引用本文： 干昌平, 邱旭, 张静漪, 安琪, 石应康. 抗VCAM-1靶向超声微泡对体外循环相关骨髓中性粒细胞释放的可逆性影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(2): 146-150. doi: 10.7507/1007-4848.20150041 复制
体外循环（extracorporeal circulation，ECC）是心脏外科中一项重要的辅助手段。ECC时外周循环中激活的中性粒细胞释放促炎因子，进一步扩大炎症反应，并刺激骨髓中性粒细胞快速释放入外周循环[1]。中性粒细胞是一把“双刃剑”，其在炎症反应中直接介导了组织损伤，却也参与了创伤后的组织修复[2]，同时作为体内免疫防御的组成部分，在术后抗感染的过程中发挥重要作用[3]。这就促使我们去思考是否存在一种针对炎症状态下骨髓中性粒细胞释放的可控办法。已有研究表明，骨髓窦状内皮细胞表面的血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和骨髓中性粒细胞表面的CD49d的相互作用是骨髓中性粒细胞释放的关键因素，使用CD49d的抗体或拮抗剂可减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放[4]。但全身使用CD49d的抗体或拮抗剂不仅用量大，而且缺乏靶向性，可能损害外周循环中的中性粒细胞功能。目前尚无文献报道利用抗VCAM-1抗体干预炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放。虽然在炎症早期，VCAM-1仍主要表达在骨髓窦状内皮细胞表面，使用抗VCAM-1抗体具有一定的靶向性，但其抗原-抗体间的结合不具备可控性，可能引起骨髓中性粒细胞较长时间的释放障碍。
超声微泡技术已在多个临床领域崭露头角。因其具备连接特定抗体形成靶向投放的功能，和其在特定声压环境下可控性破裂的特点，通常被用作靶向药物投放的载体。基于这一原理，本实验拟利用大鼠并行ECC后分离血浆模拟ECC相关炎症反应，通过大鼠股骨骨髓原位灌注模型，探究抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向超声微泡对该炎症条件下骨髓中性粒细胞释放的影响，以及高声压超声辐射下微泡破裂对该影响的可逆性作用。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料
本研究所使用实验动物选择雄性成年SD大鼠（由四川省动物实验中心提供），体重250～300 g。抗VCAM-1靶向超声微泡为使用商品化注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡及生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗体（eBioscience）自行制备。
1.1.2 实验分组
36只SD雄性大鼠随机分为6组，每组6只，各组大鼠体重平均值无明显差异。6组分别为抗体组（A组）：利用EEC后血浆模拟炎症反应，给予0.5 ml（33.3μg）抗VCAM-1抗体；抗体+超声组（AU组）：模拟炎症反应后，注入与A组等量的抗VCAM-1抗体后，再给予高声压超声辐射；靶向微泡组（T组）：模拟炎症反应后，给予0.5 ml抗VCAM-1靶向超声微泡；靶向微泡破裂组（TU组）：模拟炎症反应后，给予与T组等量的抗VCAM-1靶向超声微泡后，再给予与AU组相同的高声压超声辐射击破微泡；体外循环后血浆刺激对照组（MC组）：仅灌注体外循环后血浆，模拟炎症反应；空白对照组（C组）：仅使用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，作空白对照。
1.2 实验方法和标本检测
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
参照Grocott等[5]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右侧颈总动脉及左侧股静脉插管，预充6 ml平衡盐溶液，以大鼠平均心输出量1/5流量[32 ml/(kg.min)]行并行ECC 1 h。鱼精蛋白中和肝素后抽取全血分离血浆。本实验使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分离所得血浆均分为3份，作为炎性反应刺激源分别用于后续实验分组后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
参照Burdon等[4]的方法改良，全身麻醉大鼠解剖显露髂外动、静脉，5-0丝线结扎尾腹动脉（caudal abdominal artery）、髂浅旋动脉（superficial iliac circumflex artery）和阴部腹壁动脉干（pudendoepigastric trunk）及其伴行静脉。处死大鼠后立即以24G留置针导管由近心端向远心端行股动脉置管，并以22G留置针导管由近心端向远心端行股静脉置管，以微量泵经股动脉插管灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液（北京迈晨科技）或实验干预物质，收集静脉插管灌出液。
1.2.3 抗VCAM-1靶向超声微泡制备
注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡以白色冻干粉末和SF6气体的形式封装于安培瓶中。以5 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液注入安培瓶中用力振摇20秒至冻干粉末完全分散溶解。取5 ml新配制的超声微泡混悬液，加入450μg生物素化的DSPE-PEG（2000）（Avanti），37℃恒温轻摇混合反应1 h。在200 g、4℃下离心5 min，弃去下层澄清液体后，漂浮法洗涤2次。加入66.7μg链霉亲和素（Sigma-Aldrich），4℃下避光孵育30 min。以同前条件离心5 min，弃下清液，漂浮法洗涤2次。加入33.3μg生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗体（eBioscience），4℃下避光孵育30 min，同样方法离心、弃液、洗涤后，完成抗VCAM-1靶向超声微泡的制备。
1.2.4 灌注策略及细胞检测
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后动脉插管连接微量输液泵，先以100 ml/h的速度灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液10 min冲洗残存血液。C组设定4个灌注周期，每周期10 min，每周期内用微量输液泵以100 ml/h的速度匀速灌入Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，每周期灌注液总量为16.6 ml。其余各组各5个灌注周期，灌注速度、每周期时间和灌注液体量同C组；第1周期匀速灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液；第2～5周期匀速灌注用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液配制的ECC血浆。
第2周期灌注结束后，A组和AU组经股动脉插管推注0.5 ml抗VCAM-1抗体，T组和TU组推注0.5 ml抗VCAM-1靶向超声微泡。AU组和TU组在第3周期灌注的同时以PHILIPS iu22超声诊断仪的L12-5探头的Flash功能于右下肢股骨及胫腓骨处给予高声压超声辐射10 min。各组均在股静脉插管端完整收集每个周期灌出液，计数中性粒细胞。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 抗VCAM-1抗体减少骨髓中性粒细胞释放的有效性
经过5个灌注周期，A组大鼠骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 393 750.0±252 580.4）个，AU组骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 566 543.2±201 577.2）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个。A组和AU组组间差异无统计学意义（P > 0.05），但与MC组差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 1。表明抗VCAM-1抗体可以减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放，但高声压超声辐射对抗VCAM-1抗体增加或减少骨髓中性粒细胞释放的作用无明显影响。
图1
A组、AU组与MC组中性粒细胞总数比较
2.2 抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向超声微泡减少骨髓中性粒细胞释放的差异
经过5个灌注周期，A组大鼠骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 393 750.0±252 580.4）个，T组骨髓灌出液含中性粒细胞（1 975 000.0±184 729.5）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个，各组间差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 2。表明抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向微泡均能减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放，且抗VCAM-1靶向超声微泡的效果更加显著。
图2
A组、T组与MC组中性粒细胞总数比较
2.3 抗VCAM-1靶向超声微泡减少骨髓中性粒细胞释放的可逆性
经过5个灌注周期，T组大鼠骨髓灌出液含中性粒细胞（1 975 000.0±184 729.5）个，TU组骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 962 500.0±238 353.7）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个，各组间差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 3。可见高声压超声辐射击破抗VCAM-1靶向超声微泡后，炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放显著增加。
图3
T组、TU组与MC组中性粒细胞总数比较
3 讨论
Burdon等[4]发现在炎症刺激下，在给予CD49d抗体或拮抗剂后，骨髓释放的中性粒细胞显著减少，据此推断骨髓窦状内皮表达的VCAM-1和其由中性粒细胞表达的配体CD49d的相互作用是炎症条件下骨髓中性粒细胞释放的关键。炎症早期是骨髓循环池内的中性粒细胞释放入外周循环的最快增速阶段，这提示该时期可能也是炎症条件下骨髓窦状内皮VCAM-1表达上调的高峰期[6]。在这一时期给予抗VCAM-1抗体，观察到骨髓灌出液中中性粒细胞的显著减少。说明抗VCAM-1抗体也可以阻断骨髓窦状内皮细胞表面VCAM-1与中性粒细胞表面CD49d的结合，减少炎症条件下中性粒细胞的释放。而给予高声压超声辐射后，灌出液中中性粒细胞数量与未使用超声辐射的组差异无统计学意义，说明高声压超声辐射对骨髓中性粒细胞的释放无明显影响。抗原-抗体的结合和解离始终处于可逆性转换的动态过程中，可以推测随着抗VCAM-1抗体分解代谢的消耗，其阻断作用才会逐步消除，但这可能会引起骨髓中性粒细胞较长时间的释放障碍。而目前尚未见到有关VCAM-1抗原-抗体间动态结合与游离的时间相关性定量分析的研究。由于VCAM-1的表达在炎症早期具有明显的骨髓靶向性，利用抗VCAM-1抗体为减少ECC相关骨髓中性粒细胞快速释放的研究提供了探索途径。
Kaufmann等[7]和Behm等[8]通过在超声微泡表面加载抗VCAM-1抗体在动脉粥样硬化和缺血动物模型上实现了外周循环炎症部位的靶向超声显影，结果证实抗VCAM-1抗体可以靶向引导微泡浓聚于VCAM-1高表达的组织。受此启发，我们将抗VCAM-1靶向超声微泡引入骨髓。超声微泡借助其表面的抗VCAM-1抗体与骨髓窦状内皮细胞的VCAM-1靶向结合而黏附于骨髓窦状内皮细胞表面，而密集分布于骨髓窦状内皮细胞表面的微泡是否会对骨髓储存池内的中性粒细胞穿窦状内皮细胞释放的过程有阻挡作用呢？目前国内外尚未见到相关研究。本研究发现在模拟的ECC炎症条件下，相比单纯使用抗VCAM-1抗体（A组），利用抗VCAM-1靶向超声微泡（T组）减少骨髓中性粒细胞释放的效果更加显著。分析并推测可能的原因为靶向微泡通过其表面的特异性抗体识别并与骨髓窦状内皮细胞表达的VCAM-1相结合时，引导微泡黏附于骨髓窦状内皮细胞表面形成了密集分布于窦状内皮表面的“微泡层”，进一步阻挡了中性粒细胞的游出。抗VCAM-1靶向超声微泡提供了抗体封闭的生物学屏障和微泡阻挡的物理学屏障的双重作用，更有效地减少了骨髓中性粒细胞的快速释放；而微泡与其表面抗体的特殊关系也为进一步研究骨髓中性粒细胞释放的可控性调节提供了新的思路。
已广泛应用于临床检查的超声微泡造影剂也可以作为一种可控性的药物或基因运载手段。一些研究显示利用高声压超声击破微泡产生的空化效应释放微泡携带的药物或基因，提高局部药物浓度或基因转载率，起到靶向治疗的作用。这些研究多集中在心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤疾病等领域[8-10]。本研究设计利用抗VCAM-1靶向超声微泡阻断炎症刺激下骨髓中性粒细胞的快速释放后，求证施加高声压超声辐射击破微泡可否解除微泡阻挡的物理学屏障作用，恢复骨髓中性粒细胞的释放功能。通过抗VCAM-1靶向超声微泡干预炎症条件下骨髓中性粒细胞释放，并施加高声压超声辐射击破微泡，结果发现击破微泡后骨髓释放的中性粒细胞明显增多，逐渐接近炎症对照组骨髓灌出液中中性粒细胞的浓度。说明靶向黏附于骨髓窦状内皮细胞表面的微泡被高声压超声辐射击破后，解除了微泡在骨髓窦状内皮表面的物理阻挡作用，骨髓储存池内的中性粒细胞恢复穿窦状内皮细胞释放入外周循环的功能。实现了利用可控性的手段可逆性地减少骨髓中性粒细胞释放的目的。
炎症反应的早期是调控中性粒细胞释放的重要“时间窗”，在这一时段给予有效干预将最大限度地减少外周循环中中性粒细胞的数量。本研究证实了在炎症早期给予抗VCAM-1抗体阻断骨髓窦状内皮VCAM-1与中性粒细胞CD49d的结合，同样可以减少骨髓中性粒细胞的快速释放；而利用抗VCAM-1靶向超声微泡不仅可以起到抗体封闭的生物学阻断作用，同时抗VCAM-1抗体引导微泡黏附于骨髓窦状内皮表面，对骨髓中性粒细胞的穿内皮释放具有物理性阻挡作用，起到了双重屏障作用；给予高声压超声击破微泡解除物理学屏障的同时，微泡破裂的空化效应可以使VCAM-1抗原-抗体间的结合分离，解除了抗体阻断的生物学屏障，骨髓中性粒细胞的释放得以恢复，最终实现了可逆性阻断炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放。可以看出利用抗VCAM-1靶向超声微泡可逆性阻断体外循环相关骨髓中性粒细胞释放的策略确有一定的临床应用潜力。
体外循环（extracorporeal circulation，ECC）是心脏外科中一项重要的辅助手段。ECC时外周循环中激活的中性粒细胞释放促炎因子，进一步扩大炎症反应，并刺激骨髓中性粒细胞快速释放入外周循环[1]。中性粒细胞是一把“双刃剑”，其在炎症反应中直接介导了组织损伤，却也参与了创伤后的组织修复[2]，同时作为体内免疫防御的组成部分，在术后抗感染的过程中发挥重要作用[3]。这就促使我们去思考是否存在一种针对炎症状态下骨髓中性粒细胞释放的可控办法。已有研究表明，骨髓窦状内皮细胞表面的血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和骨髓中性粒细胞表面的CD49d的相互作用是骨髓中性粒细胞释放的关键因素，使用CD49d的抗体或拮抗剂可减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放[4]。但全身使用CD49d的抗体或拮抗剂不仅用量大，而且缺乏靶向性，可能损害外周循环中的中性粒细胞功能。目前尚无文献报道利用抗VCAM-1抗体干预炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放。虽然在炎症早期，VCAM-1仍主要表达在骨髓窦状内皮细胞表面，使用抗VCAM-1抗体具有一定的靶向性，但其抗原-抗体间的结合不具备可控性，可能引起骨髓中性粒细胞较长时间的释放障碍。
超声微泡技术已在多个临床领域崭露头角。因其具备连接特定抗体形成靶向投放的功能，和其在特定声压环境下可控性破裂的特点，通常被用作靶向药物投放的载体。基于这一原理，本实验拟利用大鼠并行ECC后分离血浆模拟ECC相关炎症反应，通过大鼠股骨骨髓原位灌注模型，探究抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向超声微泡对该炎症条件下骨髓中性粒细胞释放的影响，以及高声压超声辐射下微泡破裂对该影响的可逆性作用。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料
本研究所使用实验动物选择雄性成年SD大鼠（由四川省动物实验中心提供），体重250～300 g。抗VCAM-1靶向超声微泡为使用商品化注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡及生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗体（eBioscience）自行制备。
1.1.2 实验分组
36只SD雄性大鼠随机分为6组，每组6只，各组大鼠体重平均值无明显差异。6组分别为抗体组（A组）：利用EEC后血浆模拟炎症反应，给予0.5 ml（33.3μg）抗VCAM-1抗体；抗体+超声组（AU组）：模拟炎症反应后，注入与A组等量的抗VCAM-1抗体后，再给予高声压超声辐射；靶向微泡组（T组）：模拟炎症反应后，给予0.5 ml抗VCAM-1靶向超声微泡；靶向微泡破裂组（TU组）：模拟炎症反应后，给予与T组等量的抗VCAM-1靶向超声微泡后，再给予与AU组相同的高声压超声辐射击破微泡；体外循环后血浆刺激对照组（MC组）：仅灌注体外循环后血浆，模拟炎症反应；空白对照组（C组）：仅使用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，作空白对照。
1.2 实验方法和标本检测
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
参照Grocott等[5]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右侧颈总动脉及左侧股静脉插管，预充6 ml平衡盐溶液，以大鼠平均心输出量1/5流量[32 ml/(kg.min)]行并行ECC 1 h。鱼精蛋白中和肝素后抽取全血分离血浆。本实验使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分离所得血浆均分为3份，作为炎性反应刺激源分别用于后续实验分组后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
参照Burdon等[4]的方法改良，全身麻醉大鼠解剖显露髂外动、静脉，5-0丝线结扎尾腹动脉（caudal abdominal artery）、髂浅旋动脉（superficial iliac circumflex artery）和阴部腹壁动脉干（pudendoepigastric trunk）及其伴行静脉。处死大鼠后立即以24G留置针导管由近心端向远心端行股动脉置管，并以22G留置针导管由近心端向远心端行股静脉置管，以微量泵经股动脉插管灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液（北京迈晨科技）或实验干预物质，收集静脉插管灌出液。
1.2.3 抗VCAM-1靶向超声微泡制备
注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡以白色冻干粉末和SF6气体的形式封装于安培瓶中。以5 ml Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液注入安培瓶中用力振摇20秒至冻干粉末完全分散溶解。取5 ml新配制的超声微泡混悬液，加入450μg生物素化的DSPE-PEG（2000）（Avanti），37℃恒温轻摇混合反应1 h。在200 g、4℃下离心5 min，弃去下层澄清液体后，漂浮法洗涤2次。加入66.7μg链霉亲和素（Sigma-Aldrich），4℃下避光孵育30 min。以同前条件离心5 min，弃下清液，漂浮法洗涤2次。加入33.3μg生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗体（eBioscience），4℃下避光孵育30 min，同样方法离心、弃液、洗涤后，完成抗VCAM-1靶向超声微泡的制备。
1.2.4 灌注策略及细胞检测
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后动脉插管连接微量输液泵，先以100 ml/h的速度灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液10 min冲洗残存血液。C组设定4个灌注周期，每周期10 min，每周期内用微量输液泵以100 ml/h的速度匀速灌入Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液，每周期灌注液总量为16.6 ml。其余各组各5个灌注周期，灌注速度、每周期时间和灌注液体量同C组；第1周期匀速灌注Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液；第2～5周期匀速灌注用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液配制的ECC血浆。
第2周期灌注结束后，A组和AU组经股动脉插管推注0.5 ml抗VCAM-1抗体，T组和TU组推注0.5 ml抗VCAM-1靶向超声微泡。AU组和TU组在第3周期灌注的同时以PHILIPS iu22超声诊断仪的L12-5探头的Flash功能于右下肢股骨及胫腓骨处给予高声压超声辐射10 min。各组均在股静脉插管端完整收集每个周期灌出液，计数中性粒细胞。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 抗VCAM-1抗体减少骨髓中性粒细胞释放的有效性
经过5个灌注周期，A组大鼠骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 393 750.0±252 580.4）个，AU组骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 566 543.2±201 577.2）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个。A组和AU组组间差异无统计学意义（P > 0.05），但与MC组差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 1。表明抗VCAM-1抗体可以减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放，但高声压超声辐射对抗VCAM-1抗体增加或减少骨髓中性粒细胞释放的作用无明显影响。
图1
A组、AU组与MC组中性粒细胞总数比较
2.2 抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向超声微泡减少骨髓中性粒细胞释放的差异
经过5个灌注周期，A组大鼠骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 393 750.0±252 580.4）个，T组骨髓灌出液含中性粒细胞（1 975 000.0±184 729.5）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个，各组间差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 2。表明抗VCAM-1抗体和抗VCAM-1靶向微泡均能减少炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放，且抗VCAM-1靶向超声微泡的效果更加显著。
图2
A组、T组与MC组中性粒细胞总数比较
2.3 抗VCAM-1靶向超声微泡减少骨髓中性粒细胞释放的可逆性
经过5个灌注周期，T组大鼠骨髓灌出液含中性粒细胞（1 975 000.0±184 729.5）个，TU组骨髓灌出液约含中性粒细胞（2 962 500.0±238 353.7）个，MC组灌出液约含中性粒细胞（4 100 000.0±126 984.3）个，各组间差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 3。可见高声压超声辐射击破抗VCAM-1靶向超声微泡后，炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放显著增加。
图3
T组、TU组与MC组中性粒细胞总数比较
3 讨论
Burdon等[4]发现在炎症刺激下，在给予CD49d抗体或拮抗剂后，骨髓释放的中性粒细胞显著减少，据此推断骨髓窦状内皮表达的VCAM-1和其由中性粒细胞表达的配体CD49d的相互作用是炎症条件下骨髓中性粒细胞释放的关键。炎症早期是骨髓循环池内的中性粒细胞释放入外周循环的最快增速阶段，这提示该时期可能也是炎症条件下骨髓窦状内皮VCAM-1表达上调的高峰期[6]。在这一时期给予抗VCAM-1抗体，观察到骨髓灌出液中中性粒细胞的显著减少。说明抗VCAM-1抗体也可以阻断骨髓窦状内皮细胞表面VCAM-1与中性粒细胞表面CD49d的结合，减少炎症条件下中性粒细胞的释放。而给予高声压超声辐射后，灌出液中中性粒细胞数量与未使用超声辐射的组差异无统计学意义，说明高声压超声辐射对骨髓中性粒细胞的释放无明显影响。抗原-抗体的结合和解离始终处于可逆性转换的动态过程中，可以推测随着抗VCAM-1抗体分解代谢的消耗，其阻断作用才会逐步消除，但这可能会引起骨髓中性粒细胞较长时间的释放障碍。而目前尚未见到有关VCAM-1抗原-抗体间动态结合与游离的时间相关性定量分析的研究。由于VCAM-1的表达在炎症早期具有明显的骨髓靶向性，利用抗VCAM-1抗体为减少ECC相关骨髓中性粒细胞快速释放的研究提供了探索途径。
Kaufmann等[7]和Behm等[8]通过在超声微泡表面加载抗VCAM-1抗体在动脉粥样硬化和缺血动物模型上实现了外周循环炎症部位的靶向超声显影，结果证实抗VCAM-1抗体可以靶向引导微泡浓聚于VCAM-1高表达的组织。受此启发，我们将抗VCAM-1靶向超声微泡引入骨髓。超声微泡借助其表面的抗VCAM-1抗体与骨髓窦状内皮细胞的VCAM-1靶向结合而黏附于骨髓窦状内皮细胞表面，而密集分布于骨髓窦状内皮细胞表面的微泡是否会对骨髓储存池内的中性粒细胞穿窦状内皮细胞释放的过程有阻挡作用呢？目前国内外尚未见到相关研究。本研究发现在模拟的ECC炎症条件下，相比单纯使用抗VCAM-1抗体（A组），利用抗VCAM-1靶向超声微泡（T组）减少骨髓中性粒细胞释放的效果更加显著。分析并推测可能的原因为靶向微泡通过其表面的特异性抗体识别并与骨髓窦状内皮细胞表达的VCAM-1相结合时，引导微泡黏附于骨髓窦状内皮细胞表面形成了密集分布于窦状内皮表面的“微泡层”，进一步阻挡了中性粒细胞的游出。抗VCAM-1靶向超声微泡提供了抗体封闭的生物学屏障和微泡阻挡的物理学屏障的双重作用，更有效地减少了骨髓中性粒细胞的快速释放；而微泡与其表面抗体的特殊关系也为进一步研究骨髓中性粒细胞释放的可控性调节提供了新的思路。
已广泛应用于临床检查的超声微泡造影剂也可以作为一种可控性的药物或基因运载手段。一些研究显示利用高声压超声击破微泡产生的空化效应释放微泡携带的药物或基因，提高局部药物浓度或基因转载率，起到靶向治疗的作用。这些研究多集中在心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤疾病等领域[8-10]。本研究设计利用抗VCAM-1靶向超声微泡阻断炎症刺激下骨髓中性粒细胞的快速释放后，求证施加高声压超声辐射击破微泡可否解除微泡阻挡的物理学屏障作用，恢复骨髓中性粒细胞的释放功能。通过抗VCAM-1靶向超声微泡干预炎症条件下骨髓中性粒细胞释放，并施加高声压超声辐射击破微泡，结果发现击破微泡后骨髓释放的中性粒细胞明显增多，逐渐接近炎症对照组骨髓灌出液中中性粒细胞的浓度。说明靶向黏附于骨髓窦状内皮细胞表面的微泡被高声压超声辐射击破后，解除了微泡在骨髓窦状内皮表面的物理阻挡作用，骨髓储存池内的中性粒细胞恢复穿窦状内皮细胞释放入外周循环的功能。实现了利用可控性的手段可逆性地减少骨髓中性粒细胞释放的目的。
炎症反应的早期是调控中性粒细胞释放的重要“时间窗”，在这一时段给予有效干预将最大限度地减少外周循环中中性粒细胞的数量。本研究证实了在炎症早期给予抗VCAM-1抗体阻断骨髓窦状内皮VCAM-1与中性粒细胞CD49d的结合，同样可以减少骨髓中性粒细胞的快速释放；而利用抗VCAM-1靶向超声微泡不仅可以起到抗体封闭的生物学阻断作用，同时抗VCAM-1抗体引导微泡黏附于骨髓窦状内皮表面，对骨髓中性粒细胞的穿内皮释放具有物理性阻挡作用，起到了双重屏障作用；给予高声压超声击破微泡解除物理学屏障的同时，微泡破裂的空化效应可以使VCAM-1抗原-抗体间的结合分离，解除了抗体阻断的生物学屏障，骨髓中性粒细胞的释放得以恢复，最终实现了可逆性阻断炎症条件下骨髓中性粒细胞的释放。可以看出利用抗VCAM-1靶向超声微泡可逆性阻断体外循环相关骨髓中性粒细胞释放的策略确有一定的临床应用潜力。
