组织工程气管移植成功已有报道，脱细胞气管支架的制备技术基本成熟，气管移植过程中上皮、软骨及血管再生问题就显得尤为重要。随着各种获取和培养细胞的方法及促细胞生长分化的因子研究日趋成熟，使用组织工程技术实现气管的上皮、软骨及血管再生成为可能，解决气管的上皮、软骨及血管再生具有重要的临床价值。本文就组织工程气管移植过程中上皮、软骨及血管再生情况及未来前景进行综述。
引用本文： 张思泉, 仲崇浩, 史宏灿. 组织工程气管再生的研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(3): 257-260. doi: 10.7507/1007-4848.20150069 复制
2008年6月，世界上第一例组织工程气管被成功移植到一例30岁的女性患者身上，术后随访5年，患者在未使用免疫抑制剂的情况下生活良好[1-2]。随后又有一例12岁儿童气管移植的报道，患儿术后2年气道功能恢复并已回到学校上学[3]。以上两例成功移植的案例为组织工程气管移植展现了良好的前景。组织工程气管涉及细胞获取和培养、支架制备、生物反应器及药物支持等问题。体外生物反应器存在操作复杂、耗时较长、成本较高等缺点[4]。原位气管移植大大降低了制备组织工程气管的成本及周期。在现存多种气管支架的制备方法中，去污剂联合酶法制备的脱细胞支架因其在组织相容性及保留细胞基质方面具有独特的优越性，成为了最具前景的支架制备方法[5]。而上皮再生问题、软骨再生问题及血管再生问题有待进一步研究与解决。本文主要就怎样更好地促进血管再生，软骨细胞、上皮细胞的最佳来源以及细胞获取和培养方式进行综述。
1 软骨细胞再生
软骨包括弹性软骨、透明软骨和纤维软骨，不同来源的软骨细胞具有不同的结构和生化性质。弹性软骨存在于耳、会厌，透明软骨存在于关节、鼻中隔、气管、肋软骨和喉软骨，纤维软骨存在于椎间盘、肌腱和韧带中[6]。研究证明，软骨细胞在维持组织工程气管的机械性能、预防组织工程气管支架塌陷方面具有重要作用[7-8]。
1.1 软骨细胞的来源
软骨细胞来源的主要问题是如何采取最简单、安全、微创的方法获得细胞，并且获得的细胞能够很好地在体外进行培养。耳、鼻中隔、气管和肋软骨是软骨细胞的主要来源。耳软骨细胞与原生气管软骨生物学性能相近，且获取简单、安全、微创，然而因其不能提供理想的力学特性，存在可能导致气管内毛发生长和油脂产生等长期潜在并发症[9]，所以耳软骨并非首选。肋软骨细胞具有和气管软骨细胞类似的生物活性和代谢活动[10]。然而，实际操作过程中，获取这些软骨细胞存在需要侵袭性活检和局部或全身麻醉的缺点。研究发现骨髓间充质干细胞（MSC）可以分化成软骨细胞[7]，这一发现解决了上述问题，MSC成为具有前景的软骨细胞来源。
1.2 软骨细胞的培养
众所周知，体外培养软骨细胞在经过几个传代培养后，细胞表型会发生改变。目前还没有培养高质量软骨细胞的统一标准。因此，培养高质量的软骨细胞仍然是一大挑战。软骨形成是由几个相关因子共同促进的，例如转化生长因子β（TGF-β）、纤维母细胞生长因子（FGF）和胰岛素样生长因子（IGF）。TGF-β已被证明是最有效的促进软骨细胞分化的生长因子[11]，其对软骨细胞的分化形成起着重要作用，但是它的不同亚型所起的作用并不完全相同[12]。FGF和IGF家族可以通过调节细胞凋亡、增殖、分化等多种机制来影响软骨细胞的分化。研究证明可以联合多种生长因子共同作用，促进软骨细胞的分化成熟。
1.3 软骨细胞的再生
各种来源的软骨细胞经体外培养种植于气管支架的外表面可以使软骨细胞再生，直接在气管支架外表面种植MSC也可以分化成软骨细胞[7]。使用MSC的优点：可以在局部麻醉下获取细胞，避免了全身麻醉的风险；可以在体外扩增到相当大的数量，同时保持分化能力[11-13]。由于这些原因，自体MSC已经成为新的解决软骨再生的替代来源。研究[3]发现可以使用TGF-β来提高自身MSC的募集，这为MSC的应用提供了更为广阔的前景。
2 上皮细胞再生
气管与吸入的空气直接接触，污染和感染风险相当高，在避免这些不良反应的过程中，上皮细胞发挥着关键作用[4]。研究表明[14-15]，一个内表面缺乏上皮细胞的气管很容易遭受创伤，随后气管会变得狭窄。事实上，气管上皮细胞具有许多功能，包括控制肺部液体平衡、吸附和活化炎症细胞、代谢和清除吸入颗粒、调节气管平滑肌功能。
2.1 上皮细胞的来源
上皮细胞可以从鼻或气管黏膜上获取[16]。鼻腔上皮细胞增殖快，比支气管上皮细胞更易凋亡[17]。因此，支气管上皮细胞可能更适宜气管移植。最近有研究者[8, 18]利用MSC培养分化成上皮细胞，这为上皮细胞的来源又提供了新的可能。在提前给患者使用了粒细胞集落刺激因子后采集患者的外周血，然后从外周血中提取单核细胞，直接将单核细胞种植在组织工程气管的内表面，成功分化成了上皮细胞。
2.2 上皮细胞的培养
从鼻、气管或支气管黏膜上获取上皮细胞后，采用Rees等[19]的方法，使用特定的无血清培养基，加入牛垂体提取物和上皮生长因子，获得上皮细胞，并已成功运用到脱细胞气管支架移植的再上皮化过程中[20-21]。然而，长时间的体外培养会损害细胞的免疫原性以及细胞的质量。长期体外培养会使细胞迅速丧失原本的防御功能。研究[22]表明，在培养上皮细胞的过程中会使上皮细胞上的通道数量增加。传代4次以上会使上皮细胞失去分泌粘蛋白的能力。通道数量增加会使纤毛细胞数量迅速下降。
2.3 上皮细胞的再生
组织工程气管上皮的再生十分困难，如果没有上皮再生，气管就会发生阻塞从而导致移植失败。由于气管解剖结构和功能的特殊性，研究人员开始认识到气管再上皮化在组织工程中的重要作用[23]。Weidenbecher等[24]使用肌肉皮瓣重建组织工程气管的血供，可以使呼吸道黏膜快速从自身健康气管迁移到脱细胞支架上。细胞角蛋白5和8染色阳性表明气管移植再上皮化成功[4]。使用受体的颊黏膜做为上皮细胞来源，种植在脱细胞支架的内表面后发现气管内表面有鳞状上皮存在[25]。虽然证明了气管内表面有上皮细胞存在，但目前还不清楚这些上皮细胞是来自种植的细胞还是从邻近健康的呼吸道迁移过来的细胞[26]。但种植了上皮细胞的组织工程气管为长段气管狭窄的治疗带来了希望[24]。
3 血管再生
组织工程气管失败的常见原因是植入物的坏死或感染，这是因为缺乏有效的血管再生以致于受损细胞未能得到及时有效的修复，即使很少的坏死组织最终也会导致移植的失败[27]。因此组织工程气管移植过程中一个很重要的问题就是血管再生，能否快速生成血管是移植成功的关键[7]。
3.1 血管再生的方法
组织工程气管移植的潜在问题之一是移植物的血液供应问题。因为直径 > 1 mm的组织仅靠周围组织液扩散来维持营养和氧气供应是不够的，如果没有血管再生，移植物可能发生坏死。血管再生包括直接血管再生和间接血管再生。间接血管再生是将移植物放在患者前臂筋膜中4个月，促进血管再生，然后再原位移植[25]。直接血管再生包括使用网膜包裹以及带有皮瓣的移植等[28]，另外在组织工程气管种植内皮细胞和其他细胞之前整合一定的促进血管生成的生长因子。
3.2 血管再生因子
在组织工程中用血管生长因子来诱导新生血管的方法很受欢迎，然而重组的血管内皮生长因子（VEGF）或基本成纤维细胞生长因子（b-FGF）的分子结构不稳定以及远期效果不确定，使其在组织工程领域的使用受到一定限制[26]。研究发现脱细胞支架可以促进血管再生，免疫组织化学显示脱细胞支架上仍然存在重要的血管再生因子b-FGF和TGF-β[29]，脱细胞组织工程气管移植4 d后，在气管壁上检测到了微血管的生长，移植1个月后气管壁黏膜活检发现有出血，证实有完整的血管再生[17]。因此，我们认为脱细胞并没有去除所有促血管再生因子[7]。脱细胞支架上的血管再生因子可以促进血管的再生，从而表明了保留气管基质的重要性[30]。然而，为了保证组织工程气管血管再生的成功，通常还需额外添加生长因子，如b-FGF和TGF-β。
3.3 血管再生的监测
组织工程气管移植后，活检气管内壁黏膜，如果发生出血，则证明血管再生成功[7, 17]。然而在体外实验的过程中，这一方法并不适用。这时，可以采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）测定的方法来评价组织工程气管血管再生的能力[27]，方法为：白来航鸡受精鸡蛋在37℃、恒定湿度下孵化至第3 d，正方形开窗打开壳分离尿囊膜，用注射器抽取2～3 ml白蛋白以形成假性气室，然后用玻璃密封，继续孵化；孵化至第8 d，在假气室内种植气管，然后继续孵化；每天观察血管生长情况直到第12 d，评估血管向气管纵向再生情况，用以表示组织工程气管的血管再生能力。
4 小结
脱细胞支架保留了促进血管再生的生长因子，在组织工程气管移植过程中，添加促血管再生因子b-FGF和TGF-β有利于血管再生。骨髓间充质干细胞在软骨再生方面比其他来源的细胞表现更佳，获取简单，创伤较小，体外培养相对简单。在移植前、移植后以及软骨细胞培养过程中使用TGF-β对软骨细胞再生起着重要的促进作用，另外添加一些生长因子也对软骨的再生有促进作用，但具体如何添加还没有统一的认识。骨髓间充质干细胞也可以分化成上皮细胞，这为上皮细胞的来源又提供了一种新的可能，但上皮细胞在体外培养过程中很容易改变原来的细胞学特性，为避免这种情况的发生，有研究者利用外周血单核细胞直接种植在气管内表面，获得了成功。另外使用促红细胞生成素（EPO）等生长因子可以通过抑制细胞凋亡来促进伤口愈合及血管再生，有研究表明巨噬细胞在气管移植后伤口愈合过程中也起着重要的作用。在组织工程气管方面我们的认识还很局限，气管再生的机制、细胞迁移的途径等问题尚不清楚，还需进一步研究。
2008年6月，世界上第一例组织工程气管被成功移植到一例30岁的女性患者身上，术后随访5年，患者在未使用免疫抑制剂的情况下生活良好[1-2]。随后又有一例12岁儿童气管移植的报道，患儿术后2年气道功能恢复并已回到学校上学[3]。以上两例成功移植的案例为组织工程气管移植展现了良好的前景。组织工程气管涉及细胞获取和培养、支架制备、生物反应器及药物支持等问题。体外生物反应器存在操作复杂、耗时较长、成本较高等缺点[4]。原位气管移植大大降低了制备组织工程气管的成本及周期。在现存多种气管支架的制备方法中，去污剂联合酶法制备的脱细胞支架因其在组织相容性及保留细胞基质方面具有独特的优越性，成为了最具前景的支架制备方法[5]。而上皮再生问题、软骨再生问题及血管再生问题有待进一步研究与解决。本文主要就怎样更好地促进血管再生，软骨细胞、上皮细胞的最佳来源以及细胞获取和培养方式进行综述。
1 软骨细胞再生
软骨包括弹性软骨、透明软骨和纤维软骨，不同来源的软骨细胞具有不同的结构和生化性质。弹性软骨存在于耳、会厌，透明软骨存在于关节、鼻中隔、气管、肋软骨和喉软骨，纤维软骨存在于椎间盘、肌腱和韧带中[6]。研究证明，软骨细胞在维持组织工程气管的机械性能、预防组织工程气管支架塌陷方面具有重要作用[7-8]。
1.1 软骨细胞的来源
软骨细胞来源的主要问题是如何采取最简单、安全、微创的方法获得细胞，并且获得的细胞能够很好地在体外进行培养。耳、鼻中隔、气管和肋软骨是软骨细胞的主要来源。耳软骨细胞与原生气管软骨生物学性能相近，且获取简单、安全、微创，然而因其不能提供理想的力学特性，存在可能导致气管内毛发生长和油脂产生等长期潜在并发症[9]，所以耳软骨并非首选。肋软骨细胞具有和气管软骨细胞类似的生物活性和代谢活动[10]。然而，实际操作过程中，获取这些软骨细胞存在需要侵袭性活检和局部或全身麻醉的缺点。研究发现骨髓间充质干细胞（MSC）可以分化成软骨细胞[7]，这一发现解决了上述问题，MSC成为具有前景的软骨细胞来源。
1.2 软骨细胞的培养
众所周知，体外培养软骨细胞在经过几个传代培养后，细胞表型会发生改变。目前还没有培养高质量软骨细胞的统一标准。因此，培养高质量的软骨细胞仍然是一大挑战。软骨形成是由几个相关因子共同促进的，例如转化生长因子β（TGF-β）、纤维母细胞生长因子（FGF）和胰岛素样生长因子（IGF）。TGF-β已被证明是最有效的促进软骨细胞分化的生长因子[11]，其对软骨细胞的分化形成起着重要作用，但是它的不同亚型所起的作用并不完全相同[12]。FGF和IGF家族可以通过调节细胞凋亡、增殖、分化等多种机制来影响软骨细胞的分化。研究证明可以联合多种生长因子共同作用，促进软骨细胞的分化成熟。
1.3 软骨细胞的再生
各种来源的软骨细胞经体外培养种植于气管支架的外表面可以使软骨细胞再生，直接在气管支架外表面种植MSC也可以分化成软骨细胞[7]。使用MSC的优点：可以在局部麻醉下获取细胞，避免了全身麻醉的风险；可以在体外扩增到相当大的数量，同时保持分化能力[11-13]。由于这些原因，自体MSC已经成为新的解决软骨再生的替代来源。研究[3]发现可以使用TGF-β来提高自身MSC的募集，这为MSC的应用提供了更为广阔的前景。
2 上皮细胞再生
气管与吸入的空气直接接触，污染和感染风险相当高，在避免这些不良反应的过程中，上皮细胞发挥着关键作用[4]。研究表明[14-15]，一个内表面缺乏上皮细胞的气管很容易遭受创伤，随后气管会变得狭窄。事实上，气管上皮细胞具有许多功能，包括控制肺部液体平衡、吸附和活化炎症细胞、代谢和清除吸入颗粒、调节气管平滑肌功能。
2.1 上皮细胞的来源
上皮细胞可以从鼻或气管黏膜上获取[16]。鼻腔上皮细胞增殖快，比支气管上皮细胞更易凋亡[17]。因此，支气管上皮细胞可能更适宜气管移植。最近有研究者[8, 18]利用MSC培养分化成上皮细胞，这为上皮细胞的来源又提供了新的可能。在提前给患者使用了粒细胞集落刺激因子后采集患者的外周血，然后从外周血中提取单核细胞，直接将单核细胞种植在组织工程气管的内表面，成功分化成了上皮细胞。
2.2 上皮细胞的培养
从鼻、气管或支气管黏膜上获取上皮细胞后，采用Rees等[19]的方法，使用特定的无血清培养基，加入牛垂体提取物和上皮生长因子，获得上皮细胞，并已成功运用到脱细胞气管支架移植的再上皮化过程中[20-21]。然而，长时间的体外培养会损害细胞的免疫原性以及细胞的质量。长期体外培养会使细胞迅速丧失原本的防御功能。研究[22]表明，在培养上皮细胞的过程中会使上皮细胞上的通道数量增加。传代4次以上会使上皮细胞失去分泌粘蛋白的能力。通道数量增加会使纤毛细胞数量迅速下降。
2.3 上皮细胞的再生
组织工程气管上皮的再生十分困难，如果没有上皮再生，气管就会发生阻塞从而导致移植失败。由于气管解剖结构和功能的特殊性，研究人员开始认识到气管再上皮化在组织工程中的重要作用[23]。Weidenbecher等[24]使用肌肉皮瓣重建组织工程气管的血供，可以使呼吸道黏膜快速从自身健康气管迁移到脱细胞支架上。细胞角蛋白5和8染色阳性表明气管移植再上皮化成功[4]。使用受体的颊黏膜做为上皮细胞来源，种植在脱细胞支架的内表面后发现气管内表面有鳞状上皮存在[25]。虽然证明了气管内表面有上皮细胞存在，但目前还不清楚这些上皮细胞是来自种植的细胞还是从邻近健康的呼吸道迁移过来的细胞[26]。但种植了上皮细胞的组织工程气管为长段气管狭窄的治疗带来了希望[24]。
3 血管再生
组织工程气管失败的常见原因是植入物的坏死或感染，这是因为缺乏有效的血管再生以致于受损细胞未能得到及时有效的修复，即使很少的坏死组织最终也会导致移植的失败[27]。因此组织工程气管移植过程中一个很重要的问题就是血管再生，能否快速生成血管是移植成功的关键[7]。
3.1 血管再生的方法
组织工程气管移植的潜在问题之一是移植物的血液供应问题。因为直径 > 1 mm的组织仅靠周围组织液扩散来维持营养和氧气供应是不够的，如果没有血管再生，移植物可能发生坏死。血管再生包括直接血管再生和间接血管再生。间接血管再生是将移植物放在患者前臂筋膜中4个月，促进血管再生，然后再原位移植[25]。直接血管再生包括使用网膜包裹以及带有皮瓣的移植等[28]，另外在组织工程气管种植内皮细胞和其他细胞之前整合一定的促进血管生成的生长因子。
3.2 血管再生因子
在组织工程中用血管生长因子来诱导新生血管的方法很受欢迎，然而重组的血管内皮生长因子（VEGF）或基本成纤维细胞生长因子（b-FGF）的分子结构不稳定以及远期效果不确定，使其在组织工程领域的使用受到一定限制[26]。研究发现脱细胞支架可以促进血管再生，免疫组织化学显示脱细胞支架上仍然存在重要的血管再生因子b-FGF和TGF-β[29]，脱细胞组织工程气管移植4 d后，在气管壁上检测到了微血管的生长，移植1个月后气管壁黏膜活检发现有出血，证实有完整的血管再生[17]。因此，我们认为脱细胞并没有去除所有促血管再生因子[7]。脱细胞支架上的血管再生因子可以促进血管的再生，从而表明了保留气管基质的重要性[30]。然而，为了保证组织工程气管血管再生的成功，通常还需额外添加生长因子，如b-FGF和TGF-β。
3.3 血管再生的监测
组织工程气管移植后，活检气管内壁黏膜，如果发生出血，则证明血管再生成功[7, 17]。然而在体外实验的过程中，这一方法并不适用。这时，可以采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）测定的方法来评价组织工程气管血管再生的能力[27]，方法为：白来航鸡受精鸡蛋在37℃、恒定湿度下孵化至第3 d，正方形开窗打开壳分离尿囊膜，用注射器抽取2～3 ml白蛋白以形成假性气室，然后用玻璃密封，继续孵化；孵化至第8 d，在假气室内种植气管，然后继续孵化；每天观察血管生长情况直到第12 d，评估血管向气管纵向再生情况，用以表示组织工程气管的血管再生能力。
4 小结
脱细胞支架保留了促进血管再生的生长因子，在组织工程气管移植过程中，添加促血管再生因子b-FGF和TGF-β有利于血管再生。骨髓间充质干细胞在软骨再生方面比其他来源的细胞表现更佳，获取简单，创伤较小，体外培养相对简单。在移植前、移植后以及软骨细胞培养过程中使用TGF-β对软骨细胞再生起着重要的促进作用，另外添加一些生长因子也对软骨的再生有促进作用，但具体如何添加还没有统一的认识。骨髓间充质干细胞也可以分化成上皮细胞，这为上皮细胞的来源又提供了一种新的可能，但上皮细胞在体外培养过程中很容易改变原来的细胞学特性，为避免这种情况的发生，有研究者利用外周血单核细胞直接种植在气管内表面，获得了成功。另外使用促红细胞生成素（EPO）等生长因子可以通过抑制细胞凋亡来促进伤口愈合及血管再生，有研究表明巨噬细胞在气管移植后伤口愈合过程中也起着重要的作用。在组织工程气管方面我们的认识还很局限，气管再生的机制、细胞迁移的途径等问题尚不清楚，还需进一步研究。