引用本文： 陈明学, 吴江, 殷瀚, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 基于低温沉积3D打印技术构建新型组织工程半月板支架的研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(6): 748-754. doi: 10.7507/1002-1892.202402063 复制
半月板损伤的再生修复目前依然充满挑战[1-2]。近年来，随着再生医学和组织工程技术的发展，构建组织工程半月板支架实现半月板损伤的再生修复逐渐得到认可[3-4]。理想的半月板组织工程支架应模拟天然半月板空间结构和微环境，有良好细胞相容性，有利于细胞生长和分化，促进损伤半月板的再生和修复[5-6]。脱细胞基质由于具有仿生成分和天然微结构，在组织工程和再生医学中得到了广泛应用[7-8]。其最大优点在于良好生物相容性，可很好地模拟细胞生长微环境，有效促进细胞生长和分化。本团队前期研究发现脱细胞半月板基质可有效促进细胞黏附、增殖和分化，进而促进损伤半月板再生修复，可以作为理想的生物材料[5，9]。
3D打印技术可以实现高度个性化制造，准确制造出具备复杂结构的支架。然而，传统熔融沉积3D打印技术因打印过程中需要加热融化材料，故无法用于脱细胞半月板基质打印。近年，低温沉积3D打印技术的出现为打印该材料提供了可能。该打印技术是在超低温（−30～−20℃）平台上逐层搭建支架，经冷冻干燥和相分离技术实现支架高度连通的大孔-微孔结构[10-11]。相对于传统熔融沉积3D打印技术，其具有以下优势：① 超低温下完成打印，可以有效保护材料生物活性；② 能构建具有高度连通的大孔-微孔结构，提高了支架孔隙率，这种分级多孔结构为细胞营养物质交换和扩散提供了通道[12]。
本研究以脱细胞半月板基质为原料，通过低温沉积3D打印技术构建新型组织工程半月板支架，评价该支架理化特性和生物相容性，为其用于体内修复损伤半月板组织奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
猪新鲜半月板50个，购于北京岳各庄屠宰场。新生48 h 雄性SD大鼠乳鼠10只，体质量12～18 g；8周龄SD大鼠6只，雌雄不限，体质量约250 g；均购自中国人民解放军总医院实验动物中心。
DNA酶、RNA酶、PBS粉、胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美国）； DMEM/F12培养基、FBS、青霉素-链霉素双抗（GIBCO公司，美国）；α-MEM培养基（Corning公司，美国）；甲苯胺蓝染色试剂盒、HE染色液（北京瀚海拓新生物技术有限公司）；番红O染色试剂、天狼猩红染色试剂（北京索莱宝科技有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；DAPI染液（Molecular Probes公司，美国）；多聚甲醛（北京化学试剂有限公司）；死/活细胞染色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；鬼笔环肽细胞染色试剂盒（Cytoskeleton公司，美国）。
SUNP BIOMAKER 生物打印机 ［上普博源（北京）生物科技有限公司］；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；EPOCH TAKE 3 酶标仪（BioTek公司，美国）；激光共聚焦显微镜（Nikon公司，日本）；荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus公司，日本）；组织粉碎机（山东九阳股份有限公司）；microCT（GE公司，美国）；Mimics软件（Materialise公司，比利时）。
1.2 脱细胞半月板基质匀浆制备及观测
1.2.1 半月板脱细胞方法
参考文献 ［9，12］ 的改良物理化学联合方法制备脱细胞半月板基质。具体步骤：将新鲜猪半月板组织切碎，置于10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）浸泡2 h；置于−80℃冰箱冷冻8 h后取出、室温下解冻，反复冻融10次；置于37℃ 0.25%胰蛋白酶中，剧烈搅拌24 h，期间每4小时更换1次胰蛋白酶；PBS缓冲液洗涤24 h；DNA酶和RNA酶处理4 h；1%Triton X-100溶液处理24 h；10 mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗24 h后，流水持续冲洗3 d以洗去残余化学试剂。将经上述处理的半月板组织和3倍体积分数的无菌三蒸水放入组织粉碎机内，于4℃反复粉碎30 min；将组织匀浆液进行梯度离心（800×g 离心30 min，取上清；2 500×g离心30 min，取上清；5 000×g离心30 min，取上清；重复以上步骤6次）。最后将收集的上清液以8 000×g离心30 min，收集沉淀即为脱细胞半月板基质匀浆，于4℃条件保存备用。
1.2.2 半月板脱细胞效果观测
取半月板组织和脱细胞半月板基质匀浆各3个样本，OCT包埋，冰冻切片，片厚 6 µm；每个样本取5张切片，4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水洗净残留OCT及多聚甲醛后，常规行DAPI及HE染色，分别于荧光显微镜和倒置显微镜下观察脱细胞后细胞核残留情况。另取上述部分冰冻切片复水处理后，参照试剂盒说明行番红O、甲苯胺蓝及天狼猩红染色，常规脱水封片后于倒置显微镜下观察黏多糖及胶原保留情况。
1.3 新型组织工程半月板支架制备及观测
1.3.1 脱细胞半月板基质生物墨水制备
将制备的脱细胞半月板基质匀浆置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理24 h，用组织粉碎机将其打成粉末。取一定质量粉末溶解于5%乙酸中，制备5%（W/V）脱细胞半月板基质生物墨水，调节pH值为7，于4℃条件保存备用。
1.3.2 新型组织工程半月板支架制备
参考本团队既往构建半月板三维模型方法 ［9］，将前期研究中microCT扫描获得的兔膝关节半月板影像学数据，以Dicom格式导入Mimics软件进行半月板三维建模并生成STL文件；将其输入生物打印机，在G-code文件中规划打印路径；参考既往文献 ［9］ 设置打印参数：生物打印机胶喷头内径400 μm、打印速度5 mm/s、丝间距400 μm。打印期间保持打印机注射器温度约4℃，接收板温度为–24℃。支架打印后行冷冻干燥24 h，取出后于室温保存。
1.3.3 大体与扫描电镜观察
取制备的新型组织工程半月板支架，大体观察形态后，经冷冻干燥以及真空喷金处理，扫描电镜下观察微观结构。
1.3.4 支架细胞相容性评价
① 脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）分离培养与传代：参照文献 ［13］ 方法进行ADSCs分离、培养和传代。将10只SD大鼠乳鼠浸泡于75%乙醇溶液处死并消毒，无菌条件下取出双侧腹股沟脂肪垫，置于含青霉素-链霉素双抗的PBS 溶液（pH7.4）中，剪成 1.0～2.0 mm3 碎块，加入5 mL 0.25%Ⅰ型胶原酶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中磁力搅拌消化至脂肪颗粒不可见；加入含10%FBS的 DMEM/F12 培养基终止消化，经 100 μm 无菌滤器过滤，以250×g离心 5 min后弃上清液；加入含10% FBS的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，移入25 cm2培养瓶，每2天更换1次培养液。待细胞生长至 80%～90% 融合时进行传代，取第3代细胞进行后续实验。
② CCK-8 检测：将新型组织工程半月板支架（0.2 cm×0.2 cm）置于6孔板中，并在支架上接种5 000个ADSCs（实验组），以平面培养的ADSCs为对照组。于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁6 h后加入 DMEM/F12培养基，分别于培养1、3、5 d两组各取5孔，每孔加入2 mL CCK-8工作液，37℃孵育2 h。每孔吸取100 μL液体转移至新的96孔板，采用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。
③ 死/活细胞染色：取ADSCs接种于新型组织工程半月板支架（2×105个/支架），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁6 h后添加含10%FBS的α-MEM培养基进行培养，每2天更换1次培养基。分别于培养1、7 d使用死/活细胞染色试剂盒对支架上细胞进行染色，激光共聚焦显微镜下观察，活细胞呈绿色荧光、死细胞呈红色荧光，按照以下公式计算细胞活性：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
④ 鬼笔环肽染色：取ADSCs接种于新型组织工程半月板支架（2×105个/支架）；置于37℃、5%CO2培养箱中孵育7 d。取出后依次以4%多聚甲醛固定30 min、0.3%Triton X-100裂解20 min、免疫封闭液封闭30 min。最后用鬼笔环肽和DAPI对支架上细胞的细胞骨架和细胞核染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架铺展状态。
1.3.5 体内植入观察
取6只8周龄SD大鼠，腹腔内注射20 g/L戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉后，于背部作长约 5 mm切口，切开皮肤、游离皮下组织，然后将大小为1 cm×1 cm的无菌新型组织工程半月板支架植入皮下，每只植入1个支架，缝合切口。术后1、3周各取3只大鼠过量麻醉处死，按照原切口入路取材。将样本置于40 g/L 多聚甲醛固定30 min，石蜡包埋切片，片厚6 μm，常规HE染色，倒置显微镜下观察炎症细胞浸润与支架降解情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS和GraphPad Prism 9.0统计软件进行分析。计量资料采用Shapiro-Wilk检验行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 半月板脱细胞效果观察
大体观察半月板组织呈半月形或C形，脱细胞前呈乳白色纤维软骨样组织，质地柔软、有弹性；脱细胞半月板基质呈透明凝胶状。DAPI及HE染色示，脱细胞前半月板有大量细胞核结构，脱细胞处理后半月板基质未见细胞核结构，表明具有免疫原性的核酸组织彻底去除。番红O、甲苯胺蓝及天狼猩红染色示，脱细胞前后均呈阳性，提示脱细胞过程中黏多糖和胶原成分保留。见图1。
图1
半月板观察
左侧示脱细胞前，右侧示脱细胞后 a. 大体观察；b. DAPI染色荧光显微镜观察；c. HE染色；d. 番红O染色；e. 甲苯胺蓝染色；f. 天狼猩红染色
Figure1. Observation of meniscusLeft indicated before decellularization and right indicated after decellularization a. Gross observation; b. DAPI staining observation under fluorecence microscopy; c. HE staining; d. Safranin O staining; e. Toluidine blue staining; f. Sirius red staining
2.2 新型组织工程半月板支架观测
2.2.1 大体及扫描电镜观察
大体观察见新型组织工程半月板支架呈交叉网格状结构，纤维排列整齐。扫描电镜下可见支架具有明显纵横交错结构，大孔径（直径200～300 μm）分布较均匀，纤维径上微孔相互连接，微孔直径10～30 μm。见图2a、b。
图2
新型组织工程半月板支架观察
a. 大体观察；b. 扫描电镜观察；c. CCK-8检测细胞增殖；d. 激光共聚焦显微镜下培养1 d（上）及7 d（下）死/活细胞染色观察 从左至右分别为活细胞染色、死细胞染色及两者重叠；e. 激光共聚焦显微镜观察培养7 d鬼笔环肽染色观察；f、g. 大鼠皮下植入后1、3周HE染色观察
Figure2. Observation of the novel tissue engineered meniscus scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscopy observation; c. Cell proliferation detected by CCK-8 assay; d. Dead/live cell staining observation after 1 day (upper) and 7 days (bottom) under laser confocal microscope From left to right for live cell staining, dead cell staining, and merge, respectively; e. Cytoskeleton staining observation after 7 days under laser confocal microscopy; f, g. HE staining observation after 1 and 3 weeks after subcutaneous implantation in rats, respectively
2.2.2 细胞相容性观测
CCK-8检测示两组A值均随时间延长而增加，其中培养3、5 d时实验组A值大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2c。死/活细胞染色示，支架上细胞以活细胞为主，细胞活性达90%以上（其中1 d 94%、7 d 95%）（图2d）。鬼笔环肽染色示培养7 d后支架上细胞呈梭形、分布均匀（图2e）。
2.2.3 体内植入观察
支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周时可见支架内部和支架与组织交界处炎症细胞浸润，支架无明显降解；3周时未见明显炎症细胞浸润，可见支架有部分降解，支架体积和纤维直径较植入前减小。见图2f。
3 讨论
近年来，随着半月板组织工程技术的不断发展，体外、内半月板替代物研发取得了许多进展[14]。然而，半月板复杂结构和功能以及有限血供使其再生修复依然充满挑战[15-16]。半月板再生过程中，支架应具有合适理化特性的结构框架，以帮助宿主细胞黏附和迁移，同时良好的仿生结构可以提供一个良好再生微环境。3D打印技术为构建复杂结构和异质性半月板提供了技术支撑。本研究采用的低温沉积3D打印技术是近年发展起来的快速成型技术之一，它不仅基于快速沉积制造工艺，而且结合了相分离工艺[17]。采用该技术构建的组织工程支架除了具有可控的大孔径外，在纤维径上还具有相互连接的微孔，这些微孔有利于细胞旁分泌，增强细胞生物学功能[18]，在组织工程支架制备和复杂器官设计方面具有广阔应用前景[19]。
目前，应用于3D生物打印的生物墨水主要分为人工合成材料和天然生物材料[20]。人工合成材料主要有聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乳酸复合物、聚乳酸等[21]。它们虽然具有物理机械性能良好、可控性强、微结构可调节等优点，但亲水性差、对细胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸和脱细胞外基质[22]。其中脱细胞外基质保留了大部分天然成分，无免疫原性，是促进细胞增殖和分化的理想生物材料。既往文献及本团队研究显示脱细胞半月板基质的多孔结构和各种功能分子能决定干细胞分化方向，可能进一步促进半月板再生[23-24]。因此，本研究中我们选择开发具有可打印性和满足细胞相容性的脱细胞半月板基质生物墨水，并基于低温沉积3D打印技术构建结构和成分双仿生的新型组织工程半月板支架。
研究结果显示，通过本团队前期研发的成熟脱细胞技术，成功去除半月板组织中具有免疫原性的核酸组织，并很好地保留了基质生物活性成分，包括黏多糖和多种胶原蛋白[25-26]；制备的脱细胞半月板基质具有可打印性，利用低温沉积3D打印技术成功构建新型组织工程半月板支架。扫描电镜观察示这种新型支架不仅具有纵横交错的纤维，类似天然半月板胶原排列，更重要的是纤维径上形成了直径10～30 μm 的微孔，为细胞生长提供了黏附位点，也为细胞物质交换、废物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔结构有助于细胞增殖、分化[27]。本研究CCK-8检测示随着时间推移，支架上细胞增殖明显更快、更多，死/活细胞染色示支架上细胞活性良好，只见少量死细胞，提示构建的支架具有良好细胞相容性。同时，细胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干细胞形态。进一步将支架植入大鼠皮下观察，植入1周有轻度炎症反应，3周炎症反应逐渐减轻，并出现支架部分降解。这种早期炎症反应会募集巨噬细胞，通过调节巨噬细胞极化，促进组织再生修复。
综上述，本研究成功制备脱细胞半月板基质生物墨水，并利用低温沉积3D打印技术构建一种具有大孔-微孔分级微观结构的新型组织工程半月板支架，其能为细胞生长、黏附和增殖提供良好微环境。未来需进一步探讨该支架在体外成软骨分化作用及体内修复损伤半月板组织的效果，为其用于半月板再生修复提供更多数据支持。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经中国人民解放军总医院医学/动物实验伦理委员会批准（积伦动审字第2023-02-66）；实验动物使用许可证批准号：SYXK（京）2015-0003
作者贡献声明 陈明学：参与研究设计，数据收集、整理、分析，撰写文章；吴江、殷瀚：参与研究设计，动物实验，收集实验原始数据；眭翔：指导研究设计；刘舒云、郭全义：指导研究设计、统筹实验进度及文章修改
半月板损伤的再生修复目前依然充满挑战[1-2]。近年来，随着再生医学和组织工程技术的发展，构建组织工程半月板支架实现半月板损伤的再生修复逐渐得到认可[3-4]。理想的半月板组织工程支架应模拟天然半月板空间结构和微环境，有良好细胞相容性，有利于细胞生长和分化，促进损伤半月板的再生和修复[5-6]。脱细胞基质由于具有仿生成分和天然微结构，在组织工程和再生医学中得到了广泛应用[7-8]。其最大优点在于良好生物相容性，可很好地模拟细胞生长微环境，有效促进细胞生长和分化。本团队前期研究发现脱细胞半月板基质可有效促进细胞黏附、增殖和分化，进而促进损伤半月板再生修复，可以作为理想的生物材料[5，9]。
3D打印技术可以实现高度个性化制造，准确制造出具备复杂结构的支架。然而，传统熔融沉积3D打印技术因打印过程中需要加热融化材料，故无法用于脱细胞半月板基质打印。近年，低温沉积3D打印技术的出现为打印该材料提供了可能。该打印技术是在超低温（−30～−20℃）平台上逐层搭建支架，经冷冻干燥和相分离技术实现支架高度连通的大孔-微孔结构[10-11]。相对于传统熔融沉积3D打印技术，其具有以下优势：① 超低温下完成打印，可以有效保护材料生物活性；② 能构建具有高度连通的大孔-微孔结构，提高了支架孔隙率，这种分级多孔结构为细胞营养物质交换和扩散提供了通道[12]。
本研究以脱细胞半月板基质为原料，通过低温沉积3D打印技术构建新型组织工程半月板支架，评价该支架理化特性和生物相容性，为其用于体内修复损伤半月板组织奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
猪新鲜半月板50个，购于北京岳各庄屠宰场。新生48 h 雄性SD大鼠乳鼠10只，体质量12～18 g；8周龄SD大鼠6只，雌雄不限，体质量约250 g；均购自中国人民解放军总医院实验动物中心。
DNA酶、RNA酶、PBS粉、胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美国）； DMEM/F12培养基、FBS、青霉素-链霉素双抗（GIBCO公司，美国）；α-MEM培养基（Corning公司，美国）；甲苯胺蓝染色试剂盒、HE染色液（北京瀚海拓新生物技术有限公司）；番红O染色试剂、天狼猩红染色试剂（北京索莱宝科技有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；DAPI染液（Molecular Probes公司，美国）；多聚甲醛（北京化学试剂有限公司）；死/活细胞染色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；鬼笔环肽细胞染色试剂盒（Cytoskeleton公司，美国）。
SUNP BIOMAKER 生物打印机 ［上普博源（北京）生物科技有限公司］；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；EPOCH TAKE 3 酶标仪（BioTek公司，美国）；激光共聚焦显微镜（Nikon公司，日本）；荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus公司，日本）；组织粉碎机（山东九阳股份有限公司）；microCT（GE公司，美国）；Mimics软件（Materialise公司，比利时）。
1.2 脱细胞半月板基质匀浆制备及观测
1.2.1 半月板脱细胞方法
参考文献 ［9，12］ 的改良物理化学联合方法制备脱细胞半月板基质。具体步骤：将新鲜猪半月板组织切碎，置于10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）浸泡2 h；置于−80℃冰箱冷冻8 h后取出、室温下解冻，反复冻融10次；置于37℃ 0.25%胰蛋白酶中，剧烈搅拌24 h，期间每4小时更换1次胰蛋白酶；PBS缓冲液洗涤24 h；DNA酶和RNA酶处理4 h；1%Triton X-100溶液处理24 h；10 mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗24 h后，流水持续冲洗3 d以洗去残余化学试剂。将经上述处理的半月板组织和3倍体积分数的无菌三蒸水放入组织粉碎机内，于4℃反复粉碎30 min；将组织匀浆液进行梯度离心（800×g 离心30 min，取上清；2 500×g离心30 min，取上清；5 000×g离心30 min，取上清；重复以上步骤6次）。最后将收集的上清液以8 000×g离心30 min，收集沉淀即为脱细胞半月板基质匀浆，于4℃条件保存备用。
1.2.2 半月板脱细胞效果观测
取半月板组织和脱细胞半月板基质匀浆各3个样本，OCT包埋，冰冻切片，片厚 6 µm；每个样本取5张切片，4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水洗净残留OCT及多聚甲醛后，常规行DAPI及HE染色，分别于荧光显微镜和倒置显微镜下观察脱细胞后细胞核残留情况。另取上述部分冰冻切片复水处理后，参照试剂盒说明行番红O、甲苯胺蓝及天狼猩红染色，常规脱水封片后于倒置显微镜下观察黏多糖及胶原保留情况。
1.3 新型组织工程半月板支架制备及观测
1.3.1 脱细胞半月板基质生物墨水制备
将制备的脱细胞半月板基质匀浆置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理24 h，用组织粉碎机将其打成粉末。取一定质量粉末溶解于5%乙酸中，制备5%（W/V）脱细胞半月板基质生物墨水，调节pH值为7，于4℃条件保存备用。
1.3.2 新型组织工程半月板支架制备
参考本团队既往构建半月板三维模型方法 ［9］，将前期研究中microCT扫描获得的兔膝关节半月板影像学数据，以Dicom格式导入Mimics软件进行半月板三维建模并生成STL文件；将其输入生物打印机，在G-code文件中规划打印路径；参考既往文献 ［9］ 设置打印参数：生物打印机胶喷头内径400 μm、打印速度5 mm/s、丝间距400 μm。打印期间保持打印机注射器温度约4℃，接收板温度为–24℃。支架打印后行冷冻干燥24 h，取出后于室温保存。
1.3.3 大体与扫描电镜观察
取制备的新型组织工程半月板支架，大体观察形态后，经冷冻干燥以及真空喷金处理，扫描电镜下观察微观结构。
1.3.4 支架细胞相容性评价
① 脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）分离培养与传代：参照文献 ［13］ 方法进行ADSCs分离、培养和传代。将10只SD大鼠乳鼠浸泡于75%乙醇溶液处死并消毒，无菌条件下取出双侧腹股沟脂肪垫，置于含青霉素-链霉素双抗的PBS 溶液（pH7.4）中，剪成 1.0～2.0 mm3 碎块，加入5 mL 0.25%Ⅰ型胶原酶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中磁力搅拌消化至脂肪颗粒不可见；加入含10%FBS的 DMEM/F12 培养基终止消化，经 100 μm 无菌滤器过滤，以250×g离心 5 min后弃上清液；加入含10% FBS的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，移入25 cm2培养瓶，每2天更换1次培养液。待细胞生长至 80%～90% 融合时进行传代，取第3代细胞进行后续实验。
② CCK-8 检测：将新型组织工程半月板支架（0.2 cm×0.2 cm）置于6孔板中，并在支架上接种5 000个ADSCs（实验组），以平面培养的ADSCs为对照组。于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁6 h后加入 DMEM/F12培养基，分别于培养1、3、5 d两组各取5孔，每孔加入2 mL CCK-8工作液，37℃孵育2 h。每孔吸取100 μL液体转移至新的96孔板，采用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。
③ 死/活细胞染色：取ADSCs接种于新型组织工程半月板支架（2×105个/支架），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁6 h后添加含10%FBS的α-MEM培养基进行培养，每2天更换1次培养基。分别于培养1、7 d使用死/活细胞染色试剂盒对支架上细胞进行染色，激光共聚焦显微镜下观察，活细胞呈绿色荧光、死细胞呈红色荧光，按照以下公式计算细胞活性：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
④ 鬼笔环肽染色：取ADSCs接种于新型组织工程半月板支架（2×105个/支架）；置于37℃、5%CO2培养箱中孵育7 d。取出后依次以4%多聚甲醛固定30 min、0.3%Triton X-100裂解20 min、免疫封闭液封闭30 min。最后用鬼笔环肽和DAPI对支架上细胞的细胞骨架和细胞核染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架铺展状态。
1.3.5 体内植入观察
取6只8周龄SD大鼠，腹腔内注射20 g/L戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉后，于背部作长约 5 mm切口，切开皮肤、游离皮下组织，然后将大小为1 cm×1 cm的无菌新型组织工程半月板支架植入皮下，每只植入1个支架，缝合切口。术后1、3周各取3只大鼠过量麻醉处死，按照原切口入路取材。将样本置于40 g/L 多聚甲醛固定30 min，石蜡包埋切片，片厚6 μm，常规HE染色，倒置显微镜下观察炎症细胞浸润与支架降解情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS和GraphPad Prism 9.0统计软件进行分析。计量资料采用Shapiro-Wilk检验行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 半月板脱细胞效果观察
大体观察半月板组织呈半月形或C形，脱细胞前呈乳白色纤维软骨样组织，质地柔软、有弹性；脱细胞半月板基质呈透明凝胶状。DAPI及HE染色示，脱细胞前半月板有大量细胞核结构，脱细胞处理后半月板基质未见细胞核结构，表明具有免疫原性的核酸组织彻底去除。番红O、甲苯胺蓝及天狼猩红染色示，脱细胞前后均呈阳性，提示脱细胞过程中黏多糖和胶原成分保留。见图1。
图1
半月板观察
左侧示脱细胞前，右侧示脱细胞后 a. 大体观察；b. DAPI染色荧光显微镜观察；c. HE染色；d. 番红O染色；e. 甲苯胺蓝染色；f. 天狼猩红染色
Figure1. Observation of meniscusLeft indicated before decellularization and right indicated after decellularization a. Gross observation; b. DAPI staining observation under fluorecence microscopy; c. HE staining; d. Safranin O staining; e. Toluidine blue staining; f. Sirius red staining
2.2 新型组织工程半月板支架观测
2.2.1 大体及扫描电镜观察
大体观察见新型组织工程半月板支架呈交叉网格状结构，纤维排列整齐。扫描电镜下可见支架具有明显纵横交错结构，大孔径（直径200～300 μm）分布较均匀，纤维径上微孔相互连接，微孔直径10～30 μm。见图2a、b。
图2
新型组织工程半月板支架观察
a. 大体观察；b. 扫描电镜观察；c. CCK-8检测细胞增殖；d. 激光共聚焦显微镜下培养1 d（上）及7 d（下）死/活细胞染色观察 从左至右分别为活细胞染色、死细胞染色及两者重叠；e. 激光共聚焦显微镜观察培养7 d鬼笔环肽染色观察；f、g. 大鼠皮下植入后1、3周HE染色观察
Figure2. Observation of the novel tissue engineered meniscus scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscopy observation; c. Cell proliferation detected by CCK-8 assay; d. Dead/live cell staining observation after 1 day (upper) and 7 days (bottom) under laser confocal microscope From left to right for live cell staining, dead cell staining, and merge, respectively; e. Cytoskeleton staining observation after 7 days under laser confocal microscopy; f, g. HE staining observation after 1 and 3 weeks after subcutaneous implantation in rats, respectively
2.2.2 细胞相容性观测
CCK-8检测示两组A值均随时间延长而增加，其中培养3、5 d时实验组A值大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2c。死/活细胞染色示，支架上细胞以活细胞为主，细胞活性达90%以上（其中1 d 94%、7 d 95%）（图2d）。鬼笔环肽染色示培养7 d后支架上细胞呈梭形、分布均匀（图2e）。
2.2.3 体内植入观察
支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周时可见支架内部和支架与组织交界处炎症细胞浸润，支架无明显降解；3周时未见明显炎症细胞浸润，可见支架有部分降解，支架体积和纤维直径较植入前减小。见图2f。
3 讨论
近年来，随着半月板组织工程技术的不断发展，体外、内半月板替代物研发取得了许多进展[14]。然而，半月板复杂结构和功能以及有限血供使其再生修复依然充满挑战[15-16]。半月板再生过程中，支架应具有合适理化特性的结构框架，以帮助宿主细胞黏附和迁移，同时良好的仿生结构可以提供一个良好再生微环境。3D打印技术为构建复杂结构和异质性半月板提供了技术支撑。本研究采用的低温沉积3D打印技术是近年发展起来的快速成型技术之一，它不仅基于快速沉积制造工艺，而且结合了相分离工艺[17]。采用该技术构建的组织工程支架除了具有可控的大孔径外，在纤维径上还具有相互连接的微孔，这些微孔有利于细胞旁分泌，增强细胞生物学功能[18]，在组织工程支架制备和复杂器官设计方面具有广阔应用前景[19]。
目前，应用于3D生物打印的生物墨水主要分为人工合成材料和天然生物材料[20]。人工合成材料主要有聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乳酸复合物、聚乳酸等[21]。它们虽然具有物理机械性能良好、可控性强、微结构可调节等优点，但亲水性差、对细胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸和脱细胞外基质[22]。其中脱细胞外基质保留了大部分天然成分，无免疫原性，是促进细胞增殖和分化的理想生物材料。既往文献及本团队研究显示脱细胞半月板基质的多孔结构和各种功能分子能决定干细胞分化方向，可能进一步促进半月板再生[23-24]。因此，本研究中我们选择开发具有可打印性和满足细胞相容性的脱细胞半月板基质生物墨水，并基于低温沉积3D打印技术构建结构和成分双仿生的新型组织工程半月板支架。
研究结果显示，通过本团队前期研发的成熟脱细胞技术，成功去除半月板组织中具有免疫原性的核酸组织，并很好地保留了基质生物活性成分，包括黏多糖和多种胶原蛋白[25-26]；制备的脱细胞半月板基质具有可打印性，利用低温沉积3D打印技术成功构建新型组织工程半月板支架。扫描电镜观察示这种新型支架不仅具有纵横交错的纤维，类似天然半月板胶原排列，更重要的是纤维径上形成了直径10～30 μm 的微孔，为细胞生长提供了黏附位点，也为细胞物质交换、废物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔结构有助于细胞增殖、分化[27]。本研究CCK-8检测示随着时间推移，支架上细胞增殖明显更快、更多，死/活细胞染色示支架上细胞活性良好，只见少量死细胞，提示构建的支架具有良好细胞相容性。同时，细胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干细胞形态。进一步将支架植入大鼠皮下观察，植入1周有轻度炎症反应，3周炎症反应逐渐减轻，并出现支架部分降解。这种早期炎症反应会募集巨噬细胞，通过调节巨噬细胞极化，促进组织再生修复。
综上述，本研究成功制备脱细胞半月板基质生物墨水，并利用低温沉积3D打印技术构建一种具有大孔-微孔分级微观结构的新型组织工程半月板支架，其能为细胞生长、黏附和增殖提供良好微环境。未来需进一步探讨该支架在体外成软骨分化作用及体内修复损伤半月板组织的效果，为其用于半月板再生修复提供更多数据支持。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经中国人民解放军总医院医学/动物实验伦理委员会批准（积伦动审字第2023-02-66）；实验动物使用许可证批准号：SYXK（京）2015-0003
作者贡献声明 陈明学：参与研究设计，数据收集、整理、分析，撰写文章；吴江、殷瀚：参与研究设计，动物实验，收集实验原始数据；眭翔：指导研究设计；刘舒云、郭全义：指导研究设计、统筹实验进度及文章修改
