引用本文： 干昌平, 邱旭, 安琪, 石应康. 上调大鼠骨髓中性粒细胞CXCR4表达对减少其在体外循环中释放的作用. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(1): 66-70. doi: 10.7507/1007-4848.20150019 复制
体外循环（extracorporeal circulation，ECC）是心脏外科等领域一项重要的治疗和辅助手段。ECC过程中血液不可避免地与异物表面接触将导致白细胞，特别是中性粒细胞的激活并引起全身炎性反应和器官功能障碍[1-2]。ECC后外周血中性粒细胞数量的快速增加主要缘自骨髓储备的快速释放。释放入血的中性粒细胞又能进一步维持和扩大炎性反应。以往的研究[3-4]提示中性粒细胞表面表达的趋化因子受体4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]和骨髓基质细胞广泛表达的基质细胞获得因子-1α（stromal cell-derived factor，SDF-1α）之间的连接是控制和调节骨髓中性粒细胞释放的重要因素，CXCR4/SDF-1α的连接活性降低或CXCR4的表达减少，均能导致中性粒细胞的快速释放。既然CXCR4/SDF-1α连接的破坏可以导致骨髓中性粒细胞快速释放，那如果通过上调骨髓中性粒细胞CXCR4表达，加强其连接是否就可以阻止体外循环中骨髓中性粒细胞的大量释放呢？目前尚未见相关研究。
L-选择素的天然配体硫苷脂（sulfatide，3-sulfated galactosylceramide）和岩藻依聚糖（fucoidan）可在体外培养中上调淋巴细胞表面CXCR4表达，并增加淋巴细胞与SDF-1α的亲和力[5]，但其在体内环境中的作用尚未得到验证。如果可以实现体内的上调，这种体内的上调作用和体外循环相关的骨髓中性粒细胞快速释放又有怎样的关系呢？基于这些问题，本文拟通过大鼠股骨骨髓原位灌注模型研究体内使用岩藻依聚糖上调骨髓内中性粒细胞CXCR4表达的可能性，并探索其对体外循环相关骨髓中性粒细胞快速释放的调节作用。
1 资料与方法
1.1 材料和分组
1.1.1 实验材料
本研究所使用实验动物选择雄性成年SD大鼠（由四川省动物实验中心提供），体重250～300 g。实验中炎性反应刺激源为ECC后大鼠血浆，岩藻依聚糖（sigma）溶液浓度为250 μg/ml，自行配制。
1.1.2 实验分组
灌注岩藻依聚糖对大鼠骨髓中性粒细胞CXCR4表达的影响实验（实验一）中12只大鼠随机分为2 组，每组6只，每组大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（见实验方法），其中实验组（F组）以岩藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓，对照组（C组）以Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液灌注骨髓。两组灌注后均收集静脉端灌出液。
灌注岩藻依聚糖对大鼠体外循环相关骨髓中性粒细胞释放的影响实验（实验二）中18只大鼠随机分为3组，每组6只，每组大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（见实验方法），其中F’组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予岩藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓；F+AMD3100组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予岩藻依聚糖（sigma）溶液和CXCR4抗体拮抗剂AMD-3100灌注骨髓，对照组C’组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液灌注骨髓。各组灌注后收集静脉端灌出液。
1.2 实验方法和标本检测
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
参照Grocott等[6]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右侧颈总动脉及左侧股静脉插管，预充平衡盐溶液6 ml，以大鼠平均心输出量1/5流量[32 ml/（kg·min）]并行ECC 1 h。鱼精蛋白中和肝素后抽取全血分离血浆。本实验使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分离所得血浆均分为3份，作为炎性反应刺激源分别用于后续实验分组后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
参照Burdon等[7] 的方法改良，全身麻醉大鼠解剖显露髂外动静脉，5-0丝线结扎尾腹动脉（caudal abdominal artery）、髂浅旋动脉（superficial iliac circumflex artery）和阴部腹壁动脉干（pudendoepigastric trunk）及其伴行静脉。处死大鼠后立即以24 G留置针导管由近心端向远心端行股动脉置管，并以22 G留置针导管由近心端向远心端行股静脉置管，以微量泵经股动脉插管灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液（北京迈晨科技）或实验干预物质，收集静脉插管灌出液。
1.2.3 实验一灌注策略、标本收集和检测
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后动脉端接入微量注射泵，先以1 ml/min的速度灌注5 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液冲洗血管中残留血液。实验开始后，F组（n=6）采用岩藻依聚糖（sigma）溶液，C组（n=6）采用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，以0.1 ml/min的速度分别灌入6 ml岩藻依聚糖溶液或缓冲液，持续1 h。灌入岩藻依聚糖溶液浓度为250 μg/ml。
灌注完成后解剖分离大鼠股骨，剪开股骨两端骨骺暴露骨髓腔，以5 ml Hanks平衡盐溶液（HyClone）轻柔冲洗股骨一端，自另一侧断端收集冲洗液。冲洗液在200 g、4℃下离心10 min，弃去上清液，沉淀以低张法（以1 ml 0.2% NaCl溶液清洗30 s，立即继以等体积1.6% NaCl溶液清洗30 s，重复一次）去除残留红细胞。剩余白细胞重悬于PBS缓冲液中。获取的F组和C组重悬白细胞样本中分别加入兔抗大鼠CXCR4多克隆抗体（一抗）（abcam）和兔单克隆抗体IgG同型对照抗体（cell signaling），4℃下孵育30 min，清洗两次后避光环境中加入FITC标记山羊抗兔IgG二抗（millipore corporation），4℃下孵育30 min，细胞清洗两次后重悬于PBS缓冲液，流式细胞仪检测中性粒细胞表面CXCR4表达。
1.2.4 实验二灌注策略、标本收集和检测
冲洗血管中残留血液后F’组先以0.1 ml/min的速度灌入浓度为250 μg/ml的岩藻依聚糖溶液6ml，持续1 h；继以0.1 ml/min的速度灌入1 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，共10 min；最后以0.1 ml /min的速度灌入ECC后大鼠血浆1 ml，共10 min。F+AMD3100组以0.1 ml/min灌入6 ml岩藻依聚糖溶液后再以0.1 ml/min的速度灌入1 ml浓度12.5 μg/ml的AMD-3100溶液，共10 min；最后同样灌入ECC后大鼠血浆。C’组先以0.1 ml/min的速度灌入7 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，共70 min，继以0.1 ml/min的速度灌入ECC后大鼠血浆1 ml，共10 min。
以上灌注完成后每组均以1 ml/min的速度灌入Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液共计40 min并收集灌出液。3组灌注总时间均为120 min。收集股静脉灌出液于离心管中并记录体积，灌出液在200 g、4℃下离心10 min，弃去上清液，沉淀以低张法去除残留红细胞。剩余白细胞重悬于500 μl PBS缓冲液中，充分混匀后取该重悬液10 μl加入40 μl 1%冰醋酸中并于显微镜下多次计数白细胞总数，求得灌注液样本中白细胞总数平均值。剩余重悬白细胞经流式细胞仪检测，在前向光散射/侧向光散射（FSC/SSC）散点图中分别划出白细胞和中性粒细胞门，结合前述计数值求得样本骨髓释放或灌入中性粒细胞总数。
1.3 统计学分析
采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 一般结果
实验中6只SD大鼠建立ECC并采集分离血浆，6只大鼠平均体重为（292.2±15.4）g。实验一中F组6只大鼠平均体重为（268.7±9.5）g，对照组（C组）6只大鼠平均体重为（269.3±13.0）g，两组大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）。实验二中F’组、F+AMD3100组和C’组大鼠平均体重分别为（270.7±10.8）g、（267.2±15.7）g和（273.7±9.7）g，三组间大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 灌注岩藻依聚糖对大鼠骨髓中性粒细胞CXCR4表达的影响
经流式细胞仪检测，F组（岩藻依聚糖灌注组）骨髓冲出中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例平均为4.71%±0.21%，中性粒细胞CXCR4平均荧光强度为（161.3±7.8）（图 1A）；C组（缓冲液对照组）冲出中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例平均为1.11%±0.11%，中性粒细胞CXCR4平均荧光强度为（58.4±6.5）（图 1B）。与对照组相比，岩藻依聚糖灌注后大鼠骨髓中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例（图 2）和CXCR4平均荧光强度均较高（图 3），差异有统计学意义（P<0.05）。
图1
F组与C组骨髓CXCR4（+）中性粒细胞比例
注：A为F组，B为C组
图2
F组与C组骨髓CXCR4（+）中性粒细胞比例比较 图 3 F组与C组骨髓中性粒细胞CXCR4平均荧光强度比较
注：*
2.3 灌注岩藻依聚糖对大鼠体外循环相关骨髓中性粒细释放的影响
在40 min的灌注中，F’组（岩藻依聚糖灌注组）共收集到骨髓中性粒细胞（261 393.7±12 470.6）个，远小于对照组的（818 675.2±10 708.8）个，两组差异有统计学意义（P<0.05）；使用岩藻依聚糖的同时加用CXCR4抗体拮抗剂可取消岩藻依聚糖对骨髓中性粒细胞释放的抑制作用，明显增加释放，释放总数不仅远高于F’组，甚至超过对照组达到（872 635.2±10 430.6）个，F+AMD3100组（岩藻依聚糖+AMD3100灌注组）骨髓释放中性粒细胞总数与F’组和C’组（缓冲液对照组）相比差异均有统计学意义（P<0.05）（图 4）。
图3
各组骨髓释放中性粒细胞总数比较
注：*
3 讨论
在ECC相关炎性反应过程中，骨髓释放的中性粒细胞起着重要作用，释放的中性粒细胞不仅直接参与炎性损害，激活后还能通过各种机制再次促进骨髓释放更多的中性粒细胞，形成瀑布式的连锁反应。既然骨髓中性粒细胞CXCR4的表达下降，或其与SDF-1α之间连接的减弱均可导致骨髓中性粒细胞的释放增加。反之，如果上调其表达或增强其与SDF-1α之间的连接关系就能减少骨髓中性粒细胞的释放也是符合逻辑的。事实上，在先天性髓样粒细胞缺乏症（WHIM综合征）中，正是因为CXCR4对SDF-1α的敏感性增加造成了骨髓释放中性粒细胞的减少[8]。这样类似的机理能否应用于减少ECC相关的骨髓中性粒细胞释放正是本研究的目的。
稳态下骨髓储备中成熟的中性粒细胞表达着较低但能够检测出的CXCR4，但中性粒细胞胞内CXCR4表达却很高，这使得在需要的时候中性粒细胞可以通过出胞作用快速上调细胞表面CXCR4的表达[3, 9]。目前已有的关于粒细胞CXCR4表达上调的研究都局限在体外分离细胞的实验中[5, 10]，应用100 μg/ml的硫苷脂和岩藻依聚糖体外培养分离所得人淋巴细胞1 h可将其CXCR4阳性率分别提升至之前的近1.5倍和2倍。这种作用来自于L-选择素介导的酪氨酸激酶相关的胞内信号通路的激活，以及继而发生的胞内CXCR4向细胞外动员的增加和内化作用的减少。本实验发现，这种L-选择素的天然配体在体内环境中也能有效上调中性粒细胞表面CXCR4的表达。经过1 h灌注，骨髓中性粒细胞CXCR4阳性细胞比例和中性粒细胞CXCR4荧光强度均增加至基础值的3倍左右，这和以前报道的体外实验结果基本吻合。这也是第一次通过实验的方法证实了在体内环境中上调骨髓中性粒细胞CXCR4的表达是完全可行和有效的。
解决了骨髓中性粒细胞在原位表达CXCR4上调的问题，就等于打下了减少其释放的基础。针对这一问题本研究也进行了进一步的探索。利用大鼠股骨骨髓原位灌注模型我们发现，面对ECC后血浆的刺激，岩藻依聚糖的处理很好地抑制了骨髓中性粒细胞的大量释放，而这一效果能够被CXCR4的拮抗剂AMD3100所取消。这一实验结果很好地证明了，也是首次发现CXCR4的上调剂能够在体内环境中明显抑制ECC相关的骨髓中性粒细胞快速释放。
这一发现对ECC相关全身炎性反应的预防和治疗有着较大的启发意义，如果能够通过改变骨髓内中性粒细胞趋化因子受体的表达，减少其在ECC中的释放，就能在很大程度上阻断这一瀑布式的链式反应，减轻全身炎性反应，改善临床预后。但是这样的实验室结果要能够完全应用于临床也还面临着一些问题。
本研究仅验证了岩藻依聚糖在大鼠股骨局部的使用效果，但在临床实践中，仅针对骨髓组织的给药是很难实现的。虽然有研究在动物实验中经静脉全身使用硫苷脂[11-12]，但仅是研究了其作为选择素配体的减轻炎性细胞粘附的作用，并未对其在炎性反应中的全面效应作出评价，而通过推断可知硫苷脂或岩藻依聚糖的全身用药势必会带来一些新的挑战。首先，在ECC过程中，中性粒细胞不仅存在于骨髓之中。如全身用药，外周血激活的中性粒细胞也会和骨髓中性粒细胞一样上调其CXCR4的表达。无选择性地上调CXCR4将促使激活的中性粒细胞利用CXCR4/SDF-1α连接更多地粘附于同样表达SDF-1α的肺、肝脏、脑和心肌等重要组织器官，加重炎性反应中的组织损伤。有研究发现，外周血中性粒细胞表面CXCR4的表达上调可增加其在急性肺损伤时与肺上皮细胞间的粘附，而这样的作用正是通过CXCR4与SDF-1α间的相互作用实现的[13]。其次，近年来的研究[14-15]还发现骨髓干细胞对受损组织有一定的修复能力，而干细胞的募集过程也与骨髓中CXCR4与SDF-1α间的联系有关。如上调骨髓中性粒细胞的同时也上调了这部分干细胞的CXCR4表达，抑制了其向受损组织的迁移作用，将会带来一定的负面效果。由此看出，利用上调骨髓中性粒细胞CXCR4减少ECC相关骨髓中性粒细胞释放的策略的确有巨大的临床应用潜力，但也还需要向靶向和可控的方向努力。
体外循环（extracorporeal circulation，ECC）是心脏外科等领域一项重要的治疗和辅助手段。ECC过程中血液不可避免地与异物表面接触将导致白细胞，特别是中性粒细胞的激活并引起全身炎性反应和器官功能障碍[1-2]。ECC后外周血中性粒细胞数量的快速增加主要缘自骨髓储备的快速释放。释放入血的中性粒细胞又能进一步维持和扩大炎性反应。以往的研究[3-4]提示中性粒细胞表面表达的趋化因子受体4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]和骨髓基质细胞广泛表达的基质细胞获得因子-1α（stromal cell-derived factor，SDF-1α）之间的连接是控制和调节骨髓中性粒细胞释放的重要因素，CXCR4/SDF-1α的连接活性降低或CXCR4的表达减少，均能导致中性粒细胞的快速释放。既然CXCR4/SDF-1α连接的破坏可以导致骨髓中性粒细胞快速释放，那如果通过上调骨髓中性粒细胞CXCR4表达，加强其连接是否就可以阻止体外循环中骨髓中性粒细胞的大量释放呢？目前尚未见相关研究。
L-选择素的天然配体硫苷脂（sulfatide，3-sulfated galactosylceramide）和岩藻依聚糖（fucoidan）可在体外培养中上调淋巴细胞表面CXCR4表达，并增加淋巴细胞与SDF-1α的亲和力[5]，但其在体内环境中的作用尚未得到验证。如果可以实现体内的上调，这种体内的上调作用和体外循环相关的骨髓中性粒细胞快速释放又有怎样的关系呢？基于这些问题，本文拟通过大鼠股骨骨髓原位灌注模型研究体内使用岩藻依聚糖上调骨髓内中性粒细胞CXCR4表达的可能性，并探索其对体外循环相关骨髓中性粒细胞快速释放的调节作用。
1 资料与方法
1.1 材料和分组
1.1.1 实验材料
本研究所使用实验动物选择雄性成年SD大鼠（由四川省动物实验中心提供），体重250～300 g。实验中炎性反应刺激源为ECC后大鼠血浆，岩藻依聚糖（sigma）溶液浓度为250 μg/ml，自行配制。
1.1.2 实验分组
灌注岩藻依聚糖对大鼠骨髓中性粒细胞CXCR4表达的影响实验（实验一）中12只大鼠随机分为2 组，每组6只，每组大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（见实验方法），其中实验组（F组）以岩藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓，对照组（C组）以Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液灌注骨髓。两组灌注后均收集静脉端灌出液。
灌注岩藻依聚糖对大鼠体外循环相关骨髓中性粒细胞释放的影响实验（实验二）中18只大鼠随机分为3组，每组6只，每组大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（见实验方法），其中F’组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予岩藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓；F+AMD3100组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予岩藻依聚糖（sigma）溶液和CXCR4抗体拮抗剂AMD-3100灌注骨髓，对照组C’组刺激骨髓中性粒细胞释放前给予Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液灌注骨髓。各组灌注后收集静脉端灌出液。
1.2 实验方法和标本检测
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
参照Grocott等[6]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右侧颈总动脉及左侧股静脉插管，预充平衡盐溶液6 ml，以大鼠平均心输出量1/5流量[32 ml/（kg·min）]并行ECC 1 h。鱼精蛋白中和肝素后抽取全血分离血浆。本实验使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分离所得血浆均分为3份，作为炎性反应刺激源分别用于后续实验分组后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
参照Burdon等[7] 的方法改良，全身麻醉大鼠解剖显露髂外动静脉，5-0丝线结扎尾腹动脉（caudal abdominal artery）、髂浅旋动脉（superficial iliac circumflex artery）和阴部腹壁动脉干（pudendoepigastric trunk）及其伴行静脉。处死大鼠后立即以24 G留置针导管由近心端向远心端行股动脉置管，并以22 G留置针导管由近心端向远心端行股静脉置管，以微量泵经股动脉插管灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液（北京迈晨科技）或实验干预物质，收集静脉插管灌出液。
1.2.3 实验一灌注策略、标本收集和检测
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后动脉端接入微量注射泵，先以1 ml/min的速度灌注5 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液冲洗血管中残留血液。实验开始后，F组（n=6）采用岩藻依聚糖（sigma）溶液，C组（n=6）采用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，以0.1 ml/min的速度分别灌入6 ml岩藻依聚糖溶液或缓冲液，持续1 h。灌入岩藻依聚糖溶液浓度为250 μg/ml。
灌注完成后解剖分离大鼠股骨，剪开股骨两端骨骺暴露骨髓腔，以5 ml Hanks平衡盐溶液（HyClone）轻柔冲洗股骨一端，自另一侧断端收集冲洗液。冲洗液在200 g、4℃下离心10 min，弃去上清液，沉淀以低张法（以1 ml 0.2% NaCl溶液清洗30 s，立即继以等体积1.6% NaCl溶液清洗30 s，重复一次）去除残留红细胞。剩余白细胞重悬于PBS缓冲液中。获取的F组和C组重悬白细胞样本中分别加入兔抗大鼠CXCR4多克隆抗体（一抗）（abcam）和兔单克隆抗体IgG同型对照抗体（cell signaling），4℃下孵育30 min，清洗两次后避光环境中加入FITC标记山羊抗兔IgG二抗（millipore corporation），4℃下孵育30 min，细胞清洗两次后重悬于PBS缓冲液，流式细胞仪检测中性粒细胞表面CXCR4表达。
1.2.4 实验二灌注策略、标本收集和检测
冲洗血管中残留血液后F’组先以0.1 ml/min的速度灌入浓度为250 μg/ml的岩藻依聚糖溶液6ml，持续1 h；继以0.1 ml/min的速度灌入1 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，共10 min；最后以0.1 ml /min的速度灌入ECC后大鼠血浆1 ml，共10 min。F+AMD3100组以0.1 ml/min灌入6 ml岩藻依聚糖溶液后再以0.1 ml/min的速度灌入1 ml浓度12.5 μg/ml的AMD-3100溶液，共10 min；最后同样灌入ECC后大鼠血浆。C’组先以0.1 ml/min的速度灌入7 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，共70 min，继以0.1 ml/min的速度灌入ECC后大鼠血浆1 ml，共10 min。
以上灌注完成后每组均以1 ml/min的速度灌入Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液共计40 min并收集灌出液。3组灌注总时间均为120 min。收集股静脉灌出液于离心管中并记录体积，灌出液在200 g、4℃下离心10 min，弃去上清液，沉淀以低张法去除残留红细胞。剩余白细胞重悬于500 μl PBS缓冲液中，充分混匀后取该重悬液10 μl加入40 μl 1%冰醋酸中并于显微镜下多次计数白细胞总数，求得灌注液样本中白细胞总数平均值。剩余重悬白细胞经流式细胞仪检测，在前向光散射/侧向光散射（FSC/SSC）散点图中分别划出白细胞和中性粒细胞门，结合前述计数值求得样本骨髓释放或灌入中性粒细胞总数。
1.3 统计学分析
采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 一般结果
实验中6只SD大鼠建立ECC并采集分离血浆，6只大鼠平均体重为（292.2±15.4）g。实验一中F组6只大鼠平均体重为（268.7±9.5）g，对照组（C组）6只大鼠平均体重为（269.3±13.0）g，两组大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）。实验二中F’组、F+AMD3100组和C’组大鼠平均体重分别为（270.7±10.8）g、（267.2±15.7）g和（273.7±9.7）g，三组间大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 灌注岩藻依聚糖对大鼠骨髓中性粒细胞CXCR4表达的影响
经流式细胞仪检测，F组（岩藻依聚糖灌注组）骨髓冲出中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例平均为4.71%±0.21%，中性粒细胞CXCR4平均荧光强度为（161.3±7.8）（图 1A）；C组（缓冲液对照组）冲出中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例平均为1.11%±0.11%，中性粒细胞CXCR4平均荧光强度为（58.4±6.5）（图 1B）。与对照组相比，岩藻依聚糖灌注后大鼠骨髓中性粒细胞中CXCR4（+）细胞比例（图 2）和CXCR4平均荧光强度均较高（图 3），差异有统计学意义（P<0.05）。
图1
F组与C组骨髓CXCR4（+）中性粒细胞比例
注：A为F组，B为C组
图2
F组与C组骨髓CXCR4（+）中性粒细胞比例比较 图 3 F组与C组骨髓中性粒细胞CXCR4平均荧光强度比较
注：*
2.3 灌注岩藻依聚糖对大鼠体外循环相关骨髓中性粒细释放的影响
在40 min的灌注中，F’组（岩藻依聚糖灌注组）共收集到骨髓中性粒细胞（261 393.7±12 470.6）个，远小于对照组的（818 675.2±10 708.8）个，两组差异有统计学意义（P<0.05）；使用岩藻依聚糖的同时加用CXCR4抗体拮抗剂可取消岩藻依聚糖对骨髓中性粒细胞释放的抑制作用，明显增加释放，释放总数不仅远高于F’组，甚至超过对照组达到（872 635.2±10 430.6）个，F+AMD3100组（岩藻依聚糖+AMD3100灌注组）骨髓释放中性粒细胞总数与F’组和C’组（缓冲液对照组）相比差异均有统计学意义（P<0.05）（图 4）。
图3
各组骨髓释放中性粒细胞总数比较
注：*
3 讨论
在ECC相关炎性反应过程中，骨髓释放的中性粒细胞起着重要作用，释放的中性粒细胞不仅直接参与炎性损害，激活后还能通过各种机制再次促进骨髓释放更多的中性粒细胞，形成瀑布式的连锁反应。既然骨髓中性粒细胞CXCR4的表达下降，或其与SDF-1α之间连接的减弱均可导致骨髓中性粒细胞的释放增加。反之，如果上调其表达或增强其与SDF-1α之间的连接关系就能减少骨髓中性粒细胞的释放也是符合逻辑的。事实上，在先天性髓样粒细胞缺乏症（WHIM综合征）中，正是因为CXCR4对SDF-1α的敏感性增加造成了骨髓释放中性粒细胞的减少[8]。这样类似的机理能否应用于减少ECC相关的骨髓中性粒细胞释放正是本研究的目的。
稳态下骨髓储备中成熟的中性粒细胞表达着较低但能够检测出的CXCR4，但中性粒细胞胞内CXCR4表达却很高，这使得在需要的时候中性粒细胞可以通过出胞作用快速上调细胞表面CXCR4的表达[3, 9]。目前已有的关于粒细胞CXCR4表达上调的研究都局限在体外分离细胞的实验中[5, 10]，应用100 μg/ml的硫苷脂和岩藻依聚糖体外培养分离所得人淋巴细胞1 h可将其CXCR4阳性率分别提升至之前的近1.5倍和2倍。这种作用来自于L-选择素介导的酪氨酸激酶相关的胞内信号通路的激活，以及继而发生的胞内CXCR4向细胞外动员的增加和内化作用的减少。本实验发现，这种L-选择素的天然配体在体内环境中也能有效上调中性粒细胞表面CXCR4的表达。经过1 h灌注，骨髓中性粒细胞CXCR4阳性细胞比例和中性粒细胞CXCR4荧光强度均增加至基础值的3倍左右，这和以前报道的体外实验结果基本吻合。这也是第一次通过实验的方法证实了在体内环境中上调骨髓中性粒细胞CXCR4的表达是完全可行和有效的。
解决了骨髓中性粒细胞在原位表达CXCR4上调的问题，就等于打下了减少其释放的基础。针对这一问题本研究也进行了进一步的探索。利用大鼠股骨骨髓原位灌注模型我们发现，面对ECC后血浆的刺激，岩藻依聚糖的处理很好地抑制了骨髓中性粒细胞的大量释放，而这一效果能够被CXCR4的拮抗剂AMD3100所取消。这一实验结果很好地证明了，也是首次发现CXCR4的上调剂能够在体内环境中明显抑制ECC相关的骨髓中性粒细胞快速释放。
这一发现对ECC相关全身炎性反应的预防和治疗有着较大的启发意义，如果能够通过改变骨髓内中性粒细胞趋化因子受体的表达，减少其在ECC中的释放，就能在很大程度上阻断这一瀑布式的链式反应，减轻全身炎性反应，改善临床预后。但是这样的实验室结果要能够完全应用于临床也还面临着一些问题。
本研究仅验证了岩藻依聚糖在大鼠股骨局部的使用效果，但在临床实践中，仅针对骨髓组织的给药是很难实现的。虽然有研究在动物实验中经静脉全身使用硫苷脂[11-12]，但仅是研究了其作为选择素配体的减轻炎性细胞粘附的作用，并未对其在炎性反应中的全面效应作出评价，而通过推断可知硫苷脂或岩藻依聚糖的全身用药势必会带来一些新的挑战。首先，在ECC过程中，中性粒细胞不仅存在于骨髓之中。如全身用药，外周血激活的中性粒细胞也会和骨髓中性粒细胞一样上调其CXCR4的表达。无选择性地上调CXCR4将促使激活的中性粒细胞利用CXCR4/SDF-1α连接更多地粘附于同样表达SDF-1α的肺、肝脏、脑和心肌等重要组织器官，加重炎性反应中的组织损伤。有研究发现，外周血中性粒细胞表面CXCR4的表达上调可增加其在急性肺损伤时与肺上皮细胞间的粘附，而这样的作用正是通过CXCR4与SDF-1α间的相互作用实现的[13]。其次，近年来的研究[14-15]还发现骨髓干细胞对受损组织有一定的修复能力，而干细胞的募集过程也与骨髓中CXCR4与SDF-1α间的联系有关。如上调骨髓中性粒细胞的同时也上调了这部分干细胞的CXCR4表达，抑制了其向受损组织的迁移作用，将会带来一定的负面效果。由此看出，利用上调骨髓中性粒细胞CXCR4减少ECC相关骨髓中性粒细胞释放的策略的确有巨大的临床应用潜力，但也还需要向靶向和可控的方向努力。
