引用本文： 林海平, 曹子昂, 杨异, 叶清. 可切除肺腺癌组织中甲状腺转录因子1表达与表皮生长因子受体基因突变的关系. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(4): 518-521. doi: 10.7507/1007-4848.20140146 复制
在世界范围内，肺癌的发病率及死亡率均在恶性肿瘤中位列前茅，近年来肺腺癌的发病率不断增高，在部分地区已超过肺鳞癌的发病率[1]。针对肺腺癌患者的分子靶向药物一直是临床和基础研究的热点。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是这类药物的代表。众所周知，对于表皮生长因子受体(EGFR)基因呈突变型的患者应用EGFR-TKI的有效率更高。但EGFR基因检测较为复杂、费用较高且未纳入医保，很多学者都在关注是否有其它生化指标与EGFR基因的突变存在关系。我们在临床工作中发现，甲状腺转录因子1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)在肺腺癌组织中广泛表达，且与肿瘤组织中EGFR的基因表型存在着联系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
纳入2009年6月至2012年12月在上海市第六人民医院心胸外科及上海交通大学医学院附属仁济医院胸外科行肺癌手术后病理证实为肺腺癌的患者67例，其中男40例、女27例，年龄37~79 (57.6±1.8)岁；术后病理分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。
1.2 检测方法
对肺癌切除后的石蜡包埋标本进行检测，TTF-1检测由病理科进行。将石蜡包埋组织块进行4 μm连续切片，采用免疫组织化学法测定肿瘤组织中TTF-1表达。染色采用Envision两步法，以正常肺组织做阳性对照，所用试剂均购自福州迈新生物技术开发公司。以细胞核染色显示棕黄色或棕褐色为阳性细胞，每张切片随即观察5个高倍视野。按阳性细胞百分比以及染色的强弱综合计分判读结果：阳性细胞 < 5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分， > 50%为3分；染色程度无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两项指标的评分相乘，≥4分者判定为TTF-1阳性表达。
EGFR基因突变检测：针对外显子18及外显子20的点突变采用直接测序法。针对外显子19缺失及外显子21 L858R点突变，参照Asano等[2-3]的方法，应用突变富集体聚合酶链反应(PCR)检测，由上海赛安生物技术有限公司进行。EGFR基因外显子19突变检测使用限制性内切酶MseⅠ酶切第一轮PCR扩增产物，然后以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；得到的终产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色观察结果；EGFR 19突变体呈现为82~91 bp(由缺失类型决定)条带，酶切后残存的野生型片段为100 bp的条带。EGFR基因外显子21 (L858R)突变检测使用限制性内切酶MscⅠ酶切第一轮PCR扩增产物，然后以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；第二轮PCR扩增产物再使用限制性内切酶Sau96Ⅰ酶切扩增产物，得到的终产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色观察结果；EGFR 21突变体呈现为99 bp条带，酶切后残存的野生型片段则为130 bp的条带。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件行校正卡方(χ2)检验和Pearson卡方相关性分析。
2 结果
67例肺腺癌患者的肿瘤组织中，TTF-1阳性57例，阴性10例，免疫组织化学染色结果见图 1。共有44例肺癌组织中存在EGFR基因突变，电泳结果见图 2，其中TTF-1阳性者42例，TTF-1阴性者2例。TTF-1阳性患者中EGFR基因突变率为73.7% (42/57)，TTF-1阴性患者中EGFR基因突变率为20.0% (2/10)，两者差异有统计学意义(χ2=8.625，P=0.003)。根据上述结果列出四格表见表 1，在本组病例中以TTF-1表达预测EGFR基因突变的敏感度为95.5% (42/44)，特异度为34.8% (8/23)，阳性预测值为73.7%，阴性预测值为80.0%。
图1
肿瘤组织中的TTF-1表达情况：细胞核染为棕黄色或棕褐色为阳性细胞(Envision二步法染色，DAB显色，×100倍)
图2
EGFR基因突变检测结果：样本出现与阳性对照一致的二根条带为有突变
表1
TTF-1和EGFR基因突变检测结果(例)
3 讨论
EGFR-TKI作为肺腺癌分子靶向药物的代表，在晚期肺腺癌及化疗失败的肺腺癌患者治疗中的作用已得到肯定和认同[4]。正如IPASS研究所阐明的，亚洲人群有着更高的EGFR基因突变率，对经选择的患者应用EGFR-TKI较之铂类药物化疗有着更好的获益[5]。因为并非对所有患者都适用，因此如何筛选能对EGFR-TKI治疗获益的目标人群一直是学者和临床医师所关心的，目前通常的做法是进行EGFR基因及K-ras基因突变的检测[6]，从而筛选出EGFR突变的患者。通常来说这一检测费时、费力，检测费用昂贵且未纳入医保范围，这是限制EGFR-TKI药物广泛应用的瓶颈。鉴于肺癌肿瘤靶向药物治疗并不能取代术后化疗，临床上患者多是在术后复发且化疗失败的情况下才寄希望于EGFR-TKI，此时患者的经济条件和身心状况已不堪重负。本项研究的目的是在病理科常规进行酶标检测的分子靶标中寻找出一种同EGFR基因突变存在关联的指标，以期据此对EGFR基因的表型进行预测，能够在术后早期就为患者日后的辅助治疗提供方向。
查阅近年的文献，有学者报道相当一部分EGFR基因呈突变型的肺腺癌患者中，TTF-1呈阳性表达[7-8]。在很多三级甲等医院的病理科，TTF-1是常规的免疫组化检测项目，用以区分肺腺癌和肺鳞癌，以及原发性肺癌和肺转移瘤。我们通过回顾分析近年来曾进行EGFR基因检测的67例肺腺癌术后患者，同样发现肿瘤组织中TTF-1的表达同EGFR基因的表型存在关联。根据本组数据统计结果，TTF-1表达对EGFR基因突变进行预测的敏感度为95.5%，阴性预测值为80.0%。法国Vallee等[9]报道了1 038例肺腺癌病例中有148例存在EGFR突变，其中TTF-1阳性者145例，而TTF-1阴性病例中仅有3例存在EGFR突变。Somaiah等[10]报道224例TTF-1阴性表达的肺腺癌患者中仅有2例发生EGFR突变，TTF-1阳性表达对EGFR突变的敏感度和特异度分别为99.1%和36.4%，有着极高的阴性预测值。就亚洲人群来看，韩国Sun等[11]报道382例肺腺癌患者中，存在EGFR突变者196例，其中92.7%的患者肿瘤组织中TTF-1呈阳性表达，作者提出亚洲人群中肺腺癌伴EGFR突变者的比例较西方人群更高，且TTF-1阳性比例极大。因此，可以根据TTF-1的免疫组织化学检测结果来预测EGFR基因的表型[12]。我国也有学者报道了肺腺癌组织中TTF-1表达同EGFR基因突变存在关联[13-14]。
就本次研究的结果来看，尽管差异有显著统计学意义，但我们的病例中TTF-1的阳性率以及预测EGFR突变的敏感度要低于文献报道，可能与本组病例数相对较少有关。此外，2011年国际肺癌研究学会、美国胸科学会等将肺腺癌分成多个亚型[15-16]，不同亚型肺腺癌的生物学行为、分子靶标表型，甚至对化疗的反应都不尽相同。有学者提出不同的腺癌亚型TTF-1的表达情况及EGFR突变率亦有不同[17-18]。本组病例数量有限，目前的报道数据仅为初步结果，随着样本量的增加，将进行下一步的分层细化研究。
肺腺癌在胸外科可切除肺癌中占据的比例不断增高，针对腺癌的化疗及靶向治疗方面的研究也不断增多，随着更多的分子靶标与药物疗效的规律被不断揭示，已有肿瘤科医师提倡肺癌术后的个体化治疗。胸外科医师在肺癌中的作用绝不仅是切除肿瘤，还需研究术后病理中的免疫组织化学结果，寻找其中的规律，为后续治疗提供有价值的指导作用。最近有报道TTF-1可作为肺腺癌术后的生存期预测因子，与肿瘤无进展生存时间及总生存期相关[19-20]。我们将进一步增加样本量，探寻深层次的规律，例如不同肺腺癌亚型之间TTF-1表达的差异以及TTF-1状态同靶向治疗效果的关系等，以期利用简便易行，可纳入医保支付范围的免疫组织化学指标为肺癌患者的个体化治疗提供指导。
在世界范围内，肺癌的发病率及死亡率均在恶性肿瘤中位列前茅，近年来肺腺癌的发病率不断增高，在部分地区已超过肺鳞癌的发病率[1]。针对肺腺癌患者的分子靶向药物一直是临床和基础研究的热点。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是这类药物的代表。众所周知，对于表皮生长因子受体(EGFR)基因呈突变型的患者应用EGFR-TKI的有效率更高。但EGFR基因检测较为复杂、费用较高且未纳入医保，很多学者都在关注是否有其它生化指标与EGFR基因的突变存在关系。我们在临床工作中发现，甲状腺转录因子1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)在肺腺癌组织中广泛表达，且与肿瘤组织中EGFR的基因表型存在着联系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
纳入2009年6月至2012年12月在上海市第六人民医院心胸外科及上海交通大学医学院附属仁济医院胸外科行肺癌手术后病理证实为肺腺癌的患者67例，其中男40例、女27例，年龄37~79 (57.6±1.8)岁；术后病理分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。
1.2 检测方法
对肺癌切除后的石蜡包埋标本进行检测，TTF-1检测由病理科进行。将石蜡包埋组织块进行4 μm连续切片，采用免疫组织化学法测定肿瘤组织中TTF-1表达。染色采用Envision两步法，以正常肺组织做阳性对照，所用试剂均购自福州迈新生物技术开发公司。以细胞核染色显示棕黄色或棕褐色为阳性细胞，每张切片随即观察5个高倍视野。按阳性细胞百分比以及染色的强弱综合计分判读结果：阳性细胞 < 5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分， > 50%为3分；染色程度无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两项指标的评分相乘，≥4分者判定为TTF-1阳性表达。
EGFR基因突变检测：针对外显子18及外显子20的点突变采用直接测序法。针对外显子19缺失及外显子21 L858R点突变，参照Asano等[2-3]的方法，应用突变富集体聚合酶链反应(PCR)检测，由上海赛安生物技术有限公司进行。EGFR基因外显子19突变检测使用限制性内切酶MseⅠ酶切第一轮PCR扩增产物，然后以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；得到的终产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色观察结果；EGFR 19突变体呈现为82~91 bp(由缺失类型决定)条带，酶切后残存的野生型片段为100 bp的条带。EGFR基因外显子21 (L858R)突变检测使用限制性内切酶MscⅠ酶切第一轮PCR扩增产物，然后以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；第二轮PCR扩增产物再使用限制性内切酶Sau96Ⅰ酶切扩增产物，得到的终产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色观察结果；EGFR 21突变体呈现为99 bp条带，酶切后残存的野生型片段则为130 bp的条带。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件行校正卡方(χ2)检验和Pearson卡方相关性分析。
2 结果
67例肺腺癌患者的肿瘤组织中，TTF-1阳性57例，阴性10例，免疫组织化学染色结果见图 1。共有44例肺癌组织中存在EGFR基因突变，电泳结果见图 2，其中TTF-1阳性者42例，TTF-1阴性者2例。TTF-1阳性患者中EGFR基因突变率为73.7% (42/57)，TTF-1阴性患者中EGFR基因突变率为20.0% (2/10)，两者差异有统计学意义(χ2=8.625，P=0.003)。根据上述结果列出四格表见表 1，在本组病例中以TTF-1表达预测EGFR基因突变的敏感度为95.5% (42/44)，特异度为34.8% (8/23)，阳性预测值为73.7%，阴性预测值为80.0%。
图1
肿瘤组织中的TTF-1表达情况：细胞核染为棕黄色或棕褐色为阳性细胞(Envision二步法染色，DAB显色，×100倍)
图2
EGFR基因突变检测结果：样本出现与阳性对照一致的二根条带为有突变
表1
TTF-1和EGFR基因突变检测结果(例)
3 讨论
EGFR-TKI作为肺腺癌分子靶向药物的代表，在晚期肺腺癌及化疗失败的肺腺癌患者治疗中的作用已得到肯定和认同[4]。正如IPASS研究所阐明的，亚洲人群有着更高的EGFR基因突变率，对经选择的患者应用EGFR-TKI较之铂类药物化疗有着更好的获益[5]。因为并非对所有患者都适用，因此如何筛选能对EGFR-TKI治疗获益的目标人群一直是学者和临床医师所关心的，目前通常的做法是进行EGFR基因及K-ras基因突变的检测[6]，从而筛选出EGFR突变的患者。通常来说这一检测费时、费力，检测费用昂贵且未纳入医保范围，这是限制EGFR-TKI药物广泛应用的瓶颈。鉴于肺癌肿瘤靶向药物治疗并不能取代术后化疗，临床上患者多是在术后复发且化疗失败的情况下才寄希望于EGFR-TKI，此时患者的经济条件和身心状况已不堪重负。本项研究的目的是在病理科常规进行酶标检测的分子靶标中寻找出一种同EGFR基因突变存在关联的指标，以期据此对EGFR基因的表型进行预测，能够在术后早期就为患者日后的辅助治疗提供方向。
查阅近年的文献，有学者报道相当一部分EGFR基因呈突变型的肺腺癌患者中，TTF-1呈阳性表达[7-8]。在很多三级甲等医院的病理科，TTF-1是常规的免疫组化检测项目，用以区分肺腺癌和肺鳞癌，以及原发性肺癌和肺转移瘤。我们通过回顾分析近年来曾进行EGFR基因检测的67例肺腺癌术后患者，同样发现肿瘤组织中TTF-1的表达同EGFR基因的表型存在关联。根据本组数据统计结果，TTF-1表达对EGFR基因突变进行预测的敏感度为95.5%，阴性预测值为80.0%。法国Vallee等[9]报道了1 038例肺腺癌病例中有148例存在EGFR突变，其中TTF-1阳性者145例，而TTF-1阴性病例中仅有3例存在EGFR突变。Somaiah等[10]报道224例TTF-1阴性表达的肺腺癌患者中仅有2例发生EGFR突变，TTF-1阳性表达对EGFR突变的敏感度和特异度分别为99.1%和36.4%，有着极高的阴性预测值。就亚洲人群来看，韩国Sun等[11]报道382例肺腺癌患者中，存在EGFR突变者196例，其中92.7%的患者肿瘤组织中TTF-1呈阳性表达，作者提出亚洲人群中肺腺癌伴EGFR突变者的比例较西方人群更高，且TTF-1阳性比例极大。因此，可以根据TTF-1的免疫组织化学检测结果来预测EGFR基因的表型[12]。我国也有学者报道了肺腺癌组织中TTF-1表达同EGFR基因突变存在关联[13-14]。
就本次研究的结果来看，尽管差异有显著统计学意义，但我们的病例中TTF-1的阳性率以及预测EGFR突变的敏感度要低于文献报道，可能与本组病例数相对较少有关。此外，2011年国际肺癌研究学会、美国胸科学会等将肺腺癌分成多个亚型[15-16]，不同亚型肺腺癌的生物学行为、分子靶标表型，甚至对化疗的反应都不尽相同。有学者提出不同的腺癌亚型TTF-1的表达情况及EGFR突变率亦有不同[17-18]。本组病例数量有限，目前的报道数据仅为初步结果，随着样本量的增加，将进行下一步的分层细化研究。
肺腺癌在胸外科可切除肺癌中占据的比例不断增高，针对腺癌的化疗及靶向治疗方面的研究也不断增多，随着更多的分子靶标与药物疗效的规律被不断揭示，已有肿瘤科医师提倡肺癌术后的个体化治疗。胸外科医师在肺癌中的作用绝不仅是切除肿瘤，还需研究术后病理中的免疫组织化学结果，寻找其中的规律，为后续治疗提供有价值的指导作用。最近有报道TTF-1可作为肺腺癌术后的生存期预测因子，与肿瘤无进展生存时间及总生存期相关[19-20]。我们将进一步增加样本量，探寻深层次的规律，例如不同肺腺癌亚型之间TTF-1表达的差异以及TTF-1状态同靶向治疗效果的关系等，以期利用简便易行，可纳入医保支付范围的免疫组织化学指标为肺癌患者的个体化治疗提供指导。
