纵行切开脊柱，取长约1 cm的胸腰段脊柱。于体视显微镜下摘取两侧DRG，置于含10%FBS的DMEM培养基中，用显微镊完整剥除其外膜后，接种于Transwell培养板下层。用含10%FBS的DMEM培养基重悬1.2.2中获得的M2-MG后，接种于培养板上层与DRG共培养作为实验组（M2-MG+DRG组）；以上层未添加M2-MG培养的DRG作为对照组（DRG组）。DRG及M2-MG接种密度均为3×104个/cm2。置于37℃、5%CO2培养箱中培养5 d后，相差显微镜下观察DRG轴突生长情况，随机取3个DRG采用Image J软件分别测量对应4个象限中3根最长轴突的长度，取均值。
1.4 动物实验
1.4.1 实验分组及方法
取42只6周龄C57BL/6小鼠随机分为假手术组（n=6）、SCI组（n=18）及SCI+M2-MG组（n=18）。所有小鼠腹腔注射5%水合氯醛（1 mL/200 g）麻醉后，作背部正中纵形切口暴露T10节段脊柱，假手术组仅切除椎板，SCI组及SCI+M2-MG组行SCI造模，采用脊髓夹伤镊钳夹T10节段脊髓3 s，确保夹伤时脊髓被全部覆盖。以夹伤过程中小鼠后肢明显抽搐，苏醒后双下肢完全瘫痪且无踝关节活动，作为判断造模成功标准。SCI+M2-MG组在造模成功后立即行M2-MG移植，具体方法：连接微量注射泵的玻璃微电极与脑立体定位仪，生理盐水冲洗SCI部位以获得清晰视野，玻璃微电极吸取2 μL M2-MG细胞悬液（约1×105个细胞）后插入损伤区域，以3 nL/s速度注射15 min。术后各组每天人工按摩小鼠膀胱2次，促进排尿、排便，直至重新建立自主排尿功能。
1.4.2 观测指标
① 行为学检测：术后观测各组小鼠存活以及后肢功能恢复情况。 术后当天（0）、3、7、14、21、28 d，各组取3只小鼠采用 BMS（Basso Mouse Scale）评分评价运动功能恢复情况，总分为9分，评分从高到低表示由完全正常逐渐向完全瘫痪过渡。术后28 d行足迹实验评价小鼠步态，如足迹间隔均匀、足迹轨迹连续和稳定提示步态协调。
② 免疫荧光染色观察：术后7、14、28 d，SCI组、SCI+M2-MG组各取3只小鼠进行观测。各组同上法麻醉后，通过心脏持续灌注10倍浓度冷PBS，待肝脏从红色变为灰白色后，改为注入4%多聚甲醛，待小鼠抽搐停止后迅速分离脊柱，取出T7～9节段脊柱置于4% 多聚甲醛、4℃固定过夜。体视显微镜下剥离脊髓后置于30%蔗糖溶液中，于4℃脱水24 h；冠状位切片，片厚25 μm；采用封闭液在常温下封闭2 h，PBS洗涤后与GFAP、C3和NeuN一抗在4℃下孵育过夜，复温后与对应二抗孵育2 h并进行DAPI核染色，荧光显微镜下观察。取7、14、28 d GFAP染色（绿色荧光）切片观察SCI损伤区域，28 d NeuN染色（绿色荧光）切片观察神经元存活情况，7、14 d GFAP/C3双重染色（绿色/红色荧光）切片观察A1星形胶质细胞变化。各组随机选择3个视野，使用 Image J图像分析软件对存活神经元数量和A1星形胶质细胞（C3+/GFAP+细胞）进行计数，计算C3+/GFAP+细胞百分比，并测量SCI损伤区域面积，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示。体外实验中Iba1、Arg-1荧光强度及轴突长度比较采用独立样本t检验。动物实验中BMS评分采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser 进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析；荧光染色测量结果组间比较采用单因素方差分析或独立样本ｔ检验，两两比较采用SNK检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养及鉴定
2.1.1 MG鉴定
MG体外培养14 d后，相差显微镜下见上层透亮，细胞呈圆形；荧光显微镜下Iba1阳性细胞呈绿色荧光，阳性率约为90%。上述结果提示培养细胞为MG。见图1。
图1
MG形态观察及鉴定
a. 培养14 d相差显微镜观察细胞形态（×200）；b. 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200） 从左至右分别为DAPI染色、Iba1染色、重叠图像
Figure1. Morphological observation and identification of MGa. Morphological observation after 14 days of culture under contrast microscope (×200); b. Immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×200) From left to right for DAPI staining, Iba1 staining, and overlapping images, respectively
2.1.2 M2-MG鉴定
诱导培养48 h后，实验组细胞形态以圆形为主，有少量形态不规则细胞，并出现一些伪足；对照组细胞也以圆形为主，但未见明显不规则变化和伪足生成。免疫荧光染色观察，两组细胞Iba1、Arg-1均呈阳性染色，但染色强度存在差异。对照组及实验组Iba1荧光强度分别为205.23±3.46、148.00±2.02，Arg-1荧光强度分别为105.54±1.71、179.42±2.18，差异均有统计学意义（t=8.252，P=0.001；t=15.400，P<0.001）。见图2。镜下细胞形态及免疫荧光染色结果表明实验组细胞极化诱导为M2亚型。
图2
M2-MG形态观察及鉴定
a. 实验组（左）及对照组（右）细胞形态（相差显微镜×200）；b. 实验组（上）及对照组（下）免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200） 从左至右分别为Iba1染色、DAPI染色、Arg-1染色、重叠图像
Figure2. Morphological observation and identification of M2-MGa. Cell morphology of experimental group (left) and control group (right) (Contrast microscope×200); b. Immunofluorescence staining of experimental group (top) and control group (bottom) (Fluorescence microscope×200) From left to right for Iba1 staining, DAPI staining, Arg-1 staining, and overlapping images, respectively
2.2 DRG与M2-MG共培养观测
培养5 d后相差显微镜下见，两组DRG细胞核周围均有轴突伸出。M2-MG+DRG组轴突长度为（630.77±43.80）μm，明显长于DRG组（318.14±20.63）μm，差异有统计学意义（t=21.700，P<0.001），见图3。
图3
相差显微镜观察DRG轴突（×50）
a. M2-MG+DRG组；b. DRG组
Figure3. DRG axons observation under contrast micorscope (×50)a. M2-MG+DRG group; b. DRG group
2.3 动物实验
2.3.1 行为学检测
术后各组小鼠均存活至实验完成，手术部位未发生感染等症状。假手术组小鼠术后后肢功能无异常；SCI组及SCI+M2-MG组小鼠术后早期后肢运动功能差，随时间延长逐渐恢复。与SCI组相比，SCI+M2-MG组术后0、3、7、14 d BMS评分差异无统计学意义（P>0.05），但术后21、28 d评分升高且差异有统计学意义（P<0.05）。
足迹实验示，术后28 d SCI+M2-MG组小鼠有拖拽步态，相较假手术组运动功能差；但拖曳步态较SCI组明显减轻，且出现足迹间隔，提示运动功能得到改善。见图4。
图4
3组小鼠行为学检测
a. BMS评分变化趋势；b. 术后28 d足迹实验 从上至下分别为假手术组、SCI组、SCI+M2-MG组
Figure4. Behavioral tests of mice in 3 groupsa. Change trends of BMS scores after operation; b. The footprint experiment at 28 days after operation From top to bottom for sham group, SCI group, and SCI+M2-MG group, respectively
2.3.2 免疫荧光染色观察
① GFAP染色：术后SCI组、SCI+M2-MG组损伤部位出现明显胶质瘢痕边界，且病变范围随时间延长逐渐扩大。图像分析示，术后7、14、28 d SCI+M2-MG 组损伤区域面积均低于SCI组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
各组GFAP免疫荧光染色观测
a. SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）荧光显微镜下观察（×50） 从左至右分别为术后7、14、28 d；b. 各组术后7、14、28 d损伤区域面积
Figure5. GFAP immunofluorescence staining of each groupa. Fluorescence microscope observation (×50) of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) From left to right for 7, 14, and 28 days, respectively; b. The size of injury area in each group at 7, 14, and 28 days, respectively
② NeuN染色：术后28 d， SCI+M2-MG 组神经元存活数量为（2 029±147）个/mm2，较SCI组（1 058±147）个/mm2明显增多，差异有统计学意义（t=5.280，P=0.006）。 见图6 。
图6
SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）NeuN免疫荧光染色观测（荧光显微镜×400）
从左至右分别为NeuN染色、DAPI染色、重叠图像
Figure6. NeuN immunofluorescence staining of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) (Fluorescence microscope×400)From left to right for NeuN staining, DAPI staining, and overlapping images, respectively
③ GFAP/C3双重染色：术后两组均可见GFAP绿色荧光及C3红色荧光表达，其中C3红色荧光随时间延长表达逐渐增强。但与SCI组相比，SCI+M2-MG组在术后7、14 d 时A1星形胶质细胞的特异性蛋白C3表达强度降低，C3+/GFAP+ 细胞百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图7
各组GFAP/C3双重免疫荧光染色观测
a. SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）荧光显微镜下观察（×100） 从左至右分别为7、14 d；b. 各组C3+/GFAP+细胞百分比
Figure7. GFAP/C3 double immunofluorescence staining in each groupa. Fluorescence microscope observation (×100) of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) From left to right for 7 and 14 days, respectively; b. Percentage of C3+/GFAP+ cells in each group
3 讨论
MG起源于胚胎卵黄囊，相较于其他神经细胞具有强大再生能力，是其优于其他细胞的特性之一。此外，MG发生活化阈值很低[21]，可以在SCI损伤后30 min内迅速激活，与神经元、其他胶质细胞及进入中枢神经系统的外周免疫细胞相互影响。MG通过合成趋化因子和细胞因子对周围其他神经细胞进行调节，使其成为同类保护性/破坏性分子，进而减小或加重SCI因胶质瘢痕形成、神经元死亡以及免疫浸润导致轴突再生的难度[21-22]。在SCI损伤后早期，MG通过增强吞噬活性，加速清除刺激物和细胞碎片发挥抗炎作用[23]；同时刺激周围其他神经细胞响应，为损伤区提供一种细胞保护和修复反应[24]，而这种神经修复的积极作用和M2亚型出现有关。在受到持续刺激后，随着M2亚型消散以及M1亚型的持续活化，MG分泌的炎症因子扩散并激活下游免疫反应[25]，表现促炎效应。Kigerl等[26] 的研究证明体外培养获得的M2-MG条件培养基可以促进受伤小鼠脊髓神经再生。因此，有效获取M2-MG并将其移植至SCI损伤部位，可能是研究SCI治疗方法的重要方向之一。
本研究以小鼠作为SCI动物模型，采用损伤部位原位注射方法移植细胞。选择该移植方法主要基于以下原因：首先，全身静脉或尾静脉注射移植时，移植细胞需要通过血脑屏障才能到达SCI损伤部位，导致移植细胞损失；其次，静脉注射可能对其他组织器官产生副作用；最后，有研究显示原位注射移植对脊髓造成的损伤可能比静脉给药更大[17]，如需注射细胞较多时，往往需要多次注射，造成较大损伤。考虑本研究所需细胞较少，对注射部位造成的损伤小，所以相较静脉注射效果更好。
本研究结果显示M2-MG移植治疗后，SCI小鼠后肢活动度、步态协调性均改善，术后 SCI+M2-MG组损伤区域面积较SCI组显著减小，免疫荧光染色显示类似神经保护结果，存活的神经元数量增多。此外，我们通过在体外培养DRG验证了M2-MG具有促轴突生长作用，这可能与其分泌的促生长因子有关。C3蛋白是A1星形胶质细胞标志物，该细胞失去了正常星形胶质细胞的形态和功能，是SCI后胶质瘢痕的重要组成成分，具有一定神经毒性并引发神经元死亡[27]。为了进一步验证M2-MG是否通过调节星形胶质细胞活化发挥神经保护作用，我们进行了GFAP/C3双重染色。结果显示SCI+M2-MG组小鼠 A1星形胶质细胞标志物C3蛋白表达降低，提示M2-MG抑制SCI后A1星形胶质细胞活化。
综上述，M2-MG移植对小鼠SCI损伤区域神经组织产生了积极影响，该促进作用可能与A1星形胶质细胞活化被抑制相关。但本研究仍存在一定不足，如MG表型在M1促炎损伤与M2抗炎修复之间转换，但移植后细胞是否一直保持移植时表型还是部分发生了表型改变，还需要通过更严谨的细胞测序手段验证。此外，M2-MG移植有可能改变了损伤区域的整体炎症状态，从而提供了一个促进脊髓愈合的环境，但有待进一步研究明确。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经青岛大学附属医院医学伦理委员会批准（QYFY WZLL 2812）；实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20200009
作者贡献声明 张静、江琪、曲迪：研究实施、数据分析；张潇月、胡羽生：数据收集及整理、图片绘制；戚超、付海涛：研究设计及对文章知识性内容作批评性审阅
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是严重中枢神经系统损伤疾病，主要包括血管破裂、血脊髓屏障在内的原发性损伤和一系列细胞及分子反应引起的继发性损伤[1]。由于SCI进展复杂及神经通路自我修复能力有限，目前尚无理想治疗方法。细胞移植是近年用于SCI治疗的新方法，移植后的细胞可通过自我分化以及免疫调节功能改善损伤区域微环境，修复/替代受损神经组织或分化为具有活力的神经元以重建神经网络[2]，进而改善多因素导致的SCI后兴奋毒性、神经元损伤以及胶质瘢痕组织形成等问题[3]。此外，移植细胞来源神经元衍生的轴突可以桥接脊髓断端[4]，重新构建神经元回路并恢复运动和感觉功能。目前，用于SCI治疗的细胞分离方案较多，常用细胞类型有MSCs[5-6]、胶质细胞[7]、嗅鞘细胞[8]、雪旺细胞[9-10]，植入体内后发挥调节局部微环境、营养支持、恢复受损细胞稳态、神经保护以及将神经炎症水平调节至更有益状态等作用。
小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统中的先天免疫细胞[11]，再生能力强，即使在无炎症的中枢神经系统中也能迅速增殖，并在7 d内恢复至正常密度[12]。如果MG可以移植至SCI损伤部位并发挥神经保护作用，那么中枢神经系统将获得充足的“治疗来源”。研究显示MG在内源性或病理信号影响下，可以转化分裂成众多亚型，包括经典活化的促炎表型（M1）、交替活化的抗炎表型（M2a和M2b）和获得性失活表型（M2c）[13]。MG在SCI后迅速活化，其中M1-MG表达IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子，招募炎症细胞导致原发性机械损伤后的进一步损伤[14]。相反，M2-MG可分泌IL-4、IL-10、IGF-1和TGF-β等抗炎细胞因子或趋化因子抑制过度炎症反应，促进伤口愈合[15]。IL-4 是巨噬细胞M2亚型增殖信号，已有研究证明在成年小鼠脑内注射重组IL-4可明显增强M2-MG基因表达[16]。将通过这种方法诱导获得的M2-MG移植到SCI小鼠体内，可以有效促进小鼠运动功能恢复[17]。
SCI后损伤区域星形胶质细胞显著增生并形成胶质瘢痕，阻碍轴突再生。研究表明损伤区附近的星形胶质细胞具有A1、 A2 型，分别发挥促炎效应和神经保护功能[18-20]。因此，从理论上分析抑制星形胶质细胞向A1型转化对改善SCI后的功能恢复具有重要价值。本研究旨在利用IL-4体外诱导MG分化为M2亚型，并用于小鼠SCI损伤区域，评估其对神经元轴突再生和神经功能恢复的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6周龄雌性C57BL/6小鼠42只，体质量15～18 g，由济南杰瑞康生物科技有限公司提供。新生2～3 d C57BL/6乳鼠15只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 g；新生1周C57BL/6乳鼠5只，雌雄不限，体质量5.5～6.0 g；均由本课题组自行繁育。动物实验操作按照青岛大学附属医院实验动物护理使用指南进行，实验前小鼠在控制条件下正常喂养7 d以适应环境。
偶联 Alexa Fluor 山羊抗兔二抗、偶联 Alexa Fluor 山羊抗鼠二抗、山羊抗鼠Iba1抗体以及山羊抗兔抗精氨酸酶 1（Arginase 1，Arg-1）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神经元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）、C3抗体（Abcam公司，美国）；多聚赖氨酸、重组小鼠IL-4（Sigma公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；DMEM/F12培养基、 DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）。
相差显微镜（上海巴拓仪器有限公司）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；体视显微镜、脑立体定位仪、Nanoject Ⅲ微量注射泵、小动物麻醉机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Transwell培养板（Corning公司，美国）；超速离心管、超速离心机（Beckman 公司，美国）；脊髓夹伤镊（Fine Science Tools公司，英国）。
1.2 细胞培养及鉴定
1.2.1 MG提取及鉴定
取15只新生2～3 d C57BL/6乳鼠置于75%乙醇浸泡15 min后，使用眼科剪剪下乳鼠头部获取脑组织，体视显微镜下用镊子取大脑皮质，置于0.25%胰蛋白酶消化10 min，以含15%FBS的DMEM/F12培养基重悬，将单细胞悬液通过100 μm细胞筛网，以离心半径10 cm，1 000 r/min离心5 min。置于37℃、5%CO2培养箱中培养14 d，于摇床以200 r/min震荡2 h，收集脱落的MG置于25 cm2细胞培养瓶，相差显微镜下观察细胞形态，继续培养待细胞生长至80%～90%密度时，进行Iba1免疫荧光染色鉴定其纯度。荧光显微镜下Iba1呈绿色荧光，DAPI呈蓝色荧光，两者重合部分为阳性细胞，当细胞纯度达80%时提示培养细胞为MG。
1.2.2 M2-MG诱导培养及鉴定
取生长状态稳定的MG接种于6孔板，每孔6×105个细胞，随机分为两组，每组3个复孔。实验组、对照组分别以含20 ng/mL IL-4的DMEM培养基、单纯DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养48 h后于相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况，并行Arg-1、Iba1免疫荧光染色。首先4%多聚甲醛固定细胞30 min；室温封闭30 min，与Arg-1、Iba1一抗4℃孵育过夜，复温后与偶联 Alexa Fluor 山羊抗兔二抗、偶联 Alexa Fluor 山羊抗鼠二抗共孵育1 h，PBS洗涤后加入 DAPI 复染。荧光显微镜下观察，细胞诱导为M2型后Arg-1染色呈强绿色荧光，使用Image J软件半定量分析Arg-1、Iba1荧光强度。
1.3 背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）培养及与M2-MG共培养观测
将5只新生1周C57BL/6乳鼠置于75%乙醇浸泡15 min，然后沿背部中线纵行切开脊柱，取长约1 cm的胸腰段脊柱。于体视显微镜下摘取两侧DRG，置于含10%FBS的DMEM培养基中，用显微镊完整剥除其外膜后，接种于Transwell培养板下层。用含10%FBS的DMEM培养基重悬1.2.2中获得的M2-MG后，接种于培养板上层与DRG共培养作为实验组（M2-MG+DRG组）；以上层未添加M2-MG培养的DRG作为对照组（DRG组）。DRG及M2-MG接种密度均为3×104个/cm2。置于37℃、5%CO2培养箱中培养5 d后，相差显微镜下观察DRG轴突生长情况，随机取3个DRG采用Image J软件分别测量对应4个象限中3根最长轴突的长度，取均值。
1.4 动物实验
1.4.1 实验分组及方法
取42只6周龄C57BL/6小鼠随机分为假手术组（n=6）、SCI组（n=18）及SCI+M2-MG组（n=18）。所有小鼠腹腔注射5%水合氯醛（1 mL/200 g）麻醉后，作背部正中纵形切口暴露T10节段脊柱，假手术组仅切除椎板，SCI组及SCI+M2-MG组行SCI造模，采用脊髓夹伤镊钳夹T10节段脊髓3 s，确保夹伤时脊髓被全部覆盖。以夹伤过程中小鼠后肢明显抽搐，苏醒后双下肢完全瘫痪且无踝关节活动，作为判断造模成功标准。SCI+M2-MG组在造模成功后立即行M2-MG移植，具体方法：连接微量注射泵的玻璃微电极与脑立体定位仪，生理盐水冲洗SCI部位以获得清晰视野，玻璃微电极吸取2 μL M2-MG细胞悬液（约1×105个细胞）后插入损伤区域，以3 nL/s速度注射15 min。术后各组每天人工按摩小鼠膀胱2次，促进排尿、排便，直至重新建立自主排尿功能。
1.4.2 观测指标
① 行为学检测：术后观测各组小鼠存活以及后肢功能恢复情况。 术后当天（0）、3、7、14、21、28 d，各组取3只小鼠采用 BMS（Basso Mouse Scale）评分评价运动功能恢复情况，总分为9分，评分从高到低表示由完全正常逐渐向完全瘫痪过渡。术后28 d行足迹实验评价小鼠步态，如足迹间隔均匀、足迹轨迹连续和稳定提示步态协调。
② 免疫荧光染色观察：术后7、14、28 d，SCI组、SCI+M2-MG组各取3只小鼠进行观测。各组同上法麻醉后，通过心脏持续灌注10倍浓度冷PBS，待肝脏从红色变为灰白色后，改为注入4%多聚甲醛，待小鼠抽搐停止后迅速分离脊柱，取出T7～9节段脊柱置于4% 多聚甲醛、4℃固定过夜。体视显微镜下剥离脊髓后置于30%蔗糖溶液中，于4℃脱水24 h；冠状位切片，片厚25 μm；采用封闭液在常温下封闭2 h，PBS洗涤后与GFAP、C3和NeuN一抗在4℃下孵育过夜，复温后与对应二抗孵育2 h并进行DAPI核染色，荧光显微镜下观察。取7、14、28 d GFAP染色（绿色荧光）切片观察SCI损伤区域，28 d NeuN染色（绿色荧光）切片观察神经元存活情况，7、14 d GFAP/C3双重染色（绿色/红色荧光）切片观察A1星形胶质细胞变化。各组随机选择3个视野，使用 Image J图像分析软件对存活神经元数量和A1星形胶质细胞（C3+/GFAP+细胞）进行计数，计算C3+/GFAP+细胞百分比，并测量SCI损伤区域面积，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料行Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示。体外实验中Iba1、Arg-1荧光强度及轴突长度比较采用独立样本t检验。动物实验中BMS评分采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser 进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析；荧光染色测量结果组间比较采用单因素方差分析或独立样本ｔ检验，两两比较采用SNK检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养及鉴定
2.1.1 MG鉴定
MG体外培养14 d后，相差显微镜下见上层透亮，细胞呈圆形；荧光显微镜下Iba1阳性细胞呈绿色荧光，阳性率约为90%。上述结果提示培养细胞为MG。见图1。
图1
MG形态观察及鉴定
a. 培养14 d相差显微镜观察细胞形态（×200）；b. 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200） 从左至右分别为DAPI染色、Iba1染色、重叠图像
Figure1. Morphological observation and identification of MGa. Morphological observation after 14 days of culture under contrast microscope (×200); b. Immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×200) From left to right for DAPI staining, Iba1 staining, and overlapping images, respectively
2.1.2 M2-MG鉴定
诱导培养48 h后，实验组细胞形态以圆形为主，有少量形态不规则细胞，并出现一些伪足；对照组细胞也以圆形为主，但未见明显不规则变化和伪足生成。免疫荧光染色观察，两组细胞Iba1、Arg-1均呈阳性染色，但染色强度存在差异。对照组及实验组Iba1荧光强度分别为205.23±3.46、148.00±2.02，Arg-1荧光强度分别为105.54±1.71、179.42±2.18，差异均有统计学意义（t=8.252，P=0.001；t=15.400，P<0.001）。见图2。镜下细胞形态及免疫荧光染色结果表明实验组细胞极化诱导为M2亚型。
图2
M2-MG形态观察及鉴定
a. 实验组（左）及对照组（右）细胞形态（相差显微镜×200）；b. 实验组（上）及对照组（下）免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200） 从左至右分别为Iba1染色、DAPI染色、Arg-1染色、重叠图像
Figure2. Morphological observation and identification of M2-MGa. Cell morphology of experimental group (left) and control group (right) (Contrast microscope×200); b. Immunofluorescence staining of experimental group (top) and control group (bottom) (Fluorescence microscope×200) From left to right for Iba1 staining, DAPI staining, Arg-1 staining, and overlapping images, respectively
2.2 DRG与M2-MG共培养观测
培养5 d后相差显微镜下见，两组DRG细胞核周围均有轴突伸出。M2-MG+DRG组轴突长度为（630.77±43.80）μm，明显长于DRG组（318.14±20.63）μm，差异有统计学意义（t=21.700，P<0.001），见图3。
图3
相差显微镜观察DRG轴突（×50）
a. M2-MG+DRG组；b. DRG组
Figure3. DRG axons observation under contrast micorscope (×50)a. M2-MG+DRG group; b. DRG group
2.3 动物实验
2.3.1 行为学检测
术后各组小鼠均存活至实验完成，手术部位未发生感染等症状。假手术组小鼠术后后肢功能无异常；SCI组及SCI+M2-MG组小鼠术后早期后肢运动功能差，随时间延长逐渐恢复。与SCI组相比，SCI+M2-MG组术后0、3、7、14 d BMS评分差异无统计学意义（P>0.05），但术后21、28 d评分升高且差异有统计学意义（P<0.05）。
足迹实验示，术后28 d SCI+M2-MG组小鼠有拖拽步态，相较假手术组运动功能差；但拖曳步态较SCI组明显减轻，且出现足迹间隔，提示运动功能得到改善。见图4。
图4
3组小鼠行为学检测
a. BMS评分变化趋势；b. 术后28 d足迹实验 从上至下分别为假手术组、SCI组、SCI+M2-MG组
Figure4. Behavioral tests of mice in 3 groupsa. Change trends of BMS scores after operation; b. The footprint experiment at 28 days after operation From top to bottom for sham group, SCI group, and SCI+M2-MG group, respectively
2.3.2 免疫荧光染色观察
① GFAP染色：术后SCI组、SCI+M2-MG组损伤部位出现明显胶质瘢痕边界，且病变范围随时间延长逐渐扩大。图像分析示，术后7、14、28 d SCI+M2-MG 组损伤区域面积均低于SCI组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
各组GFAP免疫荧光染色观测
a. SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）荧光显微镜下观察（×50） 从左至右分别为术后7、14、28 d；b. 各组术后7、14、28 d损伤区域面积
Figure5. GFAP immunofluorescence staining of each groupa. Fluorescence microscope observation (×50) of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) From left to right for 7, 14, and 28 days, respectively; b. The size of injury area in each group at 7, 14, and 28 days, respectively
② NeuN染色：术后28 d， SCI+M2-MG 组神经元存活数量为（2 029±147）个/mm2，较SCI组（1 058±147）个/mm2明显增多，差异有统计学意义（t=5.280，P=0.006）。 见图6 。
图6
SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）NeuN免疫荧光染色观测（荧光显微镜×400）
从左至右分别为NeuN染色、DAPI染色、重叠图像
Figure6. NeuN immunofluorescence staining of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) (Fluorescence microscope×400)From left to right for NeuN staining, DAPI staining, and overlapping images, respectively
③ GFAP/C3双重染色：术后两组均可见GFAP绿色荧光及C3红色荧光表达，其中C3红色荧光随时间延长表达逐渐增强。但与SCI组相比，SCI+M2-MG组在术后7、14 d 时A1星形胶质细胞的特异性蛋白C3表达强度降低，C3+/GFAP+ 细胞百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图7
各组GFAP/C3双重免疫荧光染色观测
a. SCI组（上）、SCI+M2-MG组（下）荧光显微镜下观察（×100） 从左至右分别为7、14 d；b. 各组C3+/GFAP+细胞百分比
Figure7. GFAP/C3 double immunofluorescence staining in each groupa. Fluorescence microscope observation (×100) of SCI group (top) and SCI+M2-MG group (bottom) From left to right for 7 and 14 days, respectively; b. Percentage of C3+/GFAP+ cells in each group
3 讨论
MG起源于胚胎卵黄囊，相较于其他神经细胞具有强大再生能力，是其优于其他细胞的特性之一。此外，MG发生活化阈值很低[21]，可以在SCI损伤后30 min内迅速激活，与神经元、其他胶质细胞及进入中枢神经系统的外周免疫细胞相互影响。MG通过合成趋化因子和细胞因子对周围其他神经细胞进行调节，使其成为同类保护性/破坏性分子，进而减小或加重SCI因胶质瘢痕形成、神经元死亡以及免疫浸润导致轴突再生的难度[21-22]。在SCI损伤后早期，MG通过增强吞噬活性，加速清除刺激物和细胞碎片发挥抗炎作用[23]；同时刺激周围其他神经细胞响应，为损伤区提供一种细胞保护和修复反应[24]，而这种神经修复的积极作用和M2亚型出现有关。在受到持续刺激后，随着M2亚型消散以及M1亚型的持续活化，MG分泌的炎症因子扩散并激活下游免疫反应[25]，表现促炎效应。Kigerl等[26] 的研究证明体外培养获得的M2-MG条件培养基可以促进受伤小鼠脊髓神经再生。因此，有效获取M2-MG并将其移植至SCI损伤部位，可能是研究SCI治疗方法的重要方向之一。
本研究以小鼠作为SCI动物模型，采用损伤部位原位注射方法移植细胞。选择该移植方法主要基于以下原因：首先，全身静脉或尾静脉注射移植时，移植细胞需要通过血脑屏障才能到达SCI损伤部位，导致移植细胞损失；其次，静脉注射可能对其他组织器官产生副作用；最后，有研究显示原位注射移植对脊髓造成的损伤可能比静脉给药更大[17]，如需注射细胞较多时，往往需要多次注射，造成较大损伤。考虑本研究所需细胞较少，对注射部位造成的损伤小，所以相较静脉注射效果更好。
本研究结果显示M2-MG移植治疗后，SCI小鼠后肢活动度、步态协调性均改善，术后 SCI+M2-MG组损伤区域面积较SCI组显著减小，免疫荧光染色显示类似神经保护结果，存活的神经元数量增多。此外，我们通过在体外培养DRG验证了M2-MG具有促轴突生长作用，这可能与其分泌的促生长因子有关。C3蛋白是A1星形胶质细胞标志物，该细胞失去了正常星形胶质细胞的形态和功能，是SCI后胶质瘢痕的重要组成成分，具有一定神经毒性并引发神经元死亡[27]。为了进一步验证M2-MG是否通过调节星形胶质细胞活化发挥神经保护作用，我们进行了GFAP/C3双重染色。结果显示SCI+M2-MG组小鼠 A1星形胶质细胞标志物C3蛋白表达降低，提示M2-MG抑制SCI后A1星形胶质细胞活化。
综上述，M2-MG移植对小鼠SCI损伤区域神经组织产生了积极影响，该促进作用可能与A1星形胶质细胞活化被抑制相关。但本研究仍存在一定不足，如MG表型在M1促炎损伤与M2抗炎修复之间转换，但移植后细胞是否一直保持移植时表型还是部分发生了表型改变，还需要通过更严谨的细胞测序手段验证。此外，M2-MG移植有可能改变了损伤区域的整体炎症状态，从而提供了一个促进脊髓愈合的环境，但有待进一步研究明确。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经青岛大学附属医院医学伦理委员会批准（QYFY WZLL 2812）；实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20200009
作者贡献声明 张静、江琪、曲迪：研究实施、数据分析；张潇月、胡羽生：数据收集及整理、图片绘制；戚超、付海涛：研究设计及对文章知识性内容作批评性审阅
