引用本文： 崔彬, 刘重阳. 两种去细胞人心脏瓣膜的免疫原性分析. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(5): 471-475. doi: 10.7507/1007-4848.20150123 复制
同种心脏瓣膜（homograft valve，HV）及其带瓣管道是目前理想的人工心脏瓣膜，已广泛应用于瓣膜置换术及矫治婴幼儿复杂先天性心脏病术中，但远期随访发现瓣膜仍有钙化和毁损，需要再次置换[1-2]。研究表明HV移植于体内可激发免疫反应，供体特异性的白细胞抗原（HLA-Ⅰ抗原、HLA-Ⅱ抗原）抗体、特异性的高亲和性细胞毒性T淋巴细胞前体（CTLp）、外周血中辅助性T淋巴细胞（HTLP）的表达均显著增高，在婴幼儿患者更为显著[3-5]。我们采用深低温液氮保存人HV，应用组织工程学方法去除HV瓣膜及管壁组织中的内皮细胞成分或全部细胞成分，比较两种去细胞HV免疫原性的变化。
1 材料与方法
1.1 材料制备
1.1.1 去内皮细胞HV的制备
取深低温液氮保存健康成年男性脑死亡6 h内志愿捐献者的人同种主动脉带瓣管道。将同种主动脉带瓣管道置于pH 8.0的Tris低渗缓冲液中[（含10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）]，4℃静置1 h；在1%Triton的pH 8.0的Tris等渗缓冲液[（10 U/ml抑肽酶和0.1%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）]中，37℃持续振荡2 h；在pH 7.6的Tris等渗缓冲液中[核糖核酸酶（RNase）1μg/ml、去氧核糖核酸酶（DNase）10μg/ml]中37℃持续振荡0.5 h；在pH 7.6的Tris等渗缓冲液中37℃持续振荡1 h。组织学证实完整去除HV表面的内皮细胞成分，保留间质细胞及细胞外基质结构的完整性。
1.1.2 去全部细胞HV的制备
将同种主动脉带瓣管道置于pH 8.0的Tris低渗缓冲液中（含有10 U/ml抑肽酶和EDTA）4℃静置12 h；在1%去氧胆酸（1%DOA）的pH 8.0的Tris等渗缓冲液（10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）中，37℃持续振荡24 h；最后在pH7.6的Tris等渗缓冲液中（RNase 20μg/ml、DNase 200μg/ml）中37℃持续振荡2 h。组织学证实完整去除HV组织中的全部细胞成分，细胞外基质结构完整[6]。
1.2 观察指标和方法
1.2.1 两种去细胞HV的抗原标记免疫学特性
采用大鼠抗人HLA-DR单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）分别标记深低温保存HV、去内皮细胞HV及去全部细胞HV，两步法免疫组织化学法评价两种去细胞HV瓣叶及管壁组织免疫学特性变化。
1.2.2 两种去细胞HV在体实验免疫学特性
将SD清洁级雄性大鼠18只（体重250～300 g，北京动物实验中心提供）分为深低温保存HV组、去内皮细胞HV组和去全部细胞HV组，每组6只。1%戊巴比妥腹腔麻醉（50 mg/kg），大鼠背部正中切口约0.8～1.0 cm，游离皮下组织，分别对称性放入1 cm×1 cm大小组织，间断缝合皮肤，喂养8周。所有大鼠顺利康复，无死亡及伤口感染。8周后，应用颈椎脱臼法处死大鼠，仔细游离皮下组织，完整取出组织。10%中性甲醛固定，HE染色观察两种去细胞HV瓣叶及管壁组织结构及免疫反应变化。
组织钙化程度评价：定性分析（钙盐染色）：Van Kosaa银染色法定性评价各组瓣叶及管壁组织钙化程度。定量分析（原子吸收光度计法）：①干燥；②加入王水（HCl∶HNO3=3∶1）加热使样品分解；③高氯酸完全溶解样品；④加热至溶液冒烟，冷却至室温；⑤加入5%氯化镧溶液；⑥用去离子水稀释，摇匀；⑦原子吸收光谱仪（Z80，日立公司）测量，激发钙离子，测量钙离子含量，同时做空白对照。定量分析两种去细胞HV瓣叶及管壁组织钙化程度。
1.3 统计学分析
用SPSS18.0统计软件进行统计处理。计量资料用均数±标准差（
2 结果
2.1 两种去细胞HV的抗原标记免疫学特性
深低温液氮保存HV瓣膜及其管壁组织的内皮细胞、间质细胞及细胞外基质HLA-DR抗原表达均呈阳性，尤以内皮细胞表达显著，间质细胞次之，细胞外基质表达呈弱阳性；去内皮细胞，瓣叶及管壁组织HLA-DR抗原表达下降，但组织中间质细胞仍表达较强的免疫原性，且组织中间质细胞数量显著多于内皮细胞；去全部细胞后，瓣叶及管壁组织HLA-DR抗原表达显著下降，仅细胞外基质呈弱阳性，见图 1和图 2。
图1
不同HV瓣叶抗原标记的免疫学变化免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图2
不同HV管壁抗原标记的免疫学变化免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
2.2 两种去细胞HV在体实验免疫学特性
2.2.1 两种去细胞HV在体实验免疫反应
深低温液氮保存HV瓣叶及管壁组织中有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞浸润更为显著；去内皮细胞HV炎性反应亦显著，有大量炎性细胞浸润；去全部细胞HV炎性反应明显下降，仅组织边缘有少量炎性细胞浸润，见图 3和图 4。
图3
不同HV瓣叶在体实验免疫反应免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图4
不同HV管壁在体实验免疫反应免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
2.2.2 两种去细胞HV在体实验组织钙化程度
（1）定性分析：深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织中均可见钙盐沉积，呈大量的黑色颗粒，尤管壁组织更为显著；而去全部细胞HV钙盐沉积极少，见图 5和图 6。（2）定量分析：去全部细胞HV瓣叶及管壁组织钙盐含量均较深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织较深低温液氮保存HV钙盐含量差异无统计学意义（P > 0.05），管壁组织钙盐含量增高较瓣叶组织更加显著，见表 1。
图5
不同HV瓣叶在体实验组织钙化程度免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图6
不同HV管壁在体实验组织钙化程度免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
表1
同种心脏瓣膜皮下移植8周后组织钙盐含量变化（n=6，mg/g，3 讨论
1962年，Ross教授首次应用HV行主动脉瓣置换，HV及其带瓣管道因其优良的抗血栓、抗感染性能和良好的血流动力学效果，易于种植，术后不需抗凝，大小适宜，广泛应用于瓣膜置换术及矫治婴幼儿复杂先心病术中，取得了良好的临床疗效。但HV及其带瓣管道移植于体内可激发免疫反应，远期随访发现其易钙化、毁损，需要再次移植，在婴幼儿患者更为显著。
人类白细胞抗原（尤其是HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ）是决定人同种移植物与受体是否相容的主要抗原。人体心脏瓣膜及管壁组织由内皮细胞、间质细胞（成纤维细胞、平滑肌细胞等）和细胞外基质（胶原蛋白、弹性蛋白、粘多糖蛋白）等构成。目前HV及其带瓣管道大多采用深低温液氮保存，该方法明显改善了HV瓣膜及管壁组织中内皮细胞、间质细胞的活性以及组织结构和生物力学的完整性。但研究表明深低温液氮保存的HV及其带瓣管道表面覆盖激活的内皮细胞，表达血小板内皮细胞粘附分子（CD31）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、HLA-Ⅱ等分子，HLA-Ⅱ阳性的巨噬细胞和T淋巴细胞分散于瓣叶及其管壁组织的基质和内膜下层[7-11]。内皮细胞是抗原性最强的细胞成分，间质细胞及细胞外基质抗原性较弱，瓣膜及其管壁组织内失活的内皮细胞、间质细胞、细胞碎片和残留的细胞核亦存在抗原性，是同种心脏瓣膜及其带瓣管道移植后早期发生钙化的好发部位[12-14]。
在本研究中，HLA-DR大鼠抗人单克隆抗体免疫组织化学结果证实深低温液氮保存HV瓣膜及管壁组织中的内皮细胞表达较强的免疫原性，间质细胞免疫原性稍弱，细胞外基质亦有一定的免疫原性；去内皮细胞后，HLA-DR抗原表达有所下降，但组织中间质细胞较内皮细胞数量明显增多，且管壁组织较瓣膜组织更为显著，组织中保留的大量间质细胞表达较强的免疫原性；去全部细胞后免疫原性显著下降，仅细胞外基质保留较弱的免疫原性。大鼠皮下移植8周后，深低温液氮保存HV及去内皮细胞HV的瓣叶及管壁组织中可见以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，而去全部细胞HV仅组织的边缘可见炎性细胞浸润。钙盐染色结果发现深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织中可见大量的黑色颗粒，尤管壁组织更为显著，表明有大量钙盐沉积，而去全部细胞HV钙盐沉积极少。钙含量测定结果发现深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV钙含量差异无统计学意义，但去全部细胞HV的钙含量显著减少[15-20]。
综上所述，去全部细胞HV瓣叶及管壁组织免疫原性均显著下降，移植后炎性反应和组织钙化程度显著减轻。去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织免疫原性及移植后炎性反应有所下降，但移植后组织钙化程度仍显著增高，且管壁组织钙盐含量增高较瓣叶组织更加显著。以上结果提示组织中大量的间质细胞可能是参与HV移植后免疫反应、导致HV移植后钙化毁损的主要组织成份。
同种心脏瓣膜（homograft valve，HV）及其带瓣管道是目前理想的人工心脏瓣膜，已广泛应用于瓣膜置换术及矫治婴幼儿复杂先天性心脏病术中，但远期随访发现瓣膜仍有钙化和毁损，需要再次置换[1-2]。研究表明HV移植于体内可激发免疫反应，供体特异性的白细胞抗原（HLA-Ⅰ抗原、HLA-Ⅱ抗原）抗体、特异性的高亲和性细胞毒性T淋巴细胞前体（CTLp）、外周血中辅助性T淋巴细胞（HTLP）的表达均显著增高，在婴幼儿患者更为显著[3-5]。我们采用深低温液氮保存人HV，应用组织工程学方法去除HV瓣膜及管壁组织中的内皮细胞成分或全部细胞成分，比较两种去细胞HV免疫原性的变化。
1 材料与方法
1.1 材料制备
1.1.1 去内皮细胞HV的制备
取深低温液氮保存健康成年男性脑死亡6 h内志愿捐献者的人同种主动脉带瓣管道。将同种主动脉带瓣管道置于pH 8.0的Tris低渗缓冲液中[（含10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）]，4℃静置1 h；在1%Triton的pH 8.0的Tris等渗缓冲液[（10 U/ml抑肽酶和0.1%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）]中，37℃持续振荡2 h；在pH 7.6的Tris等渗缓冲液中[核糖核酸酶（RNase）1μg/ml、去氧核糖核酸酶（DNase）10μg/ml]中37℃持续振荡0.5 h；在pH 7.6的Tris等渗缓冲液中37℃持续振荡1 h。组织学证实完整去除HV表面的内皮细胞成分，保留间质细胞及细胞外基质结构的完整性。
1.1.2 去全部细胞HV的制备
将同种主动脉带瓣管道置于pH 8.0的Tris低渗缓冲液中（含有10 U/ml抑肽酶和EDTA）4℃静置12 h；在1%去氧胆酸（1%DOA）的pH 8.0的Tris等渗缓冲液（10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）中，37℃持续振荡24 h；最后在pH7.6的Tris等渗缓冲液中（RNase 20μg/ml、DNase 200μg/ml）中37℃持续振荡2 h。组织学证实完整去除HV组织中的全部细胞成分，细胞外基质结构完整[6]。
1.2 观察指标和方法
1.2.1 两种去细胞HV的抗原标记免疫学特性
采用大鼠抗人HLA-DR单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）分别标记深低温保存HV、去内皮细胞HV及去全部细胞HV，两步法免疫组织化学法评价两种去细胞HV瓣叶及管壁组织免疫学特性变化。
1.2.2 两种去细胞HV在体实验免疫学特性
将SD清洁级雄性大鼠18只（体重250～300 g，北京动物实验中心提供）分为深低温保存HV组、去内皮细胞HV组和去全部细胞HV组，每组6只。1%戊巴比妥腹腔麻醉（50 mg/kg），大鼠背部正中切口约0.8～1.0 cm，游离皮下组织，分别对称性放入1 cm×1 cm大小组织，间断缝合皮肤，喂养8周。所有大鼠顺利康复，无死亡及伤口感染。8周后，应用颈椎脱臼法处死大鼠，仔细游离皮下组织，完整取出组织。10%中性甲醛固定，HE染色观察两种去细胞HV瓣叶及管壁组织结构及免疫反应变化。
组织钙化程度评价：定性分析（钙盐染色）：Van Kosaa银染色法定性评价各组瓣叶及管壁组织钙化程度。定量分析（原子吸收光度计法）：①干燥；②加入王水（HCl∶HNO3=3∶1）加热使样品分解；③高氯酸完全溶解样品；④加热至溶液冒烟，冷却至室温；⑤加入5%氯化镧溶液；⑥用去离子水稀释，摇匀；⑦原子吸收光谱仪（Z80，日立公司）测量，激发钙离子，测量钙离子含量，同时做空白对照。定量分析两种去细胞HV瓣叶及管壁组织钙化程度。
1.3 统计学分析
用SPSS18.0统计软件进行统计处理。计量资料用均数±标准差（
2 结果
2.1 两种去细胞HV的抗原标记免疫学特性
深低温液氮保存HV瓣膜及其管壁组织的内皮细胞、间质细胞及细胞外基质HLA-DR抗原表达均呈阳性，尤以内皮细胞表达显著，间质细胞次之，细胞外基质表达呈弱阳性；去内皮细胞，瓣叶及管壁组织HLA-DR抗原表达下降，但组织中间质细胞仍表达较强的免疫原性，且组织中间质细胞数量显著多于内皮细胞；去全部细胞后，瓣叶及管壁组织HLA-DR抗原表达显著下降，仅细胞外基质呈弱阳性，见图 1和图 2。
图1
不同HV瓣叶抗原标记的免疫学变化免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图2
不同HV管壁抗原标记的免疫学变化免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
2.2 两种去细胞HV在体实验免疫学特性
2.2.1 两种去细胞HV在体实验免疫反应
深低温液氮保存HV瓣叶及管壁组织中有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞浸润更为显著；去内皮细胞HV炎性反应亦显著，有大量炎性细胞浸润；去全部细胞HV炎性反应明显下降，仅组织边缘有少量炎性细胞浸润，见图 3和图 4。
图3
不同HV瓣叶在体实验免疫反应免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图4
不同HV管壁在体实验免疫反应免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
2.2.2 两种去细胞HV在体实验组织钙化程度
（1）定性分析：深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织中均可见钙盐沉积，呈大量的黑色颗粒，尤管壁组织更为显著；而去全部细胞HV钙盐沉积极少，见图 5和图 6。（2）定量分析：去全部细胞HV瓣叶及管壁组织钙盐含量均较深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织较深低温液氮保存HV钙盐含量差异无统计学意义（P > 0.05），管壁组织钙盐含量增高较瓣叶组织更加显著，见表 1。
图5
不同HV瓣叶在体实验组织钙化程度免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
图6
不同HV管壁在体实验组织钙化程度免疫组织化学染色×100
注：A为深低温保存HV；B为去内皮细胞HV；C为去全部细胞HV
表1
同种心脏瓣膜皮下移植8周后组织钙盐含量变化（n=6，mg/g，3 讨论
1962年，Ross教授首次应用HV行主动脉瓣置换，HV及其带瓣管道因其优良的抗血栓、抗感染性能和良好的血流动力学效果，易于种植，术后不需抗凝，大小适宜，广泛应用于瓣膜置换术及矫治婴幼儿复杂先心病术中，取得了良好的临床疗效。但HV及其带瓣管道移植于体内可激发免疫反应，远期随访发现其易钙化、毁损，需要再次移植，在婴幼儿患者更为显著。
人类白细胞抗原（尤其是HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ）是决定人同种移植物与受体是否相容的主要抗原。人体心脏瓣膜及管壁组织由内皮细胞、间质细胞（成纤维细胞、平滑肌细胞等）和细胞外基质（胶原蛋白、弹性蛋白、粘多糖蛋白）等构成。目前HV及其带瓣管道大多采用深低温液氮保存，该方法明显改善了HV瓣膜及管壁组织中内皮细胞、间质细胞的活性以及组织结构和生物力学的完整性。但研究表明深低温液氮保存的HV及其带瓣管道表面覆盖激活的内皮细胞，表达血小板内皮细胞粘附分子（CD31）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、HLA-Ⅱ等分子，HLA-Ⅱ阳性的巨噬细胞和T淋巴细胞分散于瓣叶及其管壁组织的基质和内膜下层[7-11]。内皮细胞是抗原性最强的细胞成分，间质细胞及细胞外基质抗原性较弱，瓣膜及其管壁组织内失活的内皮细胞、间质细胞、细胞碎片和残留的细胞核亦存在抗原性，是同种心脏瓣膜及其带瓣管道移植后早期发生钙化的好发部位[12-14]。
在本研究中，HLA-DR大鼠抗人单克隆抗体免疫组织化学结果证实深低温液氮保存HV瓣膜及管壁组织中的内皮细胞表达较强的免疫原性，间质细胞免疫原性稍弱，细胞外基质亦有一定的免疫原性；去内皮细胞后，HLA-DR抗原表达有所下降，但组织中间质细胞较内皮细胞数量明显增多，且管壁组织较瓣膜组织更为显著，组织中保留的大量间质细胞表达较强的免疫原性；去全部细胞后免疫原性显著下降，仅细胞外基质保留较弱的免疫原性。大鼠皮下移植8周后，深低温液氮保存HV及去内皮细胞HV的瓣叶及管壁组织中可见以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，而去全部细胞HV仅组织的边缘可见炎性细胞浸润。钙盐染色结果发现深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织中可见大量的黑色颗粒，尤管壁组织更为显著，表明有大量钙盐沉积，而去全部细胞HV钙盐沉积极少。钙含量测定结果发现深低温液氮保存HV和去内皮细胞HV钙含量差异无统计学意义，但去全部细胞HV的钙含量显著减少[15-20]。
综上所述，去全部细胞HV瓣叶及管壁组织免疫原性均显著下降，移植后炎性反应和组织钙化程度显著减轻。去内皮细胞HV瓣叶及管壁组织免疫原性及移植后炎性反应有所下降，但移植后组织钙化程度仍显著增高，且管壁组织钙盐含量增高较瓣叶组织更加显著。以上结果提示组织中大量的间质细胞可能是参与HV移植后免疫反应、导致HV移植后钙化毁损的主要组织成份。
