引用本文： 宋建国, 林浩东. 硒-甲基硒代半胱氨酸促进周围神经再生的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(5): 598-607. doi: 10.7507/1002-1892.202402031 复制
近年来，周围神经损伤发生率居高不下，多由交通事故等外伤引起[1-2]。与中枢神经相比，周围神经往往具有一定再生能力[3-4]，但再生能力有限；相较于短距离神经缺损，长距离神经缺损修复是目前临床治疗难点。自体神经因具有无毒、无免疫原性和良好生物相容性，成为目前治疗长距离神经缺损的“金标准”[5-6]，但存在供区损伤严重、易形成神经瘤、供体神经来源有限、供体神经长短不匹配、愈合时间较长等不足[7]。
氧化应激是周围神经损伤后神经元死亡和轴突脱髓鞘的主要原因之一[8]。 受损神经具有产生相应抗氧化物质来中和自由基（reactive oxygen species，ROS）的能力。然而，ROS的积累是不受控制的，在损伤后的氧化应激反应中，抗氧化防御系统对ROS的清除能力可能不足[9]。这种持续累积的状态削弱了神经修复和功能恢复水平；同时，氧化应激因子可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路导致神经细胞凋亡损伤，引起神经营养障碍[10]，从而阻碍了神经再生。p38MAPK 蛋白同时作为神经髓鞘形成的负性调节因素[11]，能够抑制周围神经系统髓鞘形成。硒（selenium，Se）是人体必需元素，在体内是清除ROS的谷胱甘肽过氧化物酶的主要成分[12]，有卓越的抗氧化应激和抗炎能力[13]。大量研究表明，Se可降低患一系列癌症的风险，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等[14]。Se也被证明与DNA损伤和氧化应激相关，可以增强免疫监视和调节细胞增殖[15]。而且与其他生物制品中的ROS清除剂相比，Se更稳定、更经济[16]。硒-甲基硒代半胱氨酸（Se-methylselenocysteine，SMC）被认为是对人体最有益的Se化合物，它作为一种有机Se，相比无机Se具有更大生物活性和更小毒性[17]。已有研究证实SMC在阿尔兹海默症小鼠中可提高抗氧化能力，调节氨基酸代谢，改善突触缺陷，从而提高小鼠认知能力[18]。另外有研究者发现SMC具有一定抑菌功能，其可通过抑制氧化应激促进断奶大鼠生长发育和缓解心肌组织及膝关节病变[19-20]。但是，SMC在周围神经再生中是否起作用，以及是否可通过抗氧化应激抑制p38MAPK通路，最终促进轴突髓鞘形成尚无相关研究。鉴于此，本研究探讨SMC对周围神经再生的影响及其相关作用机制，以期为临床治疗周围神经损伤提供一种有前景的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4周龄SD雄性大鼠36只，体质量220～240 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；大鼠雪旺细胞RSC96细胞由中国科学院细胞库提供。
SMC（上海MCE公司）；异氟烷（上海生工生物工程股份有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）ELISA检测试剂盒，ROS试剂盒和MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM基础培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、p38MAPK抗体、磷酸化p38MAPK（phosphorylation p38MAPK，p-p38MAPK）抗体、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）抗体、核因子红细胞系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗体、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein，MBP）抗体（Abcam公司，美国）；蛋白提取试剂盒、超敏ECL发光检测液（南京诺维赞生物科技股份有限公司）；大鼠IL-6、IL-10、IL-17 ELISA检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；H2O2（上海默克公司）。
共聚焦免疫荧光显微镜、超薄石蜡切片机（Leica公司，德国）；酶标分析仪（Molecular Devices 公司，美国）；恒温CO2培养箱、超净工作台（Thermo Scientific公司，美国）；肌电仪（浙江海神科技有限公司）；透射电镜（电子株式会社，日本）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）；GraphPad Prism 10.0 软件（GraphPad Software公司，美国）。
1.2 SMC对雪旺细胞增殖及ROS水平的影响
1.2.1 细胞培养及分组
取RSC96细胞接种于含10%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、96%湿度培养箱中培养，待细胞生长至培养皿底面积90%时进行传代，取第3代后细胞进行后续实验。将细胞以5×103个/mL密度接种于培养皿内，随机分为5组，分别为A组（无任何处理，作为对照组）、B组（加入100 μmol/L H2O2）、C组（加入100 μmol/L H2O2+100 μmol/L SMC）、D组（加入100 μmol/L H2O2+200 μmol/L SMC）、E组（加入100 μmol/L H2O2+400 μmol/L SMC）。
1.2.2 细胞毒性检测
各组细胞处理24 h后弃上清，每组加入20 μL MTT溶液，于37℃、5%CO2、96%湿度培养箱继续培养4 h，加入Formazan溶解液再孵育4 h，然后采用酶标分析仪于波长570 nm处检测吸光度（A）值，每组测量3孔，计算B～E组细胞抑制率，公式为：（A组A值−B～E任一组A值）/A组A值），筛选保护细胞活性的最佳药物浓度组进行后续实验。
1.2.3 ROS水平测量
取第3代RSC96细胞以5×103个/mL密度接种于培养皿内，随机分为3组，分别以A、B组及上述筛选的最佳药物浓度组方法处理细胞。将各组处理24 h细胞以2×106个/mL密度悬浮于10 μmol/L DCFH-DA溶液中孵育20 min，共聚焦免疫荧光显微镜观察，每组随机选3个视野，通过Image J软件测量并按照以下公式计算ROS荧光强度：区域灰度值总和/区域总面积。
1.3 SMC 对神经损伤大鼠的治疗作用及机制研究
1.3.1 动物分组及造模方法
取36只SD大鼠随机分为3组，分别为假手术组（Sham组）、坐骨神经损伤组（PNI组）及SMC治疗组（SMC组），每组12只。3组大鼠采用异氟烷麻醉后，暴露右侧梨状肌下缘1 cm处坐骨神经，Sham组立即进行缝合，正常喂食、水；其余两组大鼠制备坐骨神经损伤模型。坐骨神经暴露后用大止血钳夹闭坐骨神经干，夹满3扣，挤压5 s后松开止血钳，间隔10 s后再夹闭5 s，再放松10 s，第3次再夹闭5 s；神经干挤压伤宽度约5 mm，此时可见损伤神经呈透明扁平状，周围血肿形成，保证神经仍具有连续性；9-0无创缝线标记后将坐骨神经返回原位，随后分层缝合。PNI组大鼠正常喂食、水，SMC组大鼠于每日饮用水中加入0.75 mg/kg SMC[21]。
1.3.2 神经电生理检测
术后4周每组取3只大鼠，将大鼠俯卧于手术台上，四肢固定在操作板上，小心逐层剥离找到损伤处坐骨神经，刺激电极插入坐骨粗结节下方坐骨神经两侧，腓肠肌中端放置记录电极，接地电极黏贴于大鼠尾部；然后行强度2 mV、波宽3 ms的电刺激坐骨神经，观察并记录复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）的最高电位。采用双人双盲法，实验重复3次，取均值。
1.3.3 血清炎症因子和氧化应激因子检测
术后4周取上述电生理检测后的各组3只大鼠，用异氟烷麻醉后取颈动脉血2 mL，采用ELISA试剂盒检测炎症因子IL-17、IL-6、IL-10和氧化应激因子CAT、SOD、MDA水平。
1.3.4 劳克坚劳蓝（luxol fast blue，LFB）染色
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，置于4%多聚甲醛固定，24 h后修块、脱水、石蜡包埋，制备4 mm厚切片，脱蜡后行LFB染色观察再生髓鞘情况。每组随机选取3个视野，采用Image J软件计算髓鞘密度。
1.3.5 免疫荧光染色
术后4周取上述部分切片行免疫荧光染色。乙醇梯度脱水后，EDTA修复液抗原修复；0.2%Triton X-100溶液避光条件下透膜15 min，1%牛血清白蛋白室温封闭1.5 h；去除封闭液，滴加GFAP（1∶1 000）、MBP（1∶500）一抗，4℃过夜；PBS漂洗3次，滴加对应二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG），4℃湿盒内孵育2 h；PBS漂洗后滴入含DAPI的防淬灭封片剂，封片，共聚焦免疫荧光显微镜观察。
1.3.6 透射电镜观察
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，置于2.5%戊二醛缓冲液中4℃过夜，然后用1%锇酸溶液固定1.5 h；弃固定液，用0.1 mol/L PBS漂洗样品3次，每次15 min；梯度浓度乙醇脱水，每种浓度处理15 min，然后包埋、修为梯形，切片，片厚80 mm，经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min，透射电镜观察髓鞘形态，每组随机选取3个视野，用Image J软件测量轴突直径，取均值。
1.3.7 Western blot检测
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后，低温（4℃）以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，行组织研磨裂解，经BCA法评估蛋白浓度，并上样、电泳、转膜及封闭；滴加 p38MAPK（1∶1 000）、p-p38MAPK（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）一抗4℃过夜，洗膜后孵育二抗。加入ECL显影液曝光拍照，采用Image J软件分析目的蛋白灰度，计算目的蛋白相对表达量（即HO-1/β-actin、Nrf2/β-actin、p-p38MAPK/p38MAPK）。
1.4 统计学方法
采用SPSS27.0统计软件进行分析。计量资料经Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMC对雪旺细胞增殖及ROS水平的影响
MTT法检测示，B～E组细胞抑制率分别为71.36%±1.35%、35.65%±2.32%、33.17%±2.50%、32.43%±1.56%。C～E组细胞抑制率显著低于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C～E组间差异无统计学意义（P>0.05）。低浓度SMC即可促进雪旺细胞增殖并发挥保护雪旺细胞的功能，因此选择C组进入后续实验。
ROS免疫荧光检测示，A、B、C组ROS荧光强度分别为（1.325±0.169）、（7.948±0.864）、（2.459±0.687）AU，B组ROS荧光强度显著高于A、C组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。
图1
各组细胞处理48 h后ROS免疫荧光检测（共聚焦免疫荧光显微镜×63）
从左至右分别为ROS染色、Hoechst染色、二者重叠 a. A组；b. B组；c. C组
Figure1. ROS immunofluorescence detection of cells in each group after 48 hours of treatment (Confocal immunofluorescence microscope×63)From left to right for ROS staining, Hoechst staining, and merge, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.2 SMC 对神经损伤大鼠的治疗作用及机制研究
2.2.1 神经电生理检测
3组中SMC组CMAP最高电位最大、Sham组次之、PNI组最小，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图2。
表1
3组大鼠各检测指标组间比较（n=3，x±s）
Table1.
Comparison of detection indicators among three groups of rats (n=3, x±s)
图2
术后4周3组大鼠神经电生理检测
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组
Figure2. Neurophysiological detection in 3 groups of rats at 4 weeks after operationFrom left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively
2.2.2 血清炎症因子和氧化应激因子检测
与Sham组比较，PNI组血清IL-10、SOD和CAT水平显著降低，IL-6、IL-17和MDA水平明显上升；与PNI组比较，SMC组血清IL-10、SOD和CAT水平显著上升，IL-6、IL-17和MDA水平明显下降；各组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.2.3 LFB染色
PNI组周围组织较为稀疏，神经纤维面积明显减少，单位面积髓鞘数量也大幅度降低，白质缺损；而Sham组和SMC组损伤较轻，可见大块连续的髓鞘蓝染结构。SMC组髓鞘密度最大、Sham组次之、PNI组最小，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图3。
图3
术后4周3组大鼠LFB染色观察（共聚焦免疫荧光显微镜×63）
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组，箭头示髓鞘阳性区域
Figure3. LFB staining observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operation (Confocal immunofluorescence microscope×63)From left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively, with arrows indicating myelin-positive areas
2.2.4 免疫荧光染色
与Sham组比较，PNI组GFAP和MBP 荧光强度明显下降，神经丝点状分布，难以见到完整神经元，神经纤维数量较少；与PNI组比较，SMC组GFAP和MBP荧光强度明显上升，神经元结构规整，排列致密。见图4。
图4
术后4周3组大鼠免疫荧光染色观察（共聚焦免疫荧光显微镜×40）
从左至右分别为GFAP染色、MBP染色、二者重叠 a. Sham组；b. PNI组；c. SMC组
Figure4. Immunofluorescence staining observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operation (Confocal immunofluorescence microscope×40)From left to right for GFAP staining, MBP staining, and merge, respectively a. Sham group; b. PNI group; c. SMC group
2.2.5 透射电镜观察
与Sham组比较，PNI组轴突直径明显减小，而SMC组轴突直径较PNI组大幅度增加，形态更为规整。各组轴突直径比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图5。
图5
术后4周3组大鼠透射电镜观察
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组 a. ×200；b. ×800
Figure5. Transmission electron microscopy observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operationFrom left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively a. ×200; b. ×800
2.2.6 Western blot检测
PNI组HO-1、Nrf2蛋白相对表达量显著高于Sham组，SMC组显著高于PNI组；PNI组p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达量比值显著高于Sham组，SMC组显著低于PNI组；上述组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图6。
图6
术后4周Western blot 检测3组大鼠各蛋白表达凝胶电泳图
Mr：相对分子质量 1：Sham 组 2：PNI组 3：SMC 组
Figure6. Gel electrophoresis of each protein expression in 3 groups of rats detected by Western blot at 4 weeks after operationMr: Relative molecular mass 1: Sham group 2: PNI group 3: SMC group
表2
3组大鼠各检测指标两两比较
Table2.
Pairwise comparison of various detection indicators among three groups of rats
3 讨论
因交通事故创伤、肿瘤切除等原因造成的周围神经损伤是目前常见疾病之一[22]，近年发病率不断上升，长时间疼痛和感觉缺失严重影响患者生活质量[23]。寻找一种治疗周围神经损伤的有效药物非常必要。本研究中，我们通过细胞实验验证了低浓度SMC即可达到有效保护雪旺细胞免受氧化应激损伤的作用，因此后续均选取低浓度SMC进行实验，这是因为Se的治疗窗口比较狭窄[24]，过量容易产生过高的细胞毒性，不利于神经愈合。
本研究初步探索了SMC在周围神经损伤中的作用和机制。LFB染色发现SMC治疗后神经排列有序，髓鞘紧致密集，髓鞘密度远大于PNI组。神经电生理测试是衡量神经再生和功能修复的重要指标[25]，SMC治疗后在同样电刺激下，CMAP最高电位远大于PNI组，而CMAP最高电位差异同样反映了术后神经再生速度，这也与LFB染色结果相印证，SMC可以增加神经电信号传导，诱导轴突再生。
髓鞘是螺旋围绕包裹周围神经系统轴突的雪旺细胞质膜。髓鞘不仅对动作电位的快速传导至关重要，对维持轴突完整性也很重要[26]。MBP是周围神经系统中的主要髓鞘成分，位于髓鞘主要致密线的细胞质附着处[27]。许多研究表明，带正电荷的MBP与带负电荷的细胞质膜表面相互作用，这种结合可能对髓鞘的组装至关重要[28]。GFAP是中间丝家族蛋白的神经胶质特异性成员，出现在雪旺细胞发育的相对较晚阶段[29]，主要是在未成熟的雪旺细胞形成时，并且在形成髓鞘的雪旺细胞中下调[30]。本研究发现术后4周，SMC组GFAP和MBP荧光强度均显著上调，这也与LFB染色中髓鞘密度增加趋势保持一致。同时透射电镜以更微观的角度反映了SMC治疗神经损伤的有效性，结果显示术后4周SMC组轴突直径均明显大于PNI组。进一步提示SMC可能通过促进髓鞘形成，增加轴突再生能力并加快神经恢复。
MAPK是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可被不同细胞内外因素刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激等激活[31]，p38MAPK可被蛋白激酶磷酸化从而发挥其活性功能，参与细胞增殖分化等。近年研究表明，p38MAPK通路在神经损伤及痛觉敏感中发挥重要作用[32]；另有研究表明p38MAPK通路激活可促进雪旺细胞凋亡和增加炎症因子表达[33]。而氧化应激同样可促进p38MAPK磷酸化导致神经传导异常[34]。本研究发现神经损伤后p38MAPK磷酸化程度显著上升，加入SMC后p38MAPK磷酸化程度明显下降，这也与轴突再生程度相对应，表明SMC可能通过抑制p38MAPK通路磷酸化，从而起到促进髓鞘形成、加速神经修复的作用。
既往有研究显示神经损伤后，ROS产生过多及氧化因子过多累积往往是影响周围神经再生的重要因素[35]。因为增加氧化应激刺激会影响溶酶体降解，同时ROS过量生成会导致DNA和蛋白质等大分子变性[36]，致雪旺细胞损伤并大量死亡，而雪旺细胞分泌的神经营养因子可以减少神经元变性死亡并促进髓鞘再生[37]，所以氧化应激会明显抑制髓鞘形成和神经再生。本研究中体外细胞ROS免疫荧光染色结果显示，SMC治疗后ROS生成显著减少，提示SMC可以通过抑制ROS水平起到抗氧化应激作用。此外，Nrf2蛋白是属于亮氨酸调节蛋白家族，是机体调节氧化应激通路中的重要转录因子，以维持正常的线粒体功能和细胞稳态[38]。Nrf2可易位入细胞核与相应反应元件结合，从而激活一系列抗氧化保护因子表达，最终引起Nrf2 依赖性HO-1的表达上调[39]。HO-1是HO的3种同工酶之一，也是唯一一种在各种氧化应激因素刺激下可以迅速产生的蛋白质[40]；它可催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳和游离铁，其中一氧化碳起着核心作用[41]，作用于细胞代谢，以保护细胞免受氧化应激并调节炎症因子的产生。本研究中Western blot检测示神经损伤后，抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1）表达增加，而在加入SMC治疗后，抗氧化蛋白表达水平进一步上升，提示SMC可能通过促进Nrf2/HO-1信号通路起到抑制氧化应激水平的作用。ROS如超氧自由基和活性羟基自由基通过氧化细胞膜脂质破坏细胞，这一过程被称为脂质过氧化[42]，并产生细胞毒性物质，如MDA等。本研究结果显示MDA水平在神经损伤后显著上升，SMC治疗后显著下降，同时抗氧化因子（SOD、CAT）水平也在SMC治疗后明显上升，说明SMC可以显著抑制神经损伤后的脂质过氧化水平。
周围神经损伤后，远端神经会发生Wallerian变性[43]，巨噬细胞等会释放大量促炎因子，炎症因子过多聚集会拖累神经再生速度[44]。本研究中发现SMC可以明显减低炎症因子（IL-6、IL-17）水平，显著增加抗炎因子（IL-10）水平，提示SMC可以降低神经损伤后的炎症反应，从而为神经再生创造良好微环境。
综上述，SMC通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制神经损伤后的氧化应激反应和ROS水平，抑制了损伤后炎症反应程度，进而促进了雪旺细胞增殖并抑制了p38MAPK通路磷酸化，最终促进髓鞘形成和加快周围神经再生，本研究为周围神经损伤治疗提供了新思路。但本研究也存在一定局限性，p38MAPK通路磷酸化过程可能与多个生物学过程相互串联，我们并未对其中的因果关系进行研究，后续将进一步研究明确其确切调控作用。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经上海交通大学医学院附属第一人民医院医学伦理委员会批准（2022AW022）；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0028
作者贡献声明 宋建国：研究实施，数据分析，文章撰写；林浩东：资金提供及对文章内容作批评性审阅
近年来，周围神经损伤发生率居高不下，多由交通事故等外伤引起[1-2]。与中枢神经相比，周围神经往往具有一定再生能力[3-4]，但再生能力有限；相较于短距离神经缺损，长距离神经缺损修复是目前临床治疗难点。自体神经因具有无毒、无免疫原性和良好生物相容性，成为目前治疗长距离神经缺损的“金标准”[5-6]，但存在供区损伤严重、易形成神经瘤、供体神经来源有限、供体神经长短不匹配、愈合时间较长等不足[7]。
氧化应激是周围神经损伤后神经元死亡和轴突脱髓鞘的主要原因之一[8]。 受损神经具有产生相应抗氧化物质来中和自由基（reactive oxygen species，ROS）的能力。然而，ROS的积累是不受控制的，在损伤后的氧化应激反应中，抗氧化防御系统对ROS的清除能力可能不足[9]。这种持续累积的状态削弱了神经修复和功能恢复水平；同时，氧化应激因子可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路导致神经细胞凋亡损伤，引起神经营养障碍[10]，从而阻碍了神经再生。p38MAPK 蛋白同时作为神经髓鞘形成的负性调节因素[11]，能够抑制周围神经系统髓鞘形成。硒（selenium，Se）是人体必需元素，在体内是清除ROS的谷胱甘肽过氧化物酶的主要成分[12]，有卓越的抗氧化应激和抗炎能力[13]。大量研究表明，Se可降低患一系列癌症的风险，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等[14]。Se也被证明与DNA损伤和氧化应激相关，可以增强免疫监视和调节细胞增殖[15]。而且与其他生物制品中的ROS清除剂相比，Se更稳定、更经济[16]。硒-甲基硒代半胱氨酸（Se-methylselenocysteine，SMC）被认为是对人体最有益的Se化合物，它作为一种有机Se，相比无机Se具有更大生物活性和更小毒性[17]。已有研究证实SMC在阿尔兹海默症小鼠中可提高抗氧化能力，调节氨基酸代谢，改善突触缺陷，从而提高小鼠认知能力[18]。另外有研究者发现SMC具有一定抑菌功能，其可通过抑制氧化应激促进断奶大鼠生长发育和缓解心肌组织及膝关节病变[19-20]。但是，SMC在周围神经再生中是否起作用，以及是否可通过抗氧化应激抑制p38MAPK通路，最终促进轴突髓鞘形成尚无相关研究。鉴于此，本研究探讨SMC对周围神经再生的影响及其相关作用机制，以期为临床治疗周围神经损伤提供一种有前景的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4周龄SD雄性大鼠36只，体质量220～240 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；大鼠雪旺细胞RSC96细胞由中国科学院细胞库提供。
SMC（上海MCE公司）；异氟烷（上海生工生物工程股份有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）ELISA检测试剂盒，ROS试剂盒和MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM基础培养基、FBS（GIBCO公司，美国）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、p38MAPK抗体、磷酸化p38MAPK（phosphorylation p38MAPK，p-p38MAPK）抗体、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）抗体、核因子红细胞系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗体、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein，MBP）抗体（Abcam公司，美国）；蛋白提取试剂盒、超敏ECL发光检测液（南京诺维赞生物科技股份有限公司）；大鼠IL-6、IL-10、IL-17 ELISA检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；H2O2（上海默克公司）。
共聚焦免疫荧光显微镜、超薄石蜡切片机（Leica公司，德国）；酶标分析仪（Molecular Devices 公司，美国）；恒温CO2培养箱、超净工作台（Thermo Scientific公司，美国）；肌电仪（浙江海神科技有限公司）；透射电镜（电子株式会社，日本）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）；GraphPad Prism 10.0 软件（GraphPad Software公司，美国）。
1.2 SMC对雪旺细胞增殖及ROS水平的影响
1.2.1 细胞培养及分组
取RSC96细胞接种于含10%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、96%湿度培养箱中培养，待细胞生长至培养皿底面积90%时进行传代，取第3代后细胞进行后续实验。将细胞以5×103个/mL密度接种于培养皿内，随机分为5组，分别为A组（无任何处理，作为对照组）、B组（加入100 μmol/L H2O2）、C组（加入100 μmol/L H2O2+100 μmol/L SMC）、D组（加入100 μmol/L H2O2+200 μmol/L SMC）、E组（加入100 μmol/L H2O2+400 μmol/L SMC）。
1.2.2 细胞毒性检测
各组细胞处理24 h后弃上清，每组加入20 μL MTT溶液，于37℃、5%CO2、96%湿度培养箱继续培养4 h，加入Formazan溶解液再孵育4 h，然后采用酶标分析仪于波长570 nm处检测吸光度（A）值，每组测量3孔，计算B～E组细胞抑制率，公式为：（A组A值−B～E任一组A值）/A组A值），筛选保护细胞活性的最佳药物浓度组进行后续实验。
1.2.3 ROS水平测量
取第3代RSC96细胞以5×103个/mL密度接种于培养皿内，随机分为3组，分别以A、B组及上述筛选的最佳药物浓度组方法处理细胞。将各组处理24 h细胞以2×106个/mL密度悬浮于10 μmol/L DCFH-DA溶液中孵育20 min，共聚焦免疫荧光显微镜观察，每组随机选3个视野，通过Image J软件测量并按照以下公式计算ROS荧光强度：区域灰度值总和/区域总面积。
1.3 SMC 对神经损伤大鼠的治疗作用及机制研究
1.3.1 动物分组及造模方法
取36只SD大鼠随机分为3组，分别为假手术组（Sham组）、坐骨神经损伤组（PNI组）及SMC治疗组（SMC组），每组12只。3组大鼠采用异氟烷麻醉后，暴露右侧梨状肌下缘1 cm处坐骨神经，Sham组立即进行缝合，正常喂食、水；其余两组大鼠制备坐骨神经损伤模型。坐骨神经暴露后用大止血钳夹闭坐骨神经干，夹满3扣，挤压5 s后松开止血钳，间隔10 s后再夹闭5 s，再放松10 s，第3次再夹闭5 s；神经干挤压伤宽度约5 mm，此时可见损伤神经呈透明扁平状，周围血肿形成，保证神经仍具有连续性；9-0无创缝线标记后将坐骨神经返回原位，随后分层缝合。PNI组大鼠正常喂食、水，SMC组大鼠于每日饮用水中加入0.75 mg/kg SMC[21]。
1.3.2 神经电生理检测
术后4周每组取3只大鼠，将大鼠俯卧于手术台上，四肢固定在操作板上，小心逐层剥离找到损伤处坐骨神经，刺激电极插入坐骨粗结节下方坐骨神经两侧，腓肠肌中端放置记录电极，接地电极黏贴于大鼠尾部；然后行强度2 mV、波宽3 ms的电刺激坐骨神经，观察并记录复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）的最高电位。采用双人双盲法，实验重复3次，取均值。
1.3.3 血清炎症因子和氧化应激因子检测
术后4周取上述电生理检测后的各组3只大鼠，用异氟烷麻醉后取颈动脉血2 mL，采用ELISA试剂盒检测炎症因子IL-17、IL-6、IL-10和氧化应激因子CAT、SOD、MDA水平。
1.3.4 劳克坚劳蓝（luxol fast blue，LFB）染色
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，置于4%多聚甲醛固定，24 h后修块、脱水、石蜡包埋，制备4 mm厚切片，脱蜡后行LFB染色观察再生髓鞘情况。每组随机选取3个视野，采用Image J软件计算髓鞘密度。
1.3.5 免疫荧光染色
术后4周取上述部分切片行免疫荧光染色。乙醇梯度脱水后，EDTA修复液抗原修复；0.2%Triton X-100溶液避光条件下透膜15 min，1%牛血清白蛋白室温封闭1.5 h；去除封闭液，滴加GFAP（1∶1 000）、MBP（1∶500）一抗，4℃过夜；PBS漂洗3次，滴加对应二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG），4℃湿盒内孵育2 h；PBS漂洗后滴入含DAPI的防淬灭封片剂，封片，共聚焦免疫荧光显微镜观察。
1.3.6 透射电镜观察
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，置于2.5%戊二醛缓冲液中4℃过夜，然后用1%锇酸溶液固定1.5 h；弃固定液，用0.1 mol/L PBS漂洗样品3次，每次15 min；梯度浓度乙醇脱水，每种浓度处理15 min，然后包埋、修为梯形，切片，片厚80 mm，经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min，透射电镜观察髓鞘形态，每组随机选取3个视野，用Image J软件测量轴突直径，取均值。
1.3.7 Western blot检测
术后4周每组取3只大鼠，用异氟烷麻醉后，低温（4℃）以右侧损伤处为中心取坐骨神经5 mm，行组织研磨裂解，经BCA法评估蛋白浓度，并上样、电泳、转膜及封闭；滴加 p38MAPK（1∶1 000）、p-p38MAPK（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）一抗4℃过夜，洗膜后孵育二抗。加入ECL显影液曝光拍照，采用Image J软件分析目的蛋白灰度，计算目的蛋白相对表达量（即HO-1/β-actin、Nrf2/β-actin、p-p38MAPK/p38MAPK）。
1.4 统计学方法
采用SPSS27.0统计软件进行分析。计量资料经Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SMC对雪旺细胞增殖及ROS水平的影响
MTT法检测示，B～E组细胞抑制率分别为71.36%±1.35%、35.65%±2.32%、33.17%±2.50%、32.43%±1.56%。C～E组细胞抑制率显著低于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C～E组间差异无统计学意义（P>0.05）。低浓度SMC即可促进雪旺细胞增殖并发挥保护雪旺细胞的功能，因此选择C组进入后续实验。
ROS免疫荧光检测示，A、B、C组ROS荧光强度分别为（1.325±0.169）、（7.948±0.864）、（2.459±0.687）AU，B组ROS荧光强度显著高于A、C组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。
图1
各组细胞处理48 h后ROS免疫荧光检测（共聚焦免疫荧光显微镜×63）
从左至右分别为ROS染色、Hoechst染色、二者重叠 a. A组；b. B组；c. C组
Figure1. ROS immunofluorescence detection of cells in each group after 48 hours of treatment (Confocal immunofluorescence microscope×63)From left to right for ROS staining, Hoechst staining, and merge, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.2 SMC 对神经损伤大鼠的治疗作用及机制研究
2.2.1 神经电生理检测
3组中SMC组CMAP最高电位最大、Sham组次之、PNI组最小，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图2。
表1
3组大鼠各检测指标组间比较（n=3，x±s）
Table1.
Comparison of detection indicators among three groups of rats (n=3, x±s)
图2
术后4周3组大鼠神经电生理检测
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组
Figure2. Neurophysiological detection in 3 groups of rats at 4 weeks after operationFrom left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively
2.2.2 血清炎症因子和氧化应激因子检测
与Sham组比较，PNI组血清IL-10、SOD和CAT水平显著降低，IL-6、IL-17和MDA水平明显上升；与PNI组比较，SMC组血清IL-10、SOD和CAT水平显著上升，IL-6、IL-17和MDA水平明显下降；各组两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.2.3 LFB染色
PNI组周围组织较为稀疏，神经纤维面积明显减少，单位面积髓鞘数量也大幅度降低，白质缺损；而Sham组和SMC组损伤较轻，可见大块连续的髓鞘蓝染结构。SMC组髓鞘密度最大、Sham组次之、PNI组最小，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图3。
图3
术后4周3组大鼠LFB染色观察（共聚焦免疫荧光显微镜×63）
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组，箭头示髓鞘阳性区域
Figure3. LFB staining observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operation (Confocal immunofluorescence microscope×63)From left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively, with arrows indicating myelin-positive areas
2.2.4 免疫荧光染色
与Sham组比较，PNI组GFAP和MBP 荧光强度明显下降，神经丝点状分布，难以见到完整神经元，神经纤维数量较少；与PNI组比较，SMC组GFAP和MBP荧光强度明显上升，神经元结构规整，排列致密。见图4。
图4
术后4周3组大鼠免疫荧光染色观察（共聚焦免疫荧光显微镜×40）
从左至右分别为GFAP染色、MBP染色、二者重叠 a. Sham组；b. PNI组；c. SMC组
Figure4. Immunofluorescence staining observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operation (Confocal immunofluorescence microscope×40)From left to right for GFAP staining, MBP staining, and merge, respectively a. Sham group; b. PNI group; c. SMC group
2.2.5 透射电镜观察
与Sham组比较，PNI组轴突直径明显减小，而SMC组轴突直径较PNI组大幅度增加，形态更为规整。各组轴突直径比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图5。
图5
术后4周3组大鼠透射电镜观察
从左至右依次为Sham组、PNI组、SMC组 a. ×200；b. ×800
Figure5. Transmission electron microscopy observation in 3 groups of rats at 4 weeks after operationFrom left to right for Sham group, PNI group, and SMC group, respectively a. ×200; b. ×800
2.2.6 Western blot检测
PNI组HO-1、Nrf2蛋白相对表达量显著高于Sham组，SMC组显著高于PNI组；PNI组p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达量比值显著高于Sham组，SMC组显著低于PNI组；上述组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2，图6。
图6
术后4周Western blot 检测3组大鼠各蛋白表达凝胶电泳图
Mr：相对分子质量 1：Sham 组 2：PNI组 3：SMC 组
Figure6. Gel electrophoresis of each protein expression in 3 groups of rats detected by Western blot at 4 weeks after operationMr: Relative molecular mass 1: Sham group 2: PNI group 3: SMC group
表2
3组大鼠各检测指标两两比较
Table2.
Pairwise comparison of various detection indicators among three groups of rats
3 讨论
因交通事故创伤、肿瘤切除等原因造成的周围神经损伤是目前常见疾病之一[22]，近年发病率不断上升，长时间疼痛和感觉缺失严重影响患者生活质量[23]。寻找一种治疗周围神经损伤的有效药物非常必要。本研究中，我们通过细胞实验验证了低浓度SMC即可达到有效保护雪旺细胞免受氧化应激损伤的作用，因此后续均选取低浓度SMC进行实验，这是因为Se的治疗窗口比较狭窄[24]，过量容易产生过高的细胞毒性，不利于神经愈合。
本研究初步探索了SMC在周围神经损伤中的作用和机制。LFB染色发现SMC治疗后神经排列有序，髓鞘紧致密集，髓鞘密度远大于PNI组。神经电生理测试是衡量神经再生和功能修复的重要指标[25]，SMC治疗后在同样电刺激下，CMAP最高电位远大于PNI组，而CMAP最高电位差异同样反映了术后神经再生速度，这也与LFB染色结果相印证，SMC可以增加神经电信号传导，诱导轴突再生。
髓鞘是螺旋围绕包裹周围神经系统轴突的雪旺细胞质膜。髓鞘不仅对动作电位的快速传导至关重要，对维持轴突完整性也很重要[26]。MBP是周围神经系统中的主要髓鞘成分，位于髓鞘主要致密线的细胞质附着处[27]。许多研究表明，带正电荷的MBP与带负电荷的细胞质膜表面相互作用，这种结合可能对髓鞘的组装至关重要[28]。GFAP是中间丝家族蛋白的神经胶质特异性成员，出现在雪旺细胞发育的相对较晚阶段[29]，主要是在未成熟的雪旺细胞形成时，并且在形成髓鞘的雪旺细胞中下调[30]。本研究发现术后4周，SMC组GFAP和MBP荧光强度均显著上调，这也与LFB染色中髓鞘密度增加趋势保持一致。同时透射电镜以更微观的角度反映了SMC治疗神经损伤的有效性，结果显示术后4周SMC组轴突直径均明显大于PNI组。进一步提示SMC可能通过促进髓鞘形成，增加轴突再生能力并加快神经恢复。
MAPK是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可被不同细胞内外因素刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激等激活[31]，p38MAPK可被蛋白激酶磷酸化从而发挥其活性功能，参与细胞增殖分化等。近年研究表明，p38MAPK通路在神经损伤及痛觉敏感中发挥重要作用[32]；另有研究表明p38MAPK通路激活可促进雪旺细胞凋亡和增加炎症因子表达[33]。而氧化应激同样可促进p38MAPK磷酸化导致神经传导异常[34]。本研究发现神经损伤后p38MAPK磷酸化程度显著上升，加入SMC后p38MAPK磷酸化程度明显下降，这也与轴突再生程度相对应，表明SMC可能通过抑制p38MAPK通路磷酸化，从而起到促进髓鞘形成、加速神经修复的作用。
既往有研究显示神经损伤后，ROS产生过多及氧化因子过多累积往往是影响周围神经再生的重要因素[35]。因为增加氧化应激刺激会影响溶酶体降解，同时ROS过量生成会导致DNA和蛋白质等大分子变性[36]，致雪旺细胞损伤并大量死亡，而雪旺细胞分泌的神经营养因子可以减少神经元变性死亡并促进髓鞘再生[37]，所以氧化应激会明显抑制髓鞘形成和神经再生。本研究中体外细胞ROS免疫荧光染色结果显示，SMC治疗后ROS生成显著减少，提示SMC可以通过抑制ROS水平起到抗氧化应激作用。此外，Nrf2蛋白是属于亮氨酸调节蛋白家族，是机体调节氧化应激通路中的重要转录因子，以维持正常的线粒体功能和细胞稳态[38]。Nrf2可易位入细胞核与相应反应元件结合，从而激活一系列抗氧化保护因子表达，最终引起Nrf2 依赖性HO-1的表达上调[39]。HO-1是HO的3种同工酶之一，也是唯一一种在各种氧化应激因素刺激下可以迅速产生的蛋白质[40]；它可催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳和游离铁，其中一氧化碳起着核心作用[41]，作用于细胞代谢，以保护细胞免受氧化应激并调节炎症因子的产生。本研究中Western blot检测示神经损伤后，抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1）表达增加，而在加入SMC治疗后，抗氧化蛋白表达水平进一步上升，提示SMC可能通过促进Nrf2/HO-1信号通路起到抑制氧化应激水平的作用。ROS如超氧自由基和活性羟基自由基通过氧化细胞膜脂质破坏细胞，这一过程被称为脂质过氧化[42]，并产生细胞毒性物质，如MDA等。本研究结果显示MDA水平在神经损伤后显著上升，SMC治疗后显著下降，同时抗氧化因子（SOD、CAT）水平也在SMC治疗后明显上升，说明SMC可以显著抑制神经损伤后的脂质过氧化水平。
周围神经损伤后，远端神经会发生Wallerian变性[43]，巨噬细胞等会释放大量促炎因子，炎症因子过多聚集会拖累神经再生速度[44]。本研究中发现SMC可以明显减低炎症因子（IL-6、IL-17）水平，显著增加抗炎因子（IL-10）水平，提示SMC可以降低神经损伤后的炎症反应，从而为神经再生创造良好微环境。
综上述，SMC通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制神经损伤后的氧化应激反应和ROS水平，抑制了损伤后炎症反应程度，进而促进了雪旺细胞增殖并抑制了p38MAPK通路磷酸化，最终促进髓鞘形成和加快周围神经再生，本研究为周围神经损伤治疗提供了新思路。但本研究也存在一定局限性，p38MAPK通路磷酸化过程可能与多个生物学过程相互串联，我们并未对其中的因果关系进行研究，后续将进一步研究明确其确切调控作用。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经上海交通大学医学院附属第一人民医院医学伦理委员会批准（2022AW022）；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0028
作者贡献声明 宋建国：研究实施，数据分析，文章撰写；林浩东：资金提供及对文章内容作批评性审阅
