引用本文： 赵金鹏, 矫文捷, 赵艳东, 王滋宗. CUG结合蛋白1在非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(3): 389-393. doi: 10.7507/1007-4848.20140106 复制
由于高转移及复发率，肺癌的死亡率高居各恶性肿瘤的首位，每年大约有120万患者死于肺癌，其中85%为非小细胞肺癌，5年生存率仅10%～15%[1-2]，因此早期诊断、治疗以及预测对于非小细胞肺癌患者尤为重要[3]。CUG结合蛋白1（CUG binding protein 1，CUGBP1）是Timchenko等于1996年用特异性抗体mAb3BI克隆得到的与肌强直蛋白激酶（dystrophin myotonia protein kinase，DMPK）基因的3’-UTR（CUG）n重复序列结合的49 kDa的RNA结合蛋白[4-6]。CUGBP1是一种调节选择性剪接、mRNA翻译及稳定的RNA结合蛋白。CUGBP1属于CELF/BRUNOL蛋白家族成员，不仅在胚胎及心脏发育、骨骼肌及脂肪组织分化、生殖细胞行为等方面具有重要作用，而且在肿瘤的恶化中也发挥重要的调控作用[7-9]。本研究应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学技术初步检测了57例早期非小细胞肺癌组织及相应的癌周正常组织中CUGBP1 mRNA及蛋白的表达情况，并将所有的病例随访3年以上，以探讨CUGBP1 mRNA与非小细胞肺癌预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2009年7月至2011年4月在青岛大学附属医院胸外科接受手术治疗的57例肺癌患者，男32例，女25例；年龄43～74（60.6±8.9）岁；术后病理类型诊断明确，见表 1。所有患者术后每2个月电话随访1次，采用肿瘤进展时间（time to progression，TTP）作为观察评估指标。组织学分型根据WHO标准（1981年）进行病理学检查，并根据TNM国际分期法（UICC，1997）进行分期。临床病理资料分析项目包括：性别、年龄、吸烟、组织学类型、T分期、N分期、TNM分期以及分化。所有患者术前均未进行放化疗及激素治疗。
表1
57例非小细胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表达与各临床病理参数的关系（例）
1.2 方法
1.2.1 半定量RT-PCR
每个样品包括癌组织及周围正常组织，手术切除标本后立即放入液氮中保存，按照制造商说明书使用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，并且使用分光光度计于260/280 nm测量光密度来确定RNA的浓度和纯度。每个样品10 ng RNA逆转录成cDNA，使用特定的正向及反向引物进行目的基因扩增（Master Cycler，Eppendorf，Germany），按照以下步骤进行40个循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s。CUGBP1 mRNA的相对表达量用甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。CUGBP1 mRNA的正向及反向引物分别为：5′-GTC-AGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-TGACTTCAAC-AGCGACACCCA-3′。GAPDH的正向及反向引物分别为：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-CA-CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。所有引物于我院中心实验室通过反相高效液相色谱法合成及纯化。所有样品于2%琼脂糖凝胶上分离电泳确保正确的目的基因扩增，并且每个样品半定量值使用荧光成像扫描仪（FluoroImager scanner，Molecular Dynamics公司）测量，使用ImageQuant软件（Molecular Dynamics公司）进行分析。
1.2.2 免疫组织化学染色
10%福尔马林固定标本，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，Abcam公司购买CUGBP1单克隆抗体，按照说明书进行测试。切片脱蜡至水，放入新配制的3% H2O2 10 min，灭活内源性酶，于10 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH=6）于20 min内加热至95 ℃，重复3次。滴加CUGBP1单克隆抗体（浓度1:200，PBS稀释），37 ℃温箱中孵育90 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体（PV-6000）（浓度1% 200，PBS稀释），37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，DAB显色3 min，苏木精轻度复染。
1.2.3 结果判定
CUGBP1 mRNA PCR结果：取0.6作为临界值，半定量CUGBP1 mRNA值≥0.6为阳性，否则为阴性。CUGBP1免疫组织化学染色结果：通过测量染色强度（0：不染色；1：黄色染色；2：棕黄色染色；3：褐色染色）以及染色面积（0：0%，1：0%～10%；2：10%～50%，3：50%～100%）。染色强度与染色面积的分数相乘，结果0～3为阴性，4～9为阳性。
1.3 统计学分析
采用χ2检验对CUGBP1 mRNA及蛋白的表达进行统计分析，COX单因素及多因素分析CUGBP1 mRNA、年龄、TNM分期对于肺癌预后的意义。所有的统计分析均采用SAS9.2软件，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CUGBP1 mRNA及蛋白在非小细胞肺癌的表达及与临床病理资料的关系
57例非小细胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表达与各临床病理参数的关系见表 1。通过半定量RT-PCR分析，肺癌组CUGBP1 mRNA的阳性表达率为63.2%，明显高于对照组43.9%，差异具有统计学意义（χ2=4.266 6，P=0.038 9），见表 2。通过免疫组织化学分析，CUGBP1位于细胞核，肺癌组阳性表达率为66.7%，与对照组阳性率（36.8%）差异具有统计学意义（χ2=10.152 9，P=0.001 4）（表 2）。并且CUGBP1mRNA与CUGBP1同时与肺癌的TNM分期、分化密切相关。但是肺癌组织内，CUGBP1 mRNA与CUGBP1表达差异无统计学意义（Z=0.500 0，P=0.479 5）；见表 3。
表2
CUGBP1 mRNA及蛋白在非小细胞肺癌中的分布[n=57，例（%）]
表3
肺癌组CUGBP1 mRNA与蛋白表达的关系（n=57，例）
2.2 CUGBP1 mRNA及临床病理指标与预后的关系
所有肺癌患者随访时间1～39个月，中位数为10个月。生存曲线（图 1）显示高表达CUGBP1 mRNA患者的平均术后肿瘤进展时间（TTP）为16.8个月，与低表达患者（12.4个月）相比差异具有统计学意义（χ2=7.166 5，P=0.007 4）。通过单因素及多因素生存分析得知，CUGBP1 mRNA、TNM分期、年龄可作为非小细胞肺癌独立的预后因素，见表 4和表 5。
图1
肺癌患者术后生存曲线
表4
各临床病理参数COX单因素分析结果（n=57）
表5
非小细胞肺癌患者预后的多因素分析结果
3 讨论
非小细胞肺癌是世界上首位癌症死亡原因，找出与非小细胞肺癌的进展和预后相关的分子标记物对于临床医生和基础研究者是一个巨大的挑战[10-11]。作为RNA结合蛋白中的重要一员，CUGBP1广泛表达于各类组织细胞中的细胞核和细胞质中，具有调节RNA剪切和mRNA翻译两个主要功能[6, 12-13]。CUGBP1在RNA的可变剪切、mRNA翻译以及mRNA降解中发挥着举足轻重的作用，该基因表达的增强、磷酸化水平以及活性的高低直接影响其功能，进而引发各种疾病[14-17]。CUGBP1不仅涉及到乳腺癌和白血病的发展，也可能在肿瘤的发生与某些肿瘤的恶化进展发挥了巨大的作用[18]。Rattenbacher等[19]发现CUGBP1与目的基因转录后结合形成的调控网络调节细胞生长和平衡，而这个网络中断可能导致癌症的发生。Zheng等[8]报道CUGBP1在组织分化、细胞应激或肿瘤发生过程中通过调节p27蛋白水平发挥重要作用。在我们的研究中，CUGBP1 mRNA及CUGBP1在肺癌组织中高度表达，另外通过COX单因素及多因素分析，CUGBP1可以作为一个独立预后因素来评估非小细胞肺癌患者的术后生存及肿瘤进展时间，说明CUGBP1可能在非小细胞肺癌的发生和恶化进展中发挥了巨大的作用，为临床及基础工作者对于肺癌的诊断、研究及治疗指明了一个新的研究方向[20]。
综上所述，CUGBP1 mRNA可能在非小细胞肺癌的发生和进展中具有调控作用，并且作为独立的预后因素，可以在临床上用来判断肺癌患者的预后。本试验首次研究了非小细胞肺癌CUGBP1 mRNA及蛋白的表达情况，以及与临床病理参数之间的关系，特别是与非小细胞肺癌患者预后的关系。研究表明CUGBP1 mRNA过度表达的肺癌患者预后较差，CUGBP1 mRNA在非小细胞肺癌患者的检测、治疗和判断预后具有一定的作用，为临床工作者提供了一个崭新的视野。作为独立预后因素，我们建议在未来的临床实践工作中，应定期检测CUGBP1 mRNA用以评估非小细胞肺癌患者的预后。
由于高转移及复发率，肺癌的死亡率高居各恶性肿瘤的首位，每年大约有120万患者死于肺癌，其中85%为非小细胞肺癌，5年生存率仅10%～15%[1-2]，因此早期诊断、治疗以及预测对于非小细胞肺癌患者尤为重要[3]。CUG结合蛋白1（CUG binding protein 1，CUGBP1）是Timchenko等于1996年用特异性抗体mAb3BI克隆得到的与肌强直蛋白激酶（dystrophin myotonia protein kinase，DMPK）基因的3’-UTR（CUG）n重复序列结合的49 kDa的RNA结合蛋白[4-6]。CUGBP1是一种调节选择性剪接、mRNA翻译及稳定的RNA结合蛋白。CUGBP1属于CELF/BRUNOL蛋白家族成员，不仅在胚胎及心脏发育、骨骼肌及脂肪组织分化、生殖细胞行为等方面具有重要作用，而且在肿瘤的恶化中也发挥重要的调控作用[7-9]。本研究应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学技术初步检测了57例早期非小细胞肺癌组织及相应的癌周正常组织中CUGBP1 mRNA及蛋白的表达情况，并将所有的病例随访3年以上，以探讨CUGBP1 mRNA与非小细胞肺癌预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2009年7月至2011年4月在青岛大学附属医院胸外科接受手术治疗的57例肺癌患者，男32例，女25例；年龄43～74（60.6±8.9）岁；术后病理类型诊断明确，见表 1。所有患者术后每2个月电话随访1次，采用肿瘤进展时间（time to progression，TTP）作为观察评估指标。组织学分型根据WHO标准（1981年）进行病理学检查，并根据TNM国际分期法（UICC，1997）进行分期。临床病理资料分析项目包括：性别、年龄、吸烟、组织学类型、T分期、N分期、TNM分期以及分化。所有患者术前均未进行放化疗及激素治疗。
表1
57例非小细胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表达与各临床病理参数的关系（例）
1.2 方法
1.2.1 半定量RT-PCR
每个样品包括癌组织及周围正常组织，手术切除标本后立即放入液氮中保存，按照制造商说明书使用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，并且使用分光光度计于260/280 nm测量光密度来确定RNA的浓度和纯度。每个样品10 ng RNA逆转录成cDNA，使用特定的正向及反向引物进行目的基因扩增（Master Cycler，Eppendorf，Germany），按照以下步骤进行40个循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s。CUGBP1 mRNA的相对表达量用甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。CUGBP1 mRNA的正向及反向引物分别为：5′-GTC-AGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-TGACTTCAAC-AGCGACACCCA-3′。GAPDH的正向及反向引物分别为：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-CA-CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。所有引物于我院中心实验室通过反相高效液相色谱法合成及纯化。所有样品于2%琼脂糖凝胶上分离电泳确保正确的目的基因扩增，并且每个样品半定量值使用荧光成像扫描仪（FluoroImager scanner，Molecular Dynamics公司）测量，使用ImageQuant软件（Molecular Dynamics公司）进行分析。
1.2.2 免疫组织化学染色
10%福尔马林固定标本，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，Abcam公司购买CUGBP1单克隆抗体，按照说明书进行测试。切片脱蜡至水，放入新配制的3% H2O2 10 min，灭活内源性酶，于10 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH=6）于20 min内加热至95 ℃，重复3次。滴加CUGBP1单克隆抗体（浓度1:200，PBS稀释），37 ℃温箱中孵育90 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体（PV-6000）（浓度1% 200，PBS稀释），37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，DAB显色3 min，苏木精轻度复染。
1.2.3 结果判定
CUGBP1 mRNA PCR结果：取0.6作为临界值，半定量CUGBP1 mRNA值≥0.6为阳性，否则为阴性。CUGBP1免疫组织化学染色结果：通过测量染色强度（0：不染色；1：黄色染色；2：棕黄色染色；3：褐色染色）以及染色面积（0：0%，1：0%～10%；2：10%～50%，3：50%～100%）。染色强度与染色面积的分数相乘，结果0～3为阴性，4～9为阳性。
1.3 统计学分析
采用χ2检验对CUGBP1 mRNA及蛋白的表达进行统计分析，COX单因素及多因素分析CUGBP1 mRNA、年龄、TNM分期对于肺癌预后的意义。所有的统计分析均采用SAS9.2软件，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CUGBP1 mRNA及蛋白在非小细胞肺癌的表达及与临床病理资料的关系
57例非小细胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表达与各临床病理参数的关系见表 1。通过半定量RT-PCR分析，肺癌组CUGBP1 mRNA的阳性表达率为63.2%，明显高于对照组43.9%，差异具有统计学意义（χ2=4.266 6，P=0.038 9），见表 2。通过免疫组织化学分析，CUGBP1位于细胞核，肺癌组阳性表达率为66.7%，与对照组阳性率（36.8%）差异具有统计学意义（χ2=10.152 9，P=0.001 4）（表 2）。并且CUGBP1mRNA与CUGBP1同时与肺癌的TNM分期、分化密切相关。但是肺癌组织内，CUGBP1 mRNA与CUGBP1表达差异无统计学意义（Z=0.500 0，P=0.479 5）；见表 3。
表2
CUGBP1 mRNA及蛋白在非小细胞肺癌中的分布[n=57，例（%）]
表3
肺癌组CUGBP1 mRNA与蛋白表达的关系（n=57，例）
2.2 CUGBP1 mRNA及临床病理指标与预后的关系
所有肺癌患者随访时间1～39个月，中位数为10个月。生存曲线（图 1）显示高表达CUGBP1 mRNA患者的平均术后肿瘤进展时间（TTP）为16.8个月，与低表达患者（12.4个月）相比差异具有统计学意义（χ2=7.166 5，P=0.007 4）。通过单因素及多因素生存分析得知，CUGBP1 mRNA、TNM分期、年龄可作为非小细胞肺癌独立的预后因素，见表 4和表 5。
图1
肺癌患者术后生存曲线
表4
各临床病理参数COX单因素分析结果（n=57）
表5
非小细胞肺癌患者预后的多因素分析结果
3 讨论
非小细胞肺癌是世界上首位癌症死亡原因，找出与非小细胞肺癌的进展和预后相关的分子标记物对于临床医生和基础研究者是一个巨大的挑战[10-11]。作为RNA结合蛋白中的重要一员，CUGBP1广泛表达于各类组织细胞中的细胞核和细胞质中，具有调节RNA剪切和mRNA翻译两个主要功能[6, 12-13]。CUGBP1在RNA的可变剪切、mRNA翻译以及mRNA降解中发挥着举足轻重的作用，该基因表达的增强、磷酸化水平以及活性的高低直接影响其功能，进而引发各种疾病[14-17]。CUGBP1不仅涉及到乳腺癌和白血病的发展，也可能在肿瘤的发生与某些肿瘤的恶化进展发挥了巨大的作用[18]。Rattenbacher等[19]发现CUGBP1与目的基因转录后结合形成的调控网络调节细胞生长和平衡，而这个网络中断可能导致癌症的发生。Zheng等[8]报道CUGBP1在组织分化、细胞应激或肿瘤发生过程中通过调节p27蛋白水平发挥重要作用。在我们的研究中，CUGBP1 mRNA及CUGBP1在肺癌组织中高度表达，另外通过COX单因素及多因素分析，CUGBP1可以作为一个独立预后因素来评估非小细胞肺癌患者的术后生存及肿瘤进展时间，说明CUGBP1可能在非小细胞肺癌的发生和恶化进展中发挥了巨大的作用，为临床及基础工作者对于肺癌的诊断、研究及治疗指明了一个新的研究方向[20]。
综上所述，CUGBP1 mRNA可能在非小细胞肺癌的发生和进展中具有调控作用，并且作为独立的预后因素，可以在临床上用来判断肺癌患者的预后。本试验首次研究了非小细胞肺癌CUGBP1 mRNA及蛋白的表达情况，以及与临床病理参数之间的关系，特别是与非小细胞肺癌患者预后的关系。研究表明CUGBP1 mRNA过度表达的肺癌患者预后较差，CUGBP1 mRNA在非小细胞肺癌患者的检测、治疗和判断预后具有一定的作用，为临床工作者提供了一个崭新的视野。作为独立预后因素，我们建议在未来的临床实践工作中，应定期检测CUGBP1 mRNA用以评估非小细胞肺癌患者的预后。
