据统计，全球每年超过1/3死亡案例与心血管疾病有关，心血管疾病是发病率和致死率极高的疾病之一[1]。对于严重冠状动脉粥样硬化性心脏病，冠状动脉旁路移植被认为是最有效治疗手段。目前，桥血管选择仍以自体血管为主，包括大隐静脉、内乳动脉、桡动脉等[2]。然而，由于这类患者主要是老年人，部分患者外周动脉和静脉存在严重钙化、静脉曲张等问题，不能作为桥血管使用。因此，临床对小口径人工血管（内径<6 mm）需求逐渐增加[3]，但目前尚无此类血管产品。而且相关研究中人工血管移植后再狭窄率高，影响了临床转化，需要进一步研究具有良好生物相容性、适宜降解性、低免疫原性，以及含血管再生所需生物活性成分的人工血管，以降低其移植后的狭窄率[4]。
华通胶（Wharton’s jelly，WJ）是脐带血管周围黏液结缔组织，富含胶原、透明质酸和糖胺聚糖等成分[5]，而这些成分与血管细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成成分相似。此外，WJ包裹脐带动、静脉，使脐带中的血液即使在挤压、扭转等外力作用下也能正常循环[6]，这类似于血管管壁能缓冲减压以及减少变形、损伤和摩擦的功能。上述研究结果提示WJ可能是制备人工血管支架的理想天然材料。然而，WJ本身力学强度相对较弱，且无法单独用于静电纺丝[7]。
聚己内酯（polycaprolactone，PCL）是一种在生物医学和材料科学领域广泛应用的可降解聚合物[8]，已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于临床。PCL具有优异的力学性能以及良好的静电纺丝性能，研究显示采用其制备的静电纺丝纤维具有可调性、可控性以及高比表面积等优点[9]。本课题组前期研究发现采用胰蛋白酶法对WJ基质进行脱细胞处理，可以有效去除WJ细胞核成分，保留糖胺聚糖、蛋白质、纤维、透明质酸和羟脯氨酸等大部分生化成分以及FGF、TGF、PDGF和VEGF等生物活性因子；将PCL与WJ进行混合共纺，成功构建具有典型纳米纤维结构的WJ/PCL静电纺丝人工血管，经检测其具有良好力学性能，可有效抑制血小板黏附[10]。本研究旨在进一步观测WJ/PCL静电纺丝人工血管理化性能、细胞相容性及免疫原性等；同时修复兔颈动脉，观察其用于血管重建的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2月龄雄性新西兰大白兔16只，体质量约2 kg，购自上海允得生物科技有限公司。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）购自亿泽丰生物科技（上海）有限公司。胰蛋白酶、六氟异丙醇、碳二亚胺溶液、FBS、PBS缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、DMEM培养基、牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich公司，美国）；HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8） ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；活/死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。
静电纺丝仪 ［云帆（天津）仪器有限公司］；扫描电镜（Hitachi公司，日本）；荧光显微镜（Leica公司，德国）；Image J软件（美国国立卫生研究院）；傅立叶红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR；Bruker 公司，德国）；材料测试机（上海恒宇仪器有限公司）；全自动接触角试验仪（SITA公司，德国）；酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；电子托盘天平（岛津公司，日本）。
1.2 脱细胞WJ基质的制备
取上海交通大学医学院附属同仁医院妇产科20～30岁健康产妇自愿捐赠的10条新鲜脐带组织，彻底冲洗残留血液后，置于75%乙醇浸泡30 min。剥离脐带组织血管（2条动脉、1条静脉）以及外膜，使用无菌手术剪将分离的WJ切成长度为0.5 cm的小块，置于0.025%胰蛋白酶中（WJ与胰蛋白酶比例为1 g∶5 mL），于37℃用磁力搅拌器搅拌消化24 h；取悬浮液以16 000 ×g离心10 min，100 μm过滤器过滤；收集上清液，加入10% FBS抑制胰蛋白酶反应，将所得脱细胞WJ基质存贮于PBS，4℃保存备用。
1.3 静电纺丝人工血管制备
取脱细胞WJ基质与PCL按照质量比（W/W）50∶50混合，将获得的WJ/PCL混合物溶解于六氟异丙醇，调节溶液浓度为12%（W/V）；磁力搅拌器恒定搅拌24 h，使之完全溶解，得到WJ/PCL纺丝液。应用21G医用金属针头作为喷丝器，拧紧于注射器后，将注射器体部夹于精确注射器泵上。调节静电纺丝仪参数，高压电源15 kV，注射泵层流速度1.0 mL/h，室温25℃，环境湿度40%～50%，静电纺丝时间3～6 h。使用铝箔接地接收，调整接收距离为12 cm。静电纺丝完成后，将样本置于真空室中通风48 h，挥发去除残留有机溶剂；置于PBS缓冲液中，加入碳二亚胺溶液（pH5.5），于−4℃条件下放置24 h进行充分交联处理。取出样本以去离子水冲洗，置于真空冷冻干燥机中冻干，获得WJ/PCL静电纺丝膜。然后参照兔颈动脉尺寸（管壁厚0.2 mm，外径2 mm），将WJ/PCL静电纺丝膜多次缠绕于1.6 mm外径硅胶管，制备管长1.2 cm、管壁厚0.2 mm、外径2 mm的WJ/PCL静电纺丝人工血管。同法制备PCL静电纺丝人工血管，作为对照。后续体外实验直接采用静电纺丝膜进行观测，动物实验采用人工血管进行观测。
1.4 静电纺丝人工血管体外观测
1.4.1 孔隙率测定
采用液体置换法测定孔隙率。取无水乙醇测量体积记为V1；取上述冻干后的两组样品，分别置于无水乙醇中浸泡10 min，测量体积记为V2；最后取出样品，测量剩余无水乙醇体积记为V3。按照以下公式计算孔隙率，孔隙率=（V1−V3）/（V2−V3）×100%。实验重复3次，操作过程注意保持密闭，避免乙醇挥发。
1.4.2 亲水性检测
采用静态接触角测试法检测亲水性。将两组样品裁剪成10 mm×10 mm大小，每组取5个样品，将去离子水滴于样品表面，室温条件下应用全自动接触角试验仪测量表面与液滴形成的接触角（即水珠切线与水平线之间的夹角）。
1.4.3 蛋白吸附性能检测
将两组样品裁剪成直径为5 mm的圆片，每组取5个样品，去离子水漂洗3次，置于0.1 mol/L PBS缓冲液（pH7.4）12 h；取出置于含5 mL牛血清白蛋白溶液（浓度1 mg/mL，pH 7.4）的6孔板中，每孔1个样品，37℃孵育5 min；PBS缓冲液冲洗后，加入2 mL含有十二烷基硫酸钠溶液（pH 7.4）的PBS缓冲液孵育2 h；BCA蛋白检测试剂盒测定样品吸附蛋白量，按照以下公式计算蛋白吸附率，蛋白吸附率=样品吸附蛋白量/样品表面积。
1.4.4 体外降解性能检测
采用称重法测定两组样品在PBS缓冲液中降解程度。取上述冻干后两组样品，首先采用电子托盘天平称重（Wα），然后置于PBS缓冲液于37℃条件下缓慢降解。于浸入后0、1、3、5、7周，每组各取3个样品，同上法冻干后称重（Wβ）。按照以下公式计算各时间点降解率，降解率=（Wα−Wβ）/Wα×100%。
1.4.5 细胞相容性检测
将两组样品剪裁至与24孔板孔径大小一致的圆片状，灭菌处理后置于孔板中，每孔1个样品。取HUVECs加入DMEM培养基制成细胞悬液，接种至24孔板中，每孔1.0×105个。于37℃、5%CO2条件下共培养1、4、7 d，各取5孔采用CCK-8法分析细胞增殖情况，酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，参照活/死细胞染色试剂盒说明进行染色，荧光显微镜下观察，其中死细胞呈红色染色，活细胞呈绿色染色。
1.4.6 兔皮下免疫反应评估
取两组样品剪裁为1 cm×1 cm大小。取6只新西兰大白兔，肌肉注射速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）麻醉后，将样品植入腹部皮下（每组3只动物，每只动物皮下植入1个样品）。植入7 d后同法麻醉动物并取材，分别行CD45、CD163免疫荧光染色，荧光显微镜下见绿色/红色荧光标记为阳性染色；采用Image J软件分别分析CD45、CD163阳性染色面积与总染色面积比值。
1.5 静电纺丝人工血管动物实验
1.5.1 实验分组及方法
取10只新西兰大白兔，采用随机数字表法分为PCL组与WJ/PCL组，每组5只。实验动物同上法麻醉后，于左侧颈部作2 cm长切口，逐层切开皮肤及肌肉，暴露左侧颈动脉并分离，使用2个血管夹夹闭该颈动脉近心端和远心端，2个血管夹间距约2 cm；在血管夹之间剪除1 cm长颈动脉，制备颈动脉缺损模型。然后，取对应的人工血管与残留颈动脉进行端端吻合，重建颈动脉连续性；松开血管夹，见颈动脉血流恢复，确保吻合口无血液漏出。最后关闭切口。见图1。实验动物术后自由活动、饮水和饮食。术后肌肉注射青霉素7 d预防感染，于术后1个月进行观测。
图1
兔颈动脉缺损修复模型制备
a. 暴露左颈动脉；b. 制备颈动脉缺损；c. WJ/PCL静电纺丝人工血管端端吻合修复颈动脉；d. 松开血管夹后颈动脉
Figure1. Preparation of a rabbit carotid artery defect repair modela. Exposure of the left carotid artery; b. Preparation of carotid artery defect; c. End-to-end anastomosis of WJ/PCL electrospun artificial vascular graft to repair the rabbit carotid artery; d. Macroscopic photograph of carotid artery after removing the vascular clamp
1.5.2 观测指标
① 多普勒超声检查：两组实验动物进行多普勒超声检查，观察修复后颈动脉通畅情况，有无扭转、曲折等，同时测量颈动脉管腔直径。
② 大体观察：多普勒超声检查后，两组实验动物注射过量3%异戊巴比妥钠处死，按照原切口入路，显露移植人工血管，观察移植部位有无红肿等炎症反应、组织有无感染等情况。切取修复段血管及其两端2 mm正常血管，通过游标卡尺测量修复段以及正常段血管管腔直径（分别记为Dα、Dβ），按照以下公式计算血管通畅率，血管通畅率=Dα/Dβ×100%。
③ 力学性能观测：取两组标本裁剪成4 cm×1 cm大小，每组取4个样品，分别用夹子固定两端后置于材料测试机，以10 mm/min施加压缩载荷，直至50%压缩位移停止加载，绘制压缩应力-应变曲线；继续加载至样品断裂，计算极限拉伸应力和断裂拉伸率。
④ 组织学及免疫荧光染色观察：将两组标本置于4%多聚甲醛固定，取中段组织切片，片厚5 μm，行HE染色、Masson染色以及平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）、α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及血管内皮细胞（CD31）免疫荧光染色；采用Image J软件分析SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积与总染色面积比值。
1.6 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示；组间比较采用独立样本t检验；两组多个时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用Bonferroni法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 静电纺丝人工血管体外观测
2.1.1 孔隙率测定
PCL组孔隙率为67.22%±2.98%，WJ/PCL组为66.00%± 4.24%，差异无统计学意义（t=0.471，P=0.650）。
2.1.2 亲水性检测
于人工血管表面滴加去离子水3 s后，PCL组仍存在水滴，而WJ/PCL组水滴基本被吸收。PCL组接触角为（80.12±5.93）°，WJ/PCL组为（27.86±3.05）°，差异有统计学意义（t=15.670，P<0.001）。
2.1.3 蛋白吸附性能检测
PCL组蛋白吸附率为（78.12±8.81）μg/cm2，WJ/PCL组为（179.06±9.21）μg/cm2，差异有统计学意义（t=15.830，P<0.001）。
2.1.4 体外降解性能检测
两组人工血管随着在PBS缓冲液中浸泡时间延长均逐渐降解。其中1、3、5、7周时PCL组降解率明显低于WJ/PCL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
图2
两组人工血管降解率变化趋势
Figure2.
Change trends of degradation rates of artificial vascular grafts in the two groups
2.1.5 细胞相容性检测
活/死细胞染色示，共培养7 d内HUVECs在两组人工血管上均存活并增殖，未见红色死细胞，且WJ/PCL组活细胞多于PCL组。CCK-8检测示，两组A值均随培养时间延长而增加，且WJ/PCL组高于PCL组，其中1 d时差异无统计学意义（P>0.05），4、7 d时差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
两组细胞相容性观察
a. PCL组（上）及WJ/PCL组（下）活/死细胞染色观察（荧光显微镜×40） 从左至右分别为共培养1、4、7 d；b. CCK-8检测
a. Live/dead cell staining observations of the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom) (Fluorescence microscopy×40) From left to right for 1, 4, and 7 days of co-culture; b.
2.1.6 兔皮下免疫反应评估
荧光显微镜观察示，PCL组CD45阳性细胞较多、CD163阳性细胞较少，而WJ/PCL组则相反（图4）。定量分析示，PCL组CD45阳性染色面积占比达71.06%±5.39%，高于WJ/PCL组18.12%±3.70%；CD163阳性染色面积占比为11.20%±2.52%，低于WJ/PCL组27.06%±3.28%；上述指标组间差异均有统计学意义（t=16.190，P<0.001；t=7.674，P<0.001）。
图4
PCL组（上）与WJ/PCL组（下）免疫荧光染色观察（荧光显微镜×40）
从左至右分别为CD45/CD163、DAPI、两者重叠 a. CD45免疫荧光染色；b. CD163免疫荧光染色
Figure4. Immunofluorescence staining observations of the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom) (Fluorescence microscopy×40)From left to right for the images represent CD45/CD163, DAPI, and the merge of the two a. CD45 immunofluorescence staining; b. CD163 immunofluorescence staining
2.2 静电纺丝人工血管动物实验
2.2.1 多普勒超声检查
两组动物均存活至实验完成。术后1个月，多普勒超声检查示WJ/PCL组颈动脉血流通畅性良好，而PCL组血流堵塞。WJ/PCL组管腔直径为（1.82±0.11）mm，PCL组为（0.17±0.12）mm，差异有统计学意义（t=17.010，P<0.001）。见图5a。
图5
PCL组（上）及WJ/PCL组（下）兔颈动脉修复观察
a. 多普勒超声检查 箭头示修复血管范围；b. 大体观察；c. 压缩应力-应变曲线；d. HE染色 （左：×20、右：×40）；e. Masson染色（左：×20、右：×40）；f. SMC免疫荧光染色（荧光显微镜×40）；g. α-SMA免疫荧光染色（荧光显微镜×40）； h. CD31免疫荧光染色（荧光显微镜×40）；i. 两组SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积占比比较
Figure5. Observations of rabbit carotid artery repair in the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom)a. Doppler ultrasound examination Arrow indicated the range of repaired blood vessels; b. Gross observation; c. Compressive stress-strain curve; d. HE staining (left: ×20, right: ×40); e. Masson staining (left: ×20, right: ×40); f. SMC immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); g. α-SMA immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); h. CD31 immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); i. Comparison of the positive staining area ratios of SMCs, α-SMA, and CD31 between the two groups
2.2.2 大体观察
两组颈动脉吻合口结合情况良好，均能维持管状结构，WJ/PCL组颈动脉颜色较白，PCL组颜色偏暗黄（更多脓性样组织）。定量分析示，WJ/PCL组血管通畅率为80.0%±5.9%，而PCL组为20.0%±4.9%，差异有统计学意义（t=15.600，P<0.001）。见图5b。
2.2.3 力学性能观测
压缩应力-应变曲线示，随着压缩应变增加，两组压缩应力均呈上升趋势，且WJ/PCL组上升程度大于PCL组（图5c）。PCL组极限拉伸应力低于WJ/PCL组 ［（5.62±0.56）MPa vs （7.20±0.73）MPa］，断裂拉伸率亦低于WJ/PCL组 ［65.62%±3.45% vs 90.00%±3.16%］，差异均有统计学意义（t=3.428，P=0.009；t=10.430，P<0.001）。
2.2.4 组织学及免疫荧光染色观察
HE及Masson染色示，PCL组颈动脉管腔肉芽增生严重，管壁为疏松结缔组织结构；WJ/PCL组管腔通畅，且基本维持完整管状结构，管壁可见更加均质成熟的纤维结缔组织。见图5d、e。
免疫荧光染色显示，PCL组SMC、α-SMA染色为阴性，少量CD31阳性染色；而WJ/PCL组见大量SMC、α-SMA、CD31阳性染色。定量分析示，PCL组SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积占比均低于WJ/PCL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5f～i。
3 讨论
人工血管材料的吸附性能在血管重建中起着重要作用，性能良好的材料可以促进细胞附着和增殖，促进血管内皮化，释放生物活性物质，还能改善与周围组织的相容性。这些因素有助于人工血管材料与周围组织良好共生，促进血管再生和愈合，最终实现血管功能的恢复[11]。本研究结果表明，WJ的引入显著提升了PCL亲水性和蛋白吸附性，分析原因为WJ含有多种类型胶原蛋白和黏多糖，这些物质具有良好亲水性和吸附性[12]。
对于人工血管材料，具备适宜的降解性可以促进血管生理结构和功能恢复，降低并发症发生风险，促进组织再生，避免二次手术[13]。因此，降解性是选择人工血管材料时一个重要因素[14]。本研究将PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管浸泡于PBS缓冲溶液中，模拟体内液体环境，观察其在37℃降解情况。结果显示随着浸泡时间延长，PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管均逐渐降解，且后者降解更快。研究表明单纯PCL降解极其缓慢，而WJ作为天然ECM，其胶原等生化成分降解更快[7]。此外，对WJ的脱细胞处理还能进一步加速其降解[15]。
为评估人工血管细胞相容性，本研究将PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管分别与HUVECs在体外共培养。既往研究表明，基于天然来源ECM修饰的人工合成材料可以增强细胞黏附和增殖，因为这种修饰可以改进人工合成材料的生物力学性能、降解性，并引入生物活性分子等[7, 12]。本研究结果显示WJ/PCL可以促进HUVECs黏附和增殖。由于WJ基质来源于人体组织，对细胞没有毒性，能成为促进细胞存活和增殖的有效基质成分。WJ/PCL静电纺丝人工血管的良好细胞相容性为血管重建提供了必要的先决条件。
人工血管免疫反应也是评价其能否用于血管重建的关键因素之一。本研究结果观察了PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管在兔皮下植入后7 d免疫反应，代表植入物早期宿主反应阶段。CD45阳性的白细胞主要在PCL组中出现，而在WJ/PCL组中明显较少。CD163是修复性巨噬细胞M2状态的标志物，CD163阳性细胞在PCL组出现较少，而在WJ/PCL组中明显表达更多。上述结果表明，WJ/PCL静电纺丝人工血管植入兔皮下后免疫反应相对较低。该结果一方面进一步证明脱细胞处理去除了WJ免疫成分，另一方面也表明保留了WJ自身多种活性成分，如黄酮类化合物和多糖类物质，具有抗炎作用。这些成分可以抑制炎症介质释放，减轻炎症反应，从而降低免疫反应[10]。
最后，本研究将WJ/PCL静电纺丝人工血管用于修复兔颈动脉，验证其修复血管的可行性。结果表明，相较于PCL组，WJ/PCL组可以维持管腔直径及血流通畅性。组织学观察示PCL组管腔被异物组织严重堵塞，其管壁主要为疏松结缔组织结构；而WJ/PCL组管腔通畅，基本维持完整圆环状结构，其管壁可见更加均质成熟的纤维结缔组织。最后我们对修复后组织进行免疫荧光染色，从而特异性检测修复后组织的内皮、肌肉和血管再生情况。结果表明，相较于PCL组，WJ/PCL组SMC、α-SMA和CD31阳性染色显著增强，说明WJ引入可以同时促进人工血管内皮化、肌肉化和血管化，其主要原因如下：① 脱细胞后的WJ基质保留了天然WJ组织绝大部分生化成分（包括糖胺聚糖、蛋白质、纤维、透明质酸、羟脯氨酸以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原）[10]，这些天然成分为上皮爬行提供了良好的基质微环境；② 脱细胞后的WJ基质保留了天然WJ组织的生物活性因子（包括VEGF、PDGF、TGF-β1和FGF-2）[10]，这些因子有助于促进上皮化；③ 脱细胞后的WJ基质其良好细胞相容性也为上皮增殖和生长奠定了良好基础；④ WJ/PCL静电纺丝人工血管的抑制溶血性以及血小板沉积性，可以保持管腔良好的管腔通畅度，为上皮化提供了有利生长和爬行空间[10]。
综上述，本研究采用静电纺丝技术成功制备具有典型纳米纤维结构的WJ/PCL静电纺丝人工血管，并在前期研究基础上进一步证实该人工血管具有良好蛋白吸附性能、生物降解性、细胞相容性和较低免疫原性；且初步验证可用于修复兔颈动脉缺损，为血管重建提供了一种极具前景的选择。后续研究中，我们将进一步优化制备工艺、观察动物体内长期修复效果，为其在临床应用提供数据支持。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案获苏州大学附属第一医院伦理委员会批准（SUDA20210711A06）；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0002
作者贡献声明 孙定国：研究设计及实施；何芳龄：数据收集整理及统计分析、经费支持；翟振川：文章撰写及行政支持
据统计，全球每年超过1/3死亡案例与心血管疾病有关，心血管疾病是发病率和致死率极高的疾病之一[1]。对于严重冠状动脉粥样硬化性心脏病，冠状动脉旁路移植被认为是最有效治疗手段。目前，桥血管选择仍以自体血管为主，包括大隐静脉、内乳动脉、桡动脉等[2]。然而，由于这类患者主要是老年人，部分患者外周动脉和静脉存在严重钙化、静脉曲张等问题，不能作为桥血管使用。因此，临床对小口径人工血管（内径<6 mm）需求逐渐增加[3]，但目前尚无此类血管产品。而且相关研究中人工血管移植后再狭窄率高，影响了临床转化，需要进一步研究具有良好生物相容性、适宜降解性、低免疫原性，以及含血管再生所需生物活性成分的人工血管，以降低其移植后的狭窄率[4]。
华通胶（Wharton’s jelly，WJ）是脐带血管周围黏液结缔组织，富含胶原、透明质酸和糖胺聚糖等成分[5]，而这些成分与血管细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成成分相似。此外，WJ包裹脐带动、静脉，使脐带中的血液即使在挤压、扭转等外力作用下也能正常循环[6]，这类似于血管管壁能缓冲减压以及减少变形、损伤和摩擦的功能。上述研究结果提示WJ可能是制备人工血管支架的理想天然材料。然而，WJ本身力学强度相对较弱，且无法单独用于静电纺丝[7]。
聚己内酯（polycaprolactone，PCL）是一种在生物医学和材料科学领域广泛应用的可降解聚合物[8]，已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于临床。PCL具有优异的力学性能以及良好的静电纺丝性能，研究显示采用其制备的静电纺丝纤维具有可调性、可控性以及高比表面积等优点[9]。本课题组前期研究发现采用胰蛋白酶法对WJ基质进行脱细胞处理，可以有效去除WJ细胞核成分，保留糖胺聚糖、蛋白质、纤维、透明质酸和羟脯氨酸等大部分生化成分以及FGF、TGF、PDGF和VEGF等生物活性因子；将PCL与WJ进行混合共纺，成功构建具有典型纳米纤维结构的WJ/PCL静电纺丝人工血管，经检测其具有良好力学性能，可有效抑制血小板黏附[10]。本研究旨在进一步观测WJ/PCL静电纺丝人工血管理化性能、细胞相容性及免疫原性等；同时修复兔颈动脉，观察其用于血管重建的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2月龄雄性新西兰大白兔16只，体质量约2 kg，购自上海允得生物科技有限公司。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）购自亿泽丰生物科技（上海）有限公司。胰蛋白酶、六氟异丙醇、碳二亚胺溶液、FBS、PBS缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、DMEM培养基、牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich公司，美国）；HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8） ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；活/死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。
静电纺丝仪 ［云帆（天津）仪器有限公司］；扫描电镜（Hitachi公司，日本）；荧光显微镜（Leica公司，德国）；Image J软件（美国国立卫生研究院）；傅立叶红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR；Bruker 公司，德国）；材料测试机（上海恒宇仪器有限公司）；全自动接触角试验仪（SITA公司，德国）；酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；电子托盘天平（岛津公司，日本）。
1.2 脱细胞WJ基质的制备
取上海交通大学医学院附属同仁医院妇产科20～30岁健康产妇自愿捐赠的10条新鲜脐带组织，彻底冲洗残留血液后，置于75%乙醇浸泡30 min。剥离脐带组织血管（2条动脉、1条静脉）以及外膜，使用无菌手术剪将分离的WJ切成长度为0.5 cm的小块，置于0.025%胰蛋白酶中（WJ与胰蛋白酶比例为1 g∶5 mL），于37℃用磁力搅拌器搅拌消化24 h；取悬浮液以16 000 ×g离心10 min，100 μm过滤器过滤；收集上清液，加入10% FBS抑制胰蛋白酶反应，将所得脱细胞WJ基质存贮于PBS，4℃保存备用。
1.3 静电纺丝人工血管制备
取脱细胞WJ基质与PCL按照质量比（W/W）50∶50混合，将获得的WJ/PCL混合物溶解于六氟异丙醇，调节溶液浓度为12%（W/V）；磁力搅拌器恒定搅拌24 h，使之完全溶解，得到WJ/PCL纺丝液。应用21G医用金属针头作为喷丝器，拧紧于注射器后，将注射器体部夹于精确注射器泵上。调节静电纺丝仪参数，高压电源15 kV，注射泵层流速度1.0 mL/h，室温25℃，环境湿度40%～50%，静电纺丝时间3～6 h。使用铝箔接地接收，调整接收距离为12 cm。静电纺丝完成后，将样本置于真空室中通风48 h，挥发去除残留有机溶剂；置于PBS缓冲液中，加入碳二亚胺溶液（pH5.5），于−4℃条件下放置24 h进行充分交联处理。取出样本以去离子水冲洗，置于真空冷冻干燥机中冻干，获得WJ/PCL静电纺丝膜。然后参照兔颈动脉尺寸（管壁厚0.2 mm，外径2 mm），将WJ/PCL静电纺丝膜多次缠绕于1.6 mm外径硅胶管，制备管长1.2 cm、管壁厚0.2 mm、外径2 mm的WJ/PCL静电纺丝人工血管。同法制备PCL静电纺丝人工血管，作为对照。后续体外实验直接采用静电纺丝膜进行观测，动物实验采用人工血管进行观测。
1.4 静电纺丝人工血管体外观测
1.4.1 孔隙率测定
采用液体置换法测定孔隙率。取无水乙醇测量体积记为V1；取上述冻干后的两组样品，分别置于无水乙醇中浸泡10 min，测量体积记为V2；最后取出样品，测量剩余无水乙醇体积记为V3。按照以下公式计算孔隙率，孔隙率=（V1−V3）/（V2−V3）×100%。实验重复3次，操作过程注意保持密闭，避免乙醇挥发。
1.4.2 亲水性检测
采用静态接触角测试法检测亲水性。将两组样品裁剪成10 mm×10 mm大小，每组取5个样品，将去离子水滴于样品表面，室温条件下应用全自动接触角试验仪测量表面与液滴形成的接触角（即水珠切线与水平线之间的夹角）。
1.4.3 蛋白吸附性能检测
将两组样品裁剪成直径为5 mm的圆片，每组取5个样品，去离子水漂洗3次，置于0.1 mol/L PBS缓冲液（pH7.4）12 h；取出置于含5 mL牛血清白蛋白溶液（浓度1 mg/mL，pH 7.4）的6孔板中，每孔1个样品，37℃孵育5 min；PBS缓冲液冲洗后，加入2 mL含有十二烷基硫酸钠溶液（pH 7.4）的PBS缓冲液孵育2 h；BCA蛋白检测试剂盒测定样品吸附蛋白量，按照以下公式计算蛋白吸附率，蛋白吸附率=样品吸附蛋白量/样品表面积。
1.4.4 体外降解性能检测
采用称重法测定两组样品在PBS缓冲液中降解程度。取上述冻干后两组样品，首先采用电子托盘天平称重（Wα），然后置于PBS缓冲液于37℃条件下缓慢降解。于浸入后0、1、3、5、7周，每组各取3个样品，同上法冻干后称重（Wβ）。按照以下公式计算各时间点降解率，降解率=（Wα−Wβ）/Wα×100%。
1.4.5 细胞相容性检测
将两组样品剪裁至与24孔板孔径大小一致的圆片状，灭菌处理后置于孔板中，每孔1个样品。取HUVECs加入DMEM培养基制成细胞悬液，接种至24孔板中，每孔1.0×105个。于37℃、5%CO2条件下共培养1、4、7 d，各取5孔采用CCK-8法分析细胞增殖情况，酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，参照活/死细胞染色试剂盒说明进行染色，荧光显微镜下观察，其中死细胞呈红色染色，活细胞呈绿色染色。
1.4.6 兔皮下免疫反应评估
取两组样品剪裁为1 cm×1 cm大小。取6只新西兰大白兔，肌肉注射速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）麻醉后，将样品植入腹部皮下（每组3只动物，每只动物皮下植入1个样品）。植入7 d后同法麻醉动物并取材，分别行CD45、CD163免疫荧光染色，荧光显微镜下见绿色/红色荧光标记为阳性染色；采用Image J软件分别分析CD45、CD163阳性染色面积与总染色面积比值。
1.5 静电纺丝人工血管动物实验
1.5.1 实验分组及方法
取10只新西兰大白兔，采用随机数字表法分为PCL组与WJ/PCL组，每组5只。实验动物同上法麻醉后，于左侧颈部作2 cm长切口，逐层切开皮肤及肌肉，暴露左侧颈动脉并分离，使用2个血管夹夹闭该颈动脉近心端和远心端，2个血管夹间距约2 cm；在血管夹之间剪除1 cm长颈动脉，制备颈动脉缺损模型。然后，取对应的人工血管与残留颈动脉进行端端吻合，重建颈动脉连续性；松开血管夹，见颈动脉血流恢复，确保吻合口无血液漏出。最后关闭切口。见图1。实验动物术后自由活动、饮水和饮食。术后肌肉注射青霉素7 d预防感染，于术后1个月进行观测。
图1
兔颈动脉缺损修复模型制备
a. 暴露左颈动脉；b. 制备颈动脉缺损；c. WJ/PCL静电纺丝人工血管端端吻合修复颈动脉；d. 松开血管夹后颈动脉
Figure1. Preparation of a rabbit carotid artery defect repair modela. Exposure of the left carotid artery; b. Preparation of carotid artery defect; c. End-to-end anastomosis of WJ/PCL electrospun artificial vascular graft to repair the rabbit carotid artery; d. Macroscopic photograph of carotid artery after removing the vascular clamp
1.5.2 观测指标
① 多普勒超声检查：两组实验动物进行多普勒超声检查，观察修复后颈动脉通畅情况，有无扭转、曲折等，同时测量颈动脉管腔直径。
② 大体观察：多普勒超声检查后，两组实验动物注射过量3%异戊巴比妥钠处死，按照原切口入路，显露移植人工血管，观察移植部位有无红肿等炎症反应、组织有无感染等情况。切取修复段血管及其两端2 mm正常血管，通过游标卡尺测量修复段以及正常段血管管腔直径（分别记为Dα、Dβ），按照以下公式计算血管通畅率，血管通畅率=Dα/Dβ×100%。
③ 力学性能观测：取两组标本裁剪成4 cm×1 cm大小，每组取4个样品，分别用夹子固定两端后置于材料测试机，以10 mm/min施加压缩载荷，直至50%压缩位移停止加载，绘制压缩应力-应变曲线；继续加载至样品断裂，计算极限拉伸应力和断裂拉伸率。
④ 组织学及免疫荧光染色观察：将两组标本置于4%多聚甲醛固定，取中段组织切片，片厚5 μm，行HE染色、Masson染色以及平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）、α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及血管内皮细胞（CD31）免疫荧光染色；采用Image J软件分析SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积与总染色面积比值。
1.6 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示；组间比较采用独立样本t检验；两组多个时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用Bonferroni法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 静电纺丝人工血管体外观测
2.1.1 孔隙率测定
PCL组孔隙率为67.22%±2.98%，WJ/PCL组为66.00%± 4.24%，差异无统计学意义（t=0.471，P=0.650）。
2.1.2 亲水性检测
于人工血管表面滴加去离子水3 s后，PCL组仍存在水滴，而WJ/PCL组水滴基本被吸收。PCL组接触角为（80.12±5.93）°，WJ/PCL组为（27.86±3.05）°，差异有统计学意义（t=15.670，P<0.001）。
2.1.3 蛋白吸附性能检测
PCL组蛋白吸附率为（78.12±8.81）μg/cm2，WJ/PCL组为（179.06±9.21）μg/cm2，差异有统计学意义（t=15.830，P<0.001）。
2.1.4 体外降解性能检测
两组人工血管随着在PBS缓冲液中浸泡时间延长均逐渐降解。其中1、3、5、7周时PCL组降解率明显低于WJ/PCL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
图2
两组人工血管降解率变化趋势
Figure2.
Change trends of degradation rates of artificial vascular grafts in the two groups
2.1.5 细胞相容性检测
活/死细胞染色示，共培养7 d内HUVECs在两组人工血管上均存活并增殖，未见红色死细胞，且WJ/PCL组活细胞多于PCL组。CCK-8检测示，两组A值均随培养时间延长而增加，且WJ/PCL组高于PCL组，其中1 d时差异无统计学意义（P>0.05），4、7 d时差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。
图3
两组细胞相容性观察
a. PCL组（上）及WJ/PCL组（下）活/死细胞染色观察（荧光显微镜×40） 从左至右分别为共培养1、4、7 d；b. CCK-8检测
a. Live/dead cell staining observations of the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom) (Fluorescence microscopy×40) From left to right for 1, 4, and 7 days of co-culture; b.
2.1.6 兔皮下免疫反应评估
荧光显微镜观察示，PCL组CD45阳性细胞较多、CD163阳性细胞较少，而WJ/PCL组则相反（图4）。定量分析示，PCL组CD45阳性染色面积占比达71.06%±5.39%，高于WJ/PCL组18.12%±3.70%；CD163阳性染色面积占比为11.20%±2.52%，低于WJ/PCL组27.06%±3.28%；上述指标组间差异均有统计学意义（t=16.190，P<0.001；t=7.674，P<0.001）。
图4
PCL组（上）与WJ/PCL组（下）免疫荧光染色观察（荧光显微镜×40）
从左至右分别为CD45/CD163、DAPI、两者重叠 a. CD45免疫荧光染色；b. CD163免疫荧光染色
Figure4. Immunofluorescence staining observations of the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom) (Fluorescence microscopy×40)From left to right for the images represent CD45/CD163, DAPI, and the merge of the two a. CD45 immunofluorescence staining; b. CD163 immunofluorescence staining
2.2 静电纺丝人工血管动物实验
2.2.1 多普勒超声检查
两组动物均存活至实验完成。术后1个月，多普勒超声检查示WJ/PCL组颈动脉血流通畅性良好，而PCL组血流堵塞。WJ/PCL组管腔直径为（1.82±0.11）mm，PCL组为（0.17±0.12）mm，差异有统计学意义（t=17.010，P<0.001）。见图5a。
图5
PCL组（上）及WJ/PCL组（下）兔颈动脉修复观察
a. 多普勒超声检查 箭头示修复血管范围；b. 大体观察；c. 压缩应力-应变曲线；d. HE染色 （左：×20、右：×40）；e. Masson染色（左：×20、右：×40）；f. SMC免疫荧光染色（荧光显微镜×40）；g. α-SMA免疫荧光染色（荧光显微镜×40）； h. CD31免疫荧光染色（荧光显微镜×40）；i. 两组SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积占比比较
Figure5. Observations of rabbit carotid artery repair in the PCL group (up) and WJ/PCL group (bottom)a. Doppler ultrasound examination Arrow indicated the range of repaired blood vessels; b. Gross observation; c. Compressive stress-strain curve; d. HE staining (left: ×20, right: ×40); e. Masson staining (left: ×20, right: ×40); f. SMC immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); g. α-SMA immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); h. CD31 immunofluorescence staining (Fluorescence microscopy×40); i. Comparison of the positive staining area ratios of SMCs, α-SMA, and CD31 between the two groups
2.2.2 大体观察
两组颈动脉吻合口结合情况良好，均能维持管状结构，WJ/PCL组颈动脉颜色较白，PCL组颜色偏暗黄（更多脓性样组织）。定量分析示，WJ/PCL组血管通畅率为80.0%±5.9%，而PCL组为20.0%±4.9%，差异有统计学意义（t=15.600，P<0.001）。见图5b。
2.2.3 力学性能观测
压缩应力-应变曲线示，随着压缩应变增加，两组压缩应力均呈上升趋势，且WJ/PCL组上升程度大于PCL组（图5c）。PCL组极限拉伸应力低于WJ/PCL组 ［（5.62±0.56）MPa vs （7.20±0.73）MPa］，断裂拉伸率亦低于WJ/PCL组 ［65.62%±3.45% vs 90.00%±3.16%］，差异均有统计学意义（t=3.428，P=0.009；t=10.430，P<0.001）。
2.2.4 组织学及免疫荧光染色观察
HE及Masson染色示，PCL组颈动脉管腔肉芽增生严重，管壁为疏松结缔组织结构；WJ/PCL组管腔通畅，且基本维持完整管状结构，管壁可见更加均质成熟的纤维结缔组织。见图5d、e。
免疫荧光染色显示，PCL组SMC、α-SMA染色为阴性，少量CD31阳性染色；而WJ/PCL组见大量SMC、α-SMA、CD31阳性染色。定量分析示，PCL组SMC、α-SMA、CD31阳性染色面积占比均低于WJ/PCL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5f～i。
3 讨论
人工血管材料的吸附性能在血管重建中起着重要作用，性能良好的材料可以促进细胞附着和增殖，促进血管内皮化，释放生物活性物质，还能改善与周围组织的相容性。这些因素有助于人工血管材料与周围组织良好共生，促进血管再生和愈合，最终实现血管功能的恢复[11]。本研究结果表明，WJ的引入显著提升了PCL亲水性和蛋白吸附性，分析原因为WJ含有多种类型胶原蛋白和黏多糖，这些物质具有良好亲水性和吸附性[12]。
对于人工血管材料，具备适宜的降解性可以促进血管生理结构和功能恢复，降低并发症发生风险，促进组织再生，避免二次手术[13]。因此，降解性是选择人工血管材料时一个重要因素[14]。本研究将PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管浸泡于PBS缓冲溶液中，模拟体内液体环境，观察其在37℃降解情况。结果显示随着浸泡时间延长，PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管均逐渐降解，且后者降解更快。研究表明单纯PCL降解极其缓慢，而WJ作为天然ECM，其胶原等生化成分降解更快[7]。此外，对WJ的脱细胞处理还能进一步加速其降解[15]。
为评估人工血管细胞相容性，本研究将PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管分别与HUVECs在体外共培养。既往研究表明，基于天然来源ECM修饰的人工合成材料可以增强细胞黏附和增殖，因为这种修饰可以改进人工合成材料的生物力学性能、降解性，并引入生物活性分子等[7, 12]。本研究结果显示WJ/PCL可以促进HUVECs黏附和增殖。由于WJ基质来源于人体组织，对细胞没有毒性，能成为促进细胞存活和增殖的有效基质成分。WJ/PCL静电纺丝人工血管的良好细胞相容性为血管重建提供了必要的先决条件。
人工血管免疫反应也是评价其能否用于血管重建的关键因素之一。本研究结果观察了PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管在兔皮下植入后7 d免疫反应，代表植入物早期宿主反应阶段。CD45阳性的白细胞主要在PCL组中出现，而在WJ/PCL组中明显较少。CD163是修复性巨噬细胞M2状态的标志物，CD163阳性细胞在PCL组出现较少，而在WJ/PCL组中明显表达更多。上述结果表明，WJ/PCL静电纺丝人工血管植入兔皮下后免疫反应相对较低。该结果一方面进一步证明脱细胞处理去除了WJ免疫成分，另一方面也表明保留了WJ自身多种活性成分，如黄酮类化合物和多糖类物质，具有抗炎作用。这些成分可以抑制炎症介质释放，减轻炎症反应，从而降低免疫反应[10]。
最后，本研究将WJ/PCL静电纺丝人工血管用于修复兔颈动脉，验证其修复血管的可行性。结果表明，相较于PCL组，WJ/PCL组可以维持管腔直径及血流通畅性。组织学观察示PCL组管腔被异物组织严重堵塞，其管壁主要为疏松结缔组织结构；而WJ/PCL组管腔通畅，基本维持完整圆环状结构，其管壁可见更加均质成熟的纤维结缔组织。最后我们对修复后组织进行免疫荧光染色，从而特异性检测修复后组织的内皮、肌肉和血管再生情况。结果表明，相较于PCL组，WJ/PCL组SMC、α-SMA和CD31阳性染色显著增强，说明WJ引入可以同时促进人工血管内皮化、肌肉化和血管化，其主要原因如下：① 脱细胞后的WJ基质保留了天然WJ组织绝大部分生化成分（包括糖胺聚糖、蛋白质、纤维、透明质酸、羟脯氨酸以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原）[10]，这些天然成分为上皮爬行提供了良好的基质微环境；② 脱细胞后的WJ基质保留了天然WJ组织的生物活性因子（包括VEGF、PDGF、TGF-β1和FGF-2）[10]，这些因子有助于促进上皮化；③ 脱细胞后的WJ基质其良好细胞相容性也为上皮增殖和生长奠定了良好基础；④ WJ/PCL静电纺丝人工血管的抑制溶血性以及血小板沉积性，可以保持管腔良好的管腔通畅度，为上皮化提供了有利生长和爬行空间[10]。
综上述，本研究采用静电纺丝技术成功制备具有典型纳米纤维结构的WJ/PCL静电纺丝人工血管，并在前期研究基础上进一步证实该人工血管具有良好蛋白吸附性能、生物降解性、细胞相容性和较低免疫原性；且初步验证可用于修复兔颈动脉缺损，为血管重建提供了一种极具前景的选择。后续研究中，我们将进一步优化制备工艺、观察动物体内长期修复效果，为其在临床应用提供数据支持。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案获苏州大学附属第一医院伦理委员会批准（SUDA20210711A06）；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0002
作者贡献声明 孙定国：研究设计及实施；何芳龄：数据收集整理及统计分析、经费支持；翟振川：文章撰写及行政支持
