微卫星（microsatellite，MS）是指以少数几个核苷酸（多为2～4个）为单位多次串联重复的DNA序列。肺重复癌（肺多原发癌，multiple primary lung cancer）是指一侧肺或两侧肺的不同部位发生两个或两个以上原发癌，其组织类型相同或不同，但各肿瘤之间无从属关系，每个肿瘤的发生有着各自独立的成瘤因素。微卫星异常与肺重复癌的发生及发展密切相关。本文主要综述：①微卫星的概念及产生机制；②微卫星异常；③肺重复癌的概念及分类；④微卫星对肺重复癌的早期诊断和预后治疗的影响。
引用本文： 王鑫, 沈诚, 田龙, 车国卫. 微卫星与肺重复癌的研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(5): 670-674. doi: 10.7507/1007-4848.20140193 复制
随着肺癌发病率升高，肺癌手术得到推广。患者若术后复查发现肺内新生结节或磨玻璃影，难以通过影像学结果判断其究竟是既往肺癌的复发、转移还是第二原发癌（肺重复癌）。但这个问题和患者的后续治疗密切相关，并常使肺重复癌患者失去合理治疗的机会，这种误诊对患者的身心健康产生了极大的伤害并可能危及患者生命。近年来，基因研究日渐深入，使得在亚临床病灶状态下诊断肺重复癌变为可能，而与肺重复癌的发生、发展、诊断有密切关系的微卫星DNA受到广泛关注。本文对微卫星DNA与肺重复癌的研究进展进行综述。
1 微卫星DNA
1.1 微卫星DNA的概念
微卫星DNA （微卫星，microsatellite，MS）是指以少数几个核苷酸（多为2～4个）为单位多次串联重复的DNA序列，又称短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）、简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs）或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism） [1]。微卫星DNA广泛分布于原核、真核生物基因组中，约占人类基因组的5%。一般由1～6个核苷酸组成的重复单元串联排列而成，如（CA）n、（TG）n、（TTA）n、（CAG）n。在人类基因组中以两个核苷酸组成的（CA）n重复序列最为丰富，共约50 000～100 000个，n一般为15～60次，且重复单元相同。
1.2 微卫星的多态性
1988年Weber等[2]用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的方法，鉴定了12种微卫星DNA，发现它们全部具有长度多态性。目前认为串联重复序列的不同重复次数产生微卫星的多态性。由于微卫星等位基因的差异主要由其重复单元的重复次数决定，因此微卫星等位基因数目较大，有些位点多达数十个。微卫星呈高度多态且呈孟德尔式遗传，变异率很低[3]。后续研究进一步证实了微卫星DNA所含有的多态性信息量大，这极大地满足了人们对高度多态性遗传标记的需要，能广泛应用于人种学、动植物学、法医学个体鉴定和亲子鉴定及医学各领域。目前已发现微卫星标记5 000多个，其数目还在不断增加[4]，杂合性超过0.5的占93%，超过0.7的占58%；已用它们制成了迄今最完善的遗传图谱，成为人类基因组计划的一个里程碑。
1.3 微卫星DNA的产生机制与功能
一般认为，重复序列的产生是遗传复制过程中DNA滑动或有丝分裂、减数分裂期染色体的不对等交换所致。Pearson等[5]认为，三体重复的不稳定可能取决于重复序列的内容，而且不同的滑动链结构起着中介作用。因此，该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。微卫星DNA的功能至今尚不完全清楚，目前普遍认为其充当基因重组的热点，可能与基因重排和变异、基因表达调控、维持基因组稳定等多种生命活动有关。微卫星DNA通过改变DNA结构或与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用，是多态信息容量高的分子标志。
1.4 微卫星异常
肿瘤中微卫星异常主要表现为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和微卫星的杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH） [6]。
1.4.1 微卫星不稳定性
微卫星不稳定性是指同一个体肿瘤组织与相应正常上皮细胞中微卫星DNA长度存在差异，表现为重复单元的增加或丢失。与正常组织DNA相比，存在MSI的DNA电泳时出现等位带移动、带强度增加或获得额外带型。关于MSI的产生机制，现阶段认为是由于错配修复基因的突变引起的。正常情况下，错配修复基因通过特异性修复由DNA聚合酶造成的错误掺入进而保持DNA修复的真实性。错配修复基因的缺陷导致复制后错配修复功能丧失，进而增加细胞自发突变的频率使细胞出现所谓的突变子表型。突变子表型被认为是多步癌变过程所需的多个突变子的总和。最为常见的突变子表型为微卫星的复制错误，即出现所谓的粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，RER），而后者成为MSI的基础。微卫星不稳定所形成的错配核苷酸经过一轮DNA复制和细胞分裂后被保留在基因组中，MSI导致基因组中其它基因不稳定，即出现基因组不稳定性。研究发现在胃癌、肺癌等疾病中均有不同程度的MSI出现，故MSI被认为是肿瘤性疾病中普遍存在的现象。
1.4.2 微卫星的杂合性缺失
微卫星的杂合性缺失是指同一个体的正常细胞DNA中存在两个等位基因，而其肿瘤组织DNA中一个等位基因消失，这种改变称为杂合性缺失（LOH）。在DNA电泳时LOH表现为多态性条带的缺失或带强度减弱。LOH产生原因是肿瘤细胞单条染色体中一个等位基因缺失。微卫星的缺失是相应区域DNA缺失的标志。由于许多微卫星都与基因紧密连锁甚至位于基因内部，因此LOH常表示其连锁基因的缺失。
2 肺重复癌
肺重复癌（dual primary bronchogenic carcinoma）是指一侧肺或两侧肺的不同部位发生两个或两个以上原发癌，其组织类型相同或不同，但各肿瘤之间无从属关系。在临床上肺重复癌也称为多原发性肺癌。根据肿瘤发生时间可分为两种：同时性和异时性。
2.1 同时性肺重复癌
现在应用较多的是2003年Detterbeck等[7]在总结Warrant Gates和Martini标准的基础上推荐的新标准，同时性肺重复癌诊断标准为： （1）肿瘤大体检查见两个或两个以上肿瘤之间有明显差异并相互分开； （2）肿瘤的组织学检查发现有以下特点：①肿瘤的组织学类型不同；②肿瘤的组织学类型相同，但肿瘤位于不同的肺段、肺叶或肺，同时满足以下条件：肿瘤起源于原位癌；二者共有的淋巴管内无癌细胞；患者在进行诊断时无肺外转移。
2.2 异时性肺重复癌
异时性肺重复癌的组织细胞类型可以相同，也可以不同。主要包括以下几个特点： （1）患者的无瘤间隔时间至少在2年以上； （2）肿瘤起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）； （3）第2个肿瘤在不同的肺叶或肺，必须满足二者共有的淋巴管内无癌细胞且患者在进行诊断时无肺外转移。
3 微卫星与肺重复癌
近来研究发现，肺癌患者手术治疗后发生肺重复癌的风险相对较高，肺重复癌发病率有升高的趋势。最初临床上根据影像学资料将肺部出现的第2个肿瘤作为转移癌处理，然而Osaki等[8]提出这些被诊断为转移癌的肺肿瘤也表现为孤立的肿块，其可能是一个异时性的原发性肺癌。而对于同一肺叶内同时出现的多个病灶，影像学及传统的组织病理学诊断方法不能准确地区分肿块是肺癌的转移灶还是同时性肺重复癌[9]。
肺癌的发生、发展过程中有多种复杂遗传学和表观遗传学改变逐步发生，常常涉及等位基因缺失、染色体不稳定和不平衡、抑癌基因和原癌基因的突变[10]。在蛋白质层面上，Ono等[11]通过检测癌相关蛋白表达的改变来区分肺重复癌及转移癌；在DNA层面上，Garnis[12]通过基因芯片技术对肺鳞癌和腺癌细胞系进行高分辨率全基因组分析，发现其常出现5p、7号染色体、8q、11q13、19q和20q的区域性扩增，也常出现3p、4q、9p、10p、10q及18和21号染色体某些区域的缺失。基于此，相关研究提示可以从分子层面寻找对肺重复癌与转移癌起到真正鉴别作用的方法。与此同时，和肺癌的发生、发展、诊断有密切关系的微卫星DNA引起了大家的高度关注[13]。
3.1 微卫星异常与肺重复癌的早期诊断
3.1.1 以基因点突变
为检测靶点Reichel等[14]发现，位于17p染色体上的p53在肿瘤发生时出现了典型突变。在他们所研究的78%的样本中，每一对样本，即肺癌原发灶与转移灶，都在p53上表现为相同的点突变，这说明p53的突变可以作为肺癌发生及转移过程的一个早期诊断的指标；Chung [15]和Gasparotto等[16]都提出，当同一患者的两个肿块上都检测到p53出现相同点突变时，可说明第二个肿块与原发灶是转移的关系；相反，若两个肿块的p53检测表现出不同的点突变，则说明两个肿块之间没有关系，是相互独立的[17-19]。除了p53基因，K-ras基因也可作为检测靶点辅助肺重复癌的鉴别诊断[20-21]。Wu等 [22]结合检测肿瘤的EGFR基因和p53基因突变情况使其对肺重复癌的检出率达到了77.3% （75/97）。然而使用点突变鉴别原发癌和转移癌存在局限性，随着肿瘤细胞的进展、演进，其基因也可呈现出新突变。例如，临床上常见的易瑞沙获得性耐药现象，约52%是因为T790M出现新突变[23]。
3.1.2 以微卫星变化
为检测靶点Geurts等[24]提出，通过检测微卫星的杂合性缺失来说明肺部肿瘤之间的关系。他们应用12个微卫星标记检测了44例患者的LOH，同时评价患者临床评分，并比较二者鉴别头颈部癌灶与肺部癌灶是转移癌还是肺重复癌的情况。结果在用临床评分鉴别时转移癌为38例，肺重复癌为6例；而应用LOH分析时转移癌为19例，肺重复癌为24例（另有1例LOH分析未得出结论）。近50%的患者通过LOH检测方法都诊断为肺重复癌，这些患者因此可以进行手术治疗。这表明微卫星的杂合性缺失可以作为肺重复癌早期诊断的一个方法。
然而，Mercer等[25]提出，虽然这个方法可以有效地区别肿瘤之间的关系，但是它的不足之处在于试验时必须以正常组织作为对照。这种方法在通过细针穿刺活组织检查获得肿瘤组织时不太适用。因此，通过比较两个癌灶之间的等位基因变化，他们发现转移癌和肺重复癌的微卫星改变有着各自特异的变化趋势，而这些不同的变化趋势可以帮助鉴别诊断肺重复癌。Mercer等[25]选择了20个微卫星标记，10例患者临床病理诊断为肺重复癌，1例患者临床病理诊断为肺转移癌。10例肺重复癌患者中等位基因变化阳性率为10%～80%。在肺转移癌中，所有的微卫星标记都与原发灶中的等位基因变化一致，均为原发灶中等位基因的变化多于转移灶。而在肺重复癌中，原发癌灶与第二个癌灶之间有独立的等位基因变化趋势，即同时出现原发灶的某些等位基因变化多于第二个癌灶以及第二个癌灶的某些等位基因变化多于原发灶。这种判定方法既不用依赖于收集正常组织，又能在肺重复癌的早期诊断中发挥重要作用。Mercer的研究方法虽然对鉴别肺重复癌提供了良好的方案，但其涉及的患者均为肺鳞癌，且病例数较少，其方法是否适用于所有非小细胞肺癌仍待验证。
Shen等 [26]在此基础上增加病例数，结合位点的敏感性，筛选了其中6组位点（D2S1363，D6S1056，D7S1824，D10S1239，D15S822，D22S689），将肺腺癌及肺鳞癌患者同时纳入研究，进一步验证肺内多癌灶间的微卫星关系，此外通过比较不同病理类型与同病理类型的肺内多癌灶的微卫星变化，有效地鉴别了同时性肺内多癌灶是转移所致还是多原发性肺癌。
3.2 微卫星异常与肺重复癌的预后诊断
微卫星DNA不仅可以很好地用于肺癌的早期基因诊断，而且由于分化低、进展快、分期晚的肺癌病理组织的LOH和MSI的阳性率更高，提示微卫星异常有判断预后的意义。
Huang等[27]应用12个微卫星标记检测6例肺转移癌患者和9例肺重复癌患者中LOH情况。结果6例转移癌患者原发灶和转移灶有相同的LOH，同时随着癌灶分化越低，分期越晚，LOH阳性率越高。这种趋势提示区分转移癌和肺重复癌以及肺重复癌的同时性与异时性对患者的治疗和预后有重要意义，这个结果与Deschamps等[28]的研究相似。Deschamps等[28]选择了80例肺重复癌患者进行预后研究，其中同时性肺重复癌36例，异时性肺重复癌44例。44例异时性肺重复癌患者第一次癌灶切除术后5年生存率与10年生存率分别为55.2%和27.0%，第二次癌灶切除术后5年生存率与10年生存率分别为41.0%和31.5%。而36例同时性肺重复癌患者癌灶切除术后5年生存率和10年生存率较异时性肺重复癌患者明显降低，分别为15.7%和13.8%。由此可见，微卫星异常及其鉴别原发性肺癌与第二个癌灶关系所产生的对治疗选择和预后的影响有重要意义[29]。
3.3 外周血游离DNA的微卫星异常与肺重复癌
通过获取肺癌组织行微卫星检测不能完全满足临床需要，是否能通过血液学检测了解微卫星的改变从而判断肺重复癌、评估预后、监测病情变化？早在1977年，就有研究发现肿瘤患者的游离DNA浓度高于健康对照人群[30]。尽管血液中肿瘤相关游离DNA产生的具体机制仍未详细阐明，但是很多研究提示通过抽血检测肿瘤相关DNA可以实现早期诊断、评估预后、发现肿瘤亚临床复发、甚至检测到表皮生长因子受体（EGFR）基因的突变情况[31-34]。Beau-Faller等[35]选择了12个位点进行检测，34例肺癌患者（包括小细胞和非小细胞肺癌）中有30例可以通过血浆DNA检测到微卫星不稳定性，其发生微卫星不稳定的位点常常不固定，分析数据发现检测到D9S171和D9S179微卫星不稳定性的患者总体生存期明显少于未检测到的患者。对于小细胞肺癌，位于3p、17p13的微卫星位点敏感性较高；对于非小细胞肺癌，位于染色体5q、9p、9q和20q的位点则更加敏感。血浆与肿瘤组织中的微卫星改变通常较为一致，尤其随着定量PCR的普遍使用，血浆中微量的DNA也可被敏感地测定[35-36]。众所周知，肿瘤细胞存在异质性，一些研究发现了这样的现象，同一患者的血浆DNA可以检测到微卫星改变，而在肿瘤样本中却没有，这种概率常常小于10% [31, 35-38]，目前认为这个现象是取材误差所致，主要见于细针穿刺、刷片取得的少量肿瘤细胞，不能代表肿瘤整体，这个误差可以通过增加取材样本数量、多点取材来避免。
结合Mercer与Shen的研究，提示我们或许可以使用血浆游离DNA检测微卫星来帮助鉴别肺重复癌与转移癌。其可行性基于，一方面血液和肿瘤组织的变化较为一致，对于既往癌症术后患者随访见肺内新生物，可抽血检查微卫星情况，同时与手术标本进行微卫星比较，若血浆微卫星PCR见新的微卫星改变则考虑肺内新生物为第二原发癌；另一方面，对于同时性肺内多结节患者，可通过穿刺、纤维支气管镜获得至少一个结节的标本，并抽取血液样本，同时行微卫星PCR进行比较以帮助诊断。由于肿瘤内部异质性的存在，对抽血检查的特异性存在一定影响，其临床意义有待更多研究验证。
4 现存问题与展望
虽然Mercer与Shen的微卫星DNA序列分析应用于临床仍存在一些问题，比如分析位点的选择与肿瘤生物学特性密切相关，因此位点的选择对检测的敏感性、特异性有重要影响，但随着微卫星DNA检测技术的渐趋完备，如能通过基因芯片筛查验证更好的位点，微卫星异常分析在基因诊断领域有可能成为肿瘤早期诊断及预后判断的有效手段。
配合特异性的微卫星检测，血浆中的游离DNA将成为有相当应用前景的检测途径，然而血浆游离DNA因其产生机制机理仍未完全阐明，较大片段DNA（>200～300 bp）常常无法成功进行PCR[35, 37]，更适合于血液标本的微卫星位点还需更多研究探索验证，但其具有无创、早期、快速等优点，可达到早期诊断、早期治疗、最终提高肺重复癌患者存活率的目的；此外，按目前诊疗方案不适合手术的肺重复癌患者或许可通过检测血浆游离DNA这种无创检测方法，得到更可靠的诊断，减少肺重复癌的误诊误治。
随着肺癌发病率升高，肺癌手术得到推广。患者若术后复查发现肺内新生结节或磨玻璃影，难以通过影像学结果判断其究竟是既往肺癌的复发、转移还是第二原发癌（肺重复癌）。但这个问题和患者的后续治疗密切相关，并常使肺重复癌患者失去合理治疗的机会，这种误诊对患者的身心健康产生了极大的伤害并可能危及患者生命。近年来，基因研究日渐深入，使得在亚临床病灶状态下诊断肺重复癌变为可能，而与肺重复癌的发生、发展、诊断有密切关系的微卫星DNA受到广泛关注。本文对微卫星DNA与肺重复癌的研究进展进行综述。
1 微卫星DNA
1.1 微卫星DNA的概念
微卫星DNA （微卫星，microsatellite，MS）是指以少数几个核苷酸（多为2～4个）为单位多次串联重复的DNA序列，又称短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）、简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs）或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism） [1]。微卫星DNA广泛分布于原核、真核生物基因组中，约占人类基因组的5%。一般由1～6个核苷酸组成的重复单元串联排列而成，如（CA）n、（TG）n、（TTA）n、（CAG）n。在人类基因组中以两个核苷酸组成的（CA）n重复序列最为丰富，共约50 000～100 000个，n一般为15～60次，且重复单元相同。
1.2 微卫星的多态性
1988年Weber等[2]用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的方法，鉴定了12种微卫星DNA，发现它们全部具有长度多态性。目前认为串联重复序列的不同重复次数产生微卫星的多态性。由于微卫星等位基因的差异主要由其重复单元的重复次数决定，因此微卫星等位基因数目较大，有些位点多达数十个。微卫星呈高度多态且呈孟德尔式遗传，变异率很低[3]。后续研究进一步证实了微卫星DNA所含有的多态性信息量大，这极大地满足了人们对高度多态性遗传标记的需要，能广泛应用于人种学、动植物学、法医学个体鉴定和亲子鉴定及医学各领域。目前已发现微卫星标记5 000多个，其数目还在不断增加[4]，杂合性超过0.5的占93%，超过0.7的占58%；已用它们制成了迄今最完善的遗传图谱，成为人类基因组计划的一个里程碑。
1.3 微卫星DNA的产生机制与功能
一般认为，重复序列的产生是遗传复制过程中DNA滑动或有丝分裂、减数分裂期染色体的不对等交换所致。Pearson等[5]认为，三体重复的不稳定可能取决于重复序列的内容，而且不同的滑动链结构起着中介作用。因此，该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。微卫星DNA的功能至今尚不完全清楚，目前普遍认为其充当基因重组的热点，可能与基因重排和变异、基因表达调控、维持基因组稳定等多种生命活动有关。微卫星DNA通过改变DNA结构或与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用，是多态信息容量高的分子标志。
1.4 微卫星异常
肿瘤中微卫星异常主要表现为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和微卫星的杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH） [6]。
1.4.1 微卫星不稳定性
微卫星不稳定性是指同一个体肿瘤组织与相应正常上皮细胞中微卫星DNA长度存在差异，表现为重复单元的增加或丢失。与正常组织DNA相比，存在MSI的DNA电泳时出现等位带移动、带强度增加或获得额外带型。关于MSI的产生机制，现阶段认为是由于错配修复基因的突变引起的。正常情况下，错配修复基因通过特异性修复由DNA聚合酶造成的错误掺入进而保持DNA修复的真实性。错配修复基因的缺陷导致复制后错配修复功能丧失，进而增加细胞自发突变的频率使细胞出现所谓的突变子表型。突变子表型被认为是多步癌变过程所需的多个突变子的总和。最为常见的突变子表型为微卫星的复制错误，即出现所谓的粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，RER），而后者成为MSI的基础。微卫星不稳定所形成的错配核苷酸经过一轮DNA复制和细胞分裂后被保留在基因组中，MSI导致基因组中其它基因不稳定，即出现基因组不稳定性。研究发现在胃癌、肺癌等疾病中均有不同程度的MSI出现，故MSI被认为是肿瘤性疾病中普遍存在的现象。
1.4.2 微卫星的杂合性缺失
微卫星的杂合性缺失是指同一个体的正常细胞DNA中存在两个等位基因，而其肿瘤组织DNA中一个等位基因消失，这种改变称为杂合性缺失（LOH）。在DNA电泳时LOH表现为多态性条带的缺失或带强度减弱。LOH产生原因是肿瘤细胞单条染色体中一个等位基因缺失。微卫星的缺失是相应区域DNA缺失的标志。由于许多微卫星都与基因紧密连锁甚至位于基因内部，因此LOH常表示其连锁基因的缺失。
2 肺重复癌
肺重复癌（dual primary bronchogenic carcinoma）是指一侧肺或两侧肺的不同部位发生两个或两个以上原发癌，其组织类型相同或不同，但各肿瘤之间无从属关系。在临床上肺重复癌也称为多原发性肺癌。根据肿瘤发生时间可分为两种：同时性和异时性。
2.1 同时性肺重复癌
现在应用较多的是2003年Detterbeck等[7]在总结Warrant Gates和Martini标准的基础上推荐的新标准，同时性肺重复癌诊断标准为： （1）肿瘤大体检查见两个或两个以上肿瘤之间有明显差异并相互分开； （2）肿瘤的组织学检查发现有以下特点：①肿瘤的组织学类型不同；②肿瘤的组织学类型相同，但肿瘤位于不同的肺段、肺叶或肺，同时满足以下条件：肿瘤起源于原位癌；二者共有的淋巴管内无癌细胞；患者在进行诊断时无肺外转移。
2.2 异时性肺重复癌
异时性肺重复癌的组织细胞类型可以相同，也可以不同。主要包括以下几个特点： （1）患者的无瘤间隔时间至少在2年以上； （2）肿瘤起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）； （3）第2个肿瘤在不同的肺叶或肺，必须满足二者共有的淋巴管内无癌细胞且患者在进行诊断时无肺外转移。
3 微卫星与肺重复癌
近来研究发现，肺癌患者手术治疗后发生肺重复癌的风险相对较高，肺重复癌发病率有升高的趋势。最初临床上根据影像学资料将肺部出现的第2个肿瘤作为转移癌处理，然而Osaki等[8]提出这些被诊断为转移癌的肺肿瘤也表现为孤立的肿块，其可能是一个异时性的原发性肺癌。而对于同一肺叶内同时出现的多个病灶，影像学及传统的组织病理学诊断方法不能准确地区分肿块是肺癌的转移灶还是同时性肺重复癌[9]。
肺癌的发生、发展过程中有多种复杂遗传学和表观遗传学改变逐步发生，常常涉及等位基因缺失、染色体不稳定和不平衡、抑癌基因和原癌基因的突变[10]。在蛋白质层面上，Ono等[11]通过检测癌相关蛋白表达的改变来区分肺重复癌及转移癌；在DNA层面上，Garnis[12]通过基因芯片技术对肺鳞癌和腺癌细胞系进行高分辨率全基因组分析，发现其常出现5p、7号染色体、8q、11q13、19q和20q的区域性扩增，也常出现3p、4q、9p、10p、10q及18和21号染色体某些区域的缺失。基于此，相关研究提示可以从分子层面寻找对肺重复癌与转移癌起到真正鉴别作用的方法。与此同时，和肺癌的发生、发展、诊断有密切关系的微卫星DNA引起了大家的高度关注[13]。
3.1 微卫星异常与肺重复癌的早期诊断
3.1.1 以基因点突变
为检测靶点Reichel等[14]发现，位于17p染色体上的p53在肿瘤发生时出现了典型突变。在他们所研究的78%的样本中，每一对样本，即肺癌原发灶与转移灶，都在p53上表现为相同的点突变，这说明p53的突变可以作为肺癌发生及转移过程的一个早期诊断的指标；Chung [15]和Gasparotto等[16]都提出，当同一患者的两个肿块上都检测到p53出现相同点突变时，可说明第二个肿块与原发灶是转移的关系；相反，若两个肿块的p53检测表现出不同的点突变，则说明两个肿块之间没有关系，是相互独立的[17-19]。除了p53基因，K-ras基因也可作为检测靶点辅助肺重复癌的鉴别诊断[20-21]。Wu等 [22]结合检测肿瘤的EGFR基因和p53基因突变情况使其对肺重复癌的检出率达到了77.3% （75/97）。然而使用点突变鉴别原发癌和转移癌存在局限性，随着肿瘤细胞的进展、演进，其基因也可呈现出新突变。例如，临床上常见的易瑞沙获得性耐药现象，约52%是因为T790M出现新突变[23]。
3.1.2 以微卫星变化
为检测靶点Geurts等[24]提出，通过检测微卫星的杂合性缺失来说明肺部肿瘤之间的关系。他们应用12个微卫星标记检测了44例患者的LOH，同时评价患者临床评分，并比较二者鉴别头颈部癌灶与肺部癌灶是转移癌还是肺重复癌的情况。结果在用临床评分鉴别时转移癌为38例，肺重复癌为6例；而应用LOH分析时转移癌为19例，肺重复癌为24例（另有1例LOH分析未得出结论）。近50%的患者通过LOH检测方法都诊断为肺重复癌，这些患者因此可以进行手术治疗。这表明微卫星的杂合性缺失可以作为肺重复癌早期诊断的一个方法。
然而，Mercer等[25]提出，虽然这个方法可以有效地区别肿瘤之间的关系，但是它的不足之处在于试验时必须以正常组织作为对照。这种方法在通过细针穿刺活组织检查获得肿瘤组织时不太适用。因此，通过比较两个癌灶之间的等位基因变化，他们发现转移癌和肺重复癌的微卫星改变有着各自特异的变化趋势，而这些不同的变化趋势可以帮助鉴别诊断肺重复癌。Mercer等[25]选择了20个微卫星标记，10例患者临床病理诊断为肺重复癌，1例患者临床病理诊断为肺转移癌。10例肺重复癌患者中等位基因变化阳性率为10%～80%。在肺转移癌中，所有的微卫星标记都与原发灶中的等位基因变化一致，均为原发灶中等位基因的变化多于转移灶。而在肺重复癌中，原发癌灶与第二个癌灶之间有独立的等位基因变化趋势，即同时出现原发灶的某些等位基因变化多于第二个癌灶以及第二个癌灶的某些等位基因变化多于原发灶。这种判定方法既不用依赖于收集正常组织，又能在肺重复癌的早期诊断中发挥重要作用。Mercer的研究方法虽然对鉴别肺重复癌提供了良好的方案，但其涉及的患者均为肺鳞癌，且病例数较少，其方法是否适用于所有非小细胞肺癌仍待验证。
Shen等 [26]在此基础上增加病例数，结合位点的敏感性，筛选了其中6组位点（D2S1363，D6S1056，D7S1824，D10S1239，D15S822，D22S689），将肺腺癌及肺鳞癌患者同时纳入研究，进一步验证肺内多癌灶间的微卫星关系，此外通过比较不同病理类型与同病理类型的肺内多癌灶的微卫星变化，有效地鉴别了同时性肺内多癌灶是转移所致还是多原发性肺癌。
3.2 微卫星异常与肺重复癌的预后诊断
微卫星DNA不仅可以很好地用于肺癌的早期基因诊断，而且由于分化低、进展快、分期晚的肺癌病理组织的LOH和MSI的阳性率更高，提示微卫星异常有判断预后的意义。
Huang等[27]应用12个微卫星标记检测6例肺转移癌患者和9例肺重复癌患者中LOH情况。结果6例转移癌患者原发灶和转移灶有相同的LOH，同时随着癌灶分化越低，分期越晚，LOH阳性率越高。这种趋势提示区分转移癌和肺重复癌以及肺重复癌的同时性与异时性对患者的治疗和预后有重要意义，这个结果与Deschamps等[28]的研究相似。Deschamps等[28]选择了80例肺重复癌患者进行预后研究，其中同时性肺重复癌36例，异时性肺重复癌44例。44例异时性肺重复癌患者第一次癌灶切除术后5年生存率与10年生存率分别为55.2%和27.0%，第二次癌灶切除术后5年生存率与10年生存率分别为41.0%和31.5%。而36例同时性肺重复癌患者癌灶切除术后5年生存率和10年生存率较异时性肺重复癌患者明显降低，分别为15.7%和13.8%。由此可见，微卫星异常及其鉴别原发性肺癌与第二个癌灶关系所产生的对治疗选择和预后的影响有重要意义[29]。
3.3 外周血游离DNA的微卫星异常与肺重复癌
通过获取肺癌组织行微卫星检测不能完全满足临床需要，是否能通过血液学检测了解微卫星的改变从而判断肺重复癌、评估预后、监测病情变化？早在1977年，就有研究发现肿瘤患者的游离DNA浓度高于健康对照人群[30]。尽管血液中肿瘤相关游离DNA产生的具体机制仍未详细阐明，但是很多研究提示通过抽血检测肿瘤相关DNA可以实现早期诊断、评估预后、发现肿瘤亚临床复发、甚至检测到表皮生长因子受体（EGFR）基因的突变情况[31-34]。Beau-Faller等[35]选择了12个位点进行检测，34例肺癌患者（包括小细胞和非小细胞肺癌）中有30例可以通过血浆DNA检测到微卫星不稳定性，其发生微卫星不稳定的位点常常不固定，分析数据发现检测到D9S171和D9S179微卫星不稳定性的患者总体生存期明显少于未检测到的患者。对于小细胞肺癌，位于3p、17p13的微卫星位点敏感性较高；对于非小细胞肺癌，位于染色体5q、9p、9q和20q的位点则更加敏感。血浆与肿瘤组织中的微卫星改变通常较为一致，尤其随着定量PCR的普遍使用，血浆中微量的DNA也可被敏感地测定[35-36]。众所周知，肿瘤细胞存在异质性，一些研究发现了这样的现象，同一患者的血浆DNA可以检测到微卫星改变，而在肿瘤样本中却没有，这种概率常常小于10% [31, 35-38]，目前认为这个现象是取材误差所致，主要见于细针穿刺、刷片取得的少量肿瘤细胞，不能代表肿瘤整体，这个误差可以通过增加取材样本数量、多点取材来避免。
结合Mercer与Shen的研究，提示我们或许可以使用血浆游离DNA检测微卫星来帮助鉴别肺重复癌与转移癌。其可行性基于，一方面血液和肿瘤组织的变化较为一致，对于既往癌症术后患者随访见肺内新生物，可抽血检查微卫星情况，同时与手术标本进行微卫星比较，若血浆微卫星PCR见新的微卫星改变则考虑肺内新生物为第二原发癌；另一方面，对于同时性肺内多结节患者，可通过穿刺、纤维支气管镜获得至少一个结节的标本，并抽取血液样本，同时行微卫星PCR进行比较以帮助诊断。由于肿瘤内部异质性的存在，对抽血检查的特异性存在一定影响，其临床意义有待更多研究验证。
4 现存问题与展望
虽然Mercer与Shen的微卫星DNA序列分析应用于临床仍存在一些问题，比如分析位点的选择与肿瘤生物学特性密切相关，因此位点的选择对检测的敏感性、特异性有重要影响，但随着微卫星DNA检测技术的渐趋完备，如能通过基因芯片筛查验证更好的位点，微卫星异常分析在基因诊断领域有可能成为肿瘤早期诊断及预后判断的有效手段。
配合特异性的微卫星检测，血浆中的游离DNA将成为有相当应用前景的检测途径，然而血浆游离DNA因其产生机制机理仍未完全阐明，较大片段DNA（>200～300 bp）常常无法成功进行PCR[35, 37]，更适合于血液标本的微卫星位点还需更多研究探索验证，但其具有无创、早期、快速等优点，可达到早期诊断、早期治疗、最终提高肺重复癌患者存活率的目的；此外，按目前诊疗方案不适合手术的肺重复癌患者或许可通过检测血浆游离DNA这种无创检测方法，得到更可靠的诊断，减少肺重复癌的误诊误治。