引用本文： 王晓龙, 陈新涛, 曲戈, 马海波, 李印, 秦建军. 微小RNA-155在M1型、M2型巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞中的表达差异. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(5): 476-480. doi: 10.7507/1007-4848.20150124 复制
微小RNA（microRNA）通过调控免疫相关基因的表达影响免疫系统的发育和功能，进而参与诸如自身免疫性疾病、炎症及肿瘤等免疫相关疾病的发生发展[1]。近来有关微小RNA-155（miR-155）的研究显示其在炎症、免疫及肿瘤的病理生理过程中发挥重要作用[2]，其表达缺失可导致相关炎症、免疫等相关功能的缺失[3-6]。同时有研究报道miR-155具有抑制肿瘤的作用，其表达缺失可能引起肿瘤进展[7]。机体多种不同的生命活动（例如：组织重塑、炎症、免疫调节、清除凋亡细胞等）均有巨噬细胞的参与。巨噬细胞在不同微环境影响下可向不同类型分化且功能各异。根据活化的状态和发挥的作用不同将其分为M1型（经典活化的巨噬细胞）和M2型（替代性活化的巨噬细胞）[8]；同时肿瘤间质中存在着大量的巨噬细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。目前在不同类型巨噬细胞及TAMs中miR-155的表达情况尚不清楚。我们的实验通过诱导单核细胞系（THP-1）分别向巨噬细胞M1型、M2型及TAMs分化，采用荧光染料法实时定量PCR（SYBR Green qRT-PCR）技术，分别检测miR-155的表达情况，探讨miR-155在巨噬细胞M1型、M2型及TAMs中表达的差异。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
RPMI1640培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），佛波酯（PMA）（P1585，Sigma），重组人白细胞介素-4（IL-4，PEPROTECH），脂多糖（LPS，Sigma），重组人干扰素-γ（IFN-γ，PEPROTECH）；抗体PE-Cy5 CD11b（eBioscience），抗体FITC CD206（BioLegend），抗体PE CD16（BioLegend）。miRNA提取试剂盒（miRNeasy Mini kit）、反转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit）及荧光实时定量试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）、引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay、Hs_miR-15a均是购自Qiagen公司的成品。
1.1.2 细胞株
THP-1购自ATCC，EC9706获赠于郑州大学第一附属医院。
1.2 方法
1.2.1 巨噬细胞体外诱导
将50 ng/ml PMA刺激培养THP-1，并接种在6孔板中，培养基培养24 h，获得未分化巨噬细胞M0[9]；收集THP-1来源经PMA诱导刺激24 h的贴壁细胞（M0），采用流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达，确定为巨噬细胞后，将M0进一步诱导，采用20 ng/mL IFN-γ和100 ng/mL LPS刺激培养48 h，诱导出M1型巨噬细胞；采用100 ng/mL IL-4刺激培养48 h，诱导出M2型巨噬细胞[10-11]；使用EC9706上清液间接共培养M0 48 h，获得TAMs。
1.2.2 流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达
分别收集THP-1来源经PMA诱导刺激24 h的贴壁细胞（M0），及后续经诱导获得的贴壁细胞（M1），调整M2及TAMs细胞至5×105/管，磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次，50μl RPMI1640+1%FCS重悬，向M0中加入PE-Cy5 CD11b，向经诱导刺激后的M0中加入FITC CD206及PE CD16，避光室温孵育30 min，PBS洗2遍，再用PBS 400μl重悬后用BD FACS Calibur流式细胞仪检测[12-15]。
1.2.3 检测不同类型巨噬细胞miR-155表达的差异性
参照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）的说明书提取细胞总RNA，对总RNA进行质量检测，再按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）说明书进行反转录，在冰上配制逆转录反应液，反应循环参数：37℃60 min，95℃5 min，4℃forever；使用SYBR Green qRT-PCR方法对cDNA进行扩增，检测miR-155的相对表达情况；以15a为内参。按照miScript SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）说明书在冰上配置20μL real-time PCR反应液；反应条件为：95℃15 min；94℃15 s，57℃30 s，70℃34 s，40个循环。所有反应设立3个复孔。
1.3 统计学分析
用SPSS 16.0软件进行统计学分析。各组数据结果采用均数±标准差（
2 结果
2.1 THP-1细胞来源巨噬细胞的诱导和鉴定
THP-1细胞呈类圆形，在培养液悬浮生长（图 1），经PMA诱导后细胞形态逐渐变不规则，胞体增大，包浆出现空泡，细胞表面伸出伪足，2 h后开始逐渐贴壁，12 h后基本贴壁，24 h后完全贴壁生长成巨噬细胞（M0，图 2）。流式细胞仪检测显示巨噬细胞分化纯度达93%以上（图 3）。IFN-γ+LPS刺激M0向M1型分化比例达到96%以上（图 4A）；IL-4刺激M0细胞向M2型分化比例经达93%以上（图 4B）。M0与EC9706间接共培养获得TAMs，90%的细胞表型与M2型分化类似（图 4C）。
图1
THP-1细胞（未诱导） 图 2 PMA诱导后的THP-1
图3
THP-1来源巨噬细胞的鉴定
图4
不同分型巨噬细胞的鉴定
注：A为M1型；B为M2型；C为TAMs
2.2 miR-155的SYBR Green qRT-PCR检测结果
miR-155（图 5A）扩增曲线显示重复性良好。miR-155基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.2℃（图 5B），15a基因扩增曲线良好（图 5C），PCR产物的溶解曲线约在75.4℃（图 5D），溶解温度均较为均一，峰的形态明显，显示扩增的为特异性序列。
图5
SYBR Green qRT-PCR结果
注：A为miR-155扩增曲线良好；B为miR-155基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.2℃；C为15a扩增曲线良好；D为15a基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.4℃
2.3 miR-155在巨噬细胞M1型、M2型及TAMs中的表达
miR-155在巨噬细胞M1型中的表达量为6.580±0.637，在巨噬细胞M2型中的表达量为1.830±0.337，miR-155在TAMs中的表达量为1.600±0.233。单因素方差分析结果显示组间差异有统计学意义（F=1.238，P=0.000）。其中M2型（P=0.000）及TAMs（P=0.000）巨噬细胞中miR-155的表达量显著低于M1型；TAMs与巨噬细胞M2型中间miR-155的表达差异无统计学意义（P=0.546）。
3 讨论
miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3-末端的非翻译区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而实现了对靶基因的转录后调控，参与多种病理生理过程[16]。Has-miR-155位于染色体21q21.3，定位于GRCh37。miR-155由一个非编码基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）转录而成，位于BIC的第3个外显子[17]。
巨噬细胞作为一种具有较强可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，可表现出明显的功能性差异[14, 18]；根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞（classically activated macrophage）及M2型即替代性活化的巨噬细胞（alternatively activated macrophage）[8, 19]。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能，具有杀菌、抗肿瘤作用；M2型巨噬细胞可分泌IL-10、CCL2、CCL17、CCL22及TGF-β等，仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-β等对免疫应答进行负向调节[15, 20]。
本实验结果发现巨噬细胞M1型中miR-155高表达，miR-155在巨噬细胞M2型中的表达显著低于巨噬细胞M1型中的表达。miR-155在巨噬细胞M1型及M2型中表达的差异可能与其不同的细胞功能有关。研究发现，miR-155在炎症及免疫的病理生理过程中发挥着重要的作用，多种炎症递质可诱导使巨噬细胞中miRNA-155表达增加[21]。Vigorito等[4]证实miRNA-155在淋巴细胞免疫反应及生发中心的形成中发挥重要作用。Rodriguez等[5]发现miRNA-155基因敲除鼠树突状细胞的抗原提呈功能受限。另外，miRNA-155基因敲除鼠生发中心的功能、T细胞依赖的抗体反应及细胞因子产生均减低[6]。
TAMs是浸润至肿瘤组织内的巨噬细胞，目前研究显示TAMs可以促进肿瘤发生、生长、侵袭和转移[22]。有学者将TAMs与部分肿瘤细胞进行共培养，发现TAMs可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和重组人转录生长因子B（TGFB）等，这些生长因子能明显促进肿瘤细胞增殖，同时已在多种肿瘤中证实TAMs与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关[23]。
Dorsett等[7]证实miRNA-155是通过减少AID（activation-induced cytidine deaminase）产生的潜在癌基因转位从而起到抑制肿瘤的作用，miR-155的表达缺失可能引起肿瘤的进展。本实验结果发现TAMs中的miR-155表达较巨噬细胞M1型显著降低；TAMs表型与巨噬细胞M2型表型相似；TAMs与巨噬细胞M2型中间miR-155的表达差异无统计学意义。我们推测TAMs与巨噬细胞M2型具有相同的细胞功能，这与Murray等[24]研究结果相同。
综上所述，我们推测miR-155在巨噬细胞M1型、M2型中的差异性表达可能与其分化和/或细胞功能相关；TAMs的表型特征可能向巨噬细胞M2型转化，同时可能具有与巨噬细胞M2型相同的细胞功能。至于miR-155在不同巨噬细胞中发挥作用的详细机制，还需要进一步研究。
微小RNA（microRNA）通过调控免疫相关基因的表达影响免疫系统的发育和功能，进而参与诸如自身免疫性疾病、炎症及肿瘤等免疫相关疾病的发生发展[1]。近来有关微小RNA-155（miR-155）的研究显示其在炎症、免疫及肿瘤的病理生理过程中发挥重要作用[2]，其表达缺失可导致相关炎症、免疫等相关功能的缺失[3-6]。同时有研究报道miR-155具有抑制肿瘤的作用，其表达缺失可能引起肿瘤进展[7]。机体多种不同的生命活动（例如：组织重塑、炎症、免疫调节、清除凋亡细胞等）均有巨噬细胞的参与。巨噬细胞在不同微环境影响下可向不同类型分化且功能各异。根据活化的状态和发挥的作用不同将其分为M1型（经典活化的巨噬细胞）和M2型（替代性活化的巨噬细胞）[8]；同时肿瘤间质中存在着大量的巨噬细胞，称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。目前在不同类型巨噬细胞及TAMs中miR-155的表达情况尚不清楚。我们的实验通过诱导单核细胞系（THP-1）分别向巨噬细胞M1型、M2型及TAMs分化，采用荧光染料法实时定量PCR（SYBR Green qRT-PCR）技术，分别检测miR-155的表达情况，探讨miR-155在巨噬细胞M1型、M2型及TAMs中表达的差异。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
RPMI1640培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），佛波酯（PMA）（P1585，Sigma），重组人白细胞介素-4（IL-4，PEPROTECH），脂多糖（LPS，Sigma），重组人干扰素-γ（IFN-γ，PEPROTECH）；抗体PE-Cy5 CD11b（eBioscience），抗体FITC CD206（BioLegend），抗体PE CD16（BioLegend）。miRNA提取试剂盒（miRNeasy Mini kit）、反转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit）及荧光实时定量试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）、引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay、Hs_miR-15a均是购自Qiagen公司的成品。
1.1.2 细胞株
THP-1购自ATCC，EC9706获赠于郑州大学第一附属医院。
1.2 方法
1.2.1 巨噬细胞体外诱导
将50 ng/ml PMA刺激培养THP-1，并接种在6孔板中，培养基培养24 h，获得未分化巨噬细胞M0[9]；收集THP-1来源经PMA诱导刺激24 h的贴壁细胞（M0），采用流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达，确定为巨噬细胞后，将M0进一步诱导，采用20 ng/mL IFN-γ和100 ng/mL LPS刺激培养48 h，诱导出M1型巨噬细胞；采用100 ng/mL IL-4刺激培养48 h，诱导出M2型巨噬细胞[10-11]；使用EC9706上清液间接共培养M0 48 h，获得TAMs。
1.2.2 流式细胞仪检测细胞膜蛋白表达
分别收集THP-1来源经PMA诱导刺激24 h的贴壁细胞（M0），及后续经诱导获得的贴壁细胞（M1），调整M2及TAMs细胞至5×105/管，磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次，50μl RPMI1640+1%FCS重悬，向M0中加入PE-Cy5 CD11b，向经诱导刺激后的M0中加入FITC CD206及PE CD16，避光室温孵育30 min，PBS洗2遍，再用PBS 400μl重悬后用BD FACS Calibur流式细胞仪检测[12-15]。
1.2.3 检测不同类型巨噬细胞miR-155表达的差异性
参照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）的说明书提取细胞总RNA，对总RNA进行质量检测，再按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）说明书进行反转录，在冰上配制逆转录反应液，反应循环参数：37℃60 min，95℃5 min，4℃forever；使用SYBR Green qRT-PCR方法对cDNA进行扩增，检测miR-155的相对表达情况；以15a为内参。按照miScript SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）说明书在冰上配置20μL real-time PCR反应液；反应条件为：95℃15 min；94℃15 s，57℃30 s，70℃34 s，40个循环。所有反应设立3个复孔。
1.3 统计学分析
用SPSS 16.0软件进行统计学分析。各组数据结果采用均数±标准差（
2 结果
2.1 THP-1细胞来源巨噬细胞的诱导和鉴定
THP-1细胞呈类圆形，在培养液悬浮生长（图 1），经PMA诱导后细胞形态逐渐变不规则，胞体增大，包浆出现空泡，细胞表面伸出伪足，2 h后开始逐渐贴壁，12 h后基本贴壁，24 h后完全贴壁生长成巨噬细胞（M0，图 2）。流式细胞仪检测显示巨噬细胞分化纯度达93%以上（图 3）。IFN-γ+LPS刺激M0向M1型分化比例达到96%以上（图 4A）；IL-4刺激M0细胞向M2型分化比例经达93%以上（图 4B）。M0与EC9706间接共培养获得TAMs，90%的细胞表型与M2型分化类似（图 4C）。
图1
THP-1细胞（未诱导） 图 2 PMA诱导后的THP-1
图3
THP-1来源巨噬细胞的鉴定
图4
不同分型巨噬细胞的鉴定
注：A为M1型；B为M2型；C为TAMs
2.2 miR-155的SYBR Green qRT-PCR检测结果
miR-155（图 5A）扩增曲线显示重复性良好。miR-155基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.2℃（图 5B），15a基因扩增曲线良好（图 5C），PCR产物的溶解曲线约在75.4℃（图 5D），溶解温度均较为均一，峰的形态明显，显示扩增的为特异性序列。
图5
SYBR Green qRT-PCR结果
注：A为miR-155扩增曲线良好；B为miR-155基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.2℃；C为15a扩增曲线良好；D为15a基因PCR产物的溶解曲线峰值约在75.4℃
2.3 miR-155在巨噬细胞M1型、M2型及TAMs中的表达
miR-155在巨噬细胞M1型中的表达量为6.580±0.637，在巨噬细胞M2型中的表达量为1.830±0.337，miR-155在TAMs中的表达量为1.600±0.233。单因素方差分析结果显示组间差异有统计学意义（F=1.238，P=0.000）。其中M2型（P=0.000）及TAMs（P=0.000）巨噬细胞中miR-155的表达量显著低于M1型；TAMs与巨噬细胞M2型中间miR-155的表达差异无统计学意义（P=0.546）。
3 讨论
miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3-末端的非翻译区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而实现了对靶基因的转录后调控，参与多种病理生理过程[16]。Has-miR-155位于染色体21q21.3，定位于GRCh37。miR-155由一个非编码基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）转录而成，位于BIC的第3个外显子[17]。
巨噬细胞作为一种具有较强可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，可表现出明显的功能性差异[14, 18]；根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞（classically activated macrophage）及M2型即替代性活化的巨噬细胞（alternatively activated macrophage）[8, 19]。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能，具有杀菌、抗肿瘤作用；M2型巨噬细胞可分泌IL-10、CCL2、CCL17、CCL22及TGF-β等，仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-β等对免疫应答进行负向调节[15, 20]。
本实验结果发现巨噬细胞M1型中miR-155高表达，miR-155在巨噬细胞M2型中的表达显著低于巨噬细胞M1型中的表达。miR-155在巨噬细胞M1型及M2型中表达的差异可能与其不同的细胞功能有关。研究发现，miR-155在炎症及免疫的病理生理过程中发挥着重要的作用，多种炎症递质可诱导使巨噬细胞中miRNA-155表达增加[21]。Vigorito等[4]证实miRNA-155在淋巴细胞免疫反应及生发中心的形成中发挥重要作用。Rodriguez等[5]发现miRNA-155基因敲除鼠树突状细胞的抗原提呈功能受限。另外，miRNA-155基因敲除鼠生发中心的功能、T细胞依赖的抗体反应及细胞因子产生均减低[6]。
TAMs是浸润至肿瘤组织内的巨噬细胞，目前研究显示TAMs可以促进肿瘤发生、生长、侵袭和转移[22]。有学者将TAMs与部分肿瘤细胞进行共培养，发现TAMs可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和重组人转录生长因子B（TGFB）等，这些生长因子能明显促进肿瘤细胞增殖，同时已在多种肿瘤中证实TAMs与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关[23]。
Dorsett等[7]证实miRNA-155是通过减少AID（activation-induced cytidine deaminase）产生的潜在癌基因转位从而起到抑制肿瘤的作用，miR-155的表达缺失可能引起肿瘤的进展。本实验结果发现TAMs中的miR-155表达较巨噬细胞M1型显著降低；TAMs表型与巨噬细胞M2型表型相似；TAMs与巨噬细胞M2型中间miR-155的表达差异无统计学意义。我们推测TAMs与巨噬细胞M2型具有相同的细胞功能，这与Murray等[24]研究结果相同。
综上所述，我们推测miR-155在巨噬细胞M1型、M2型中的差异性表达可能与其分化和/或细胞功能相关；TAMs的表型特征可能向巨噬细胞M2型转化，同时可能具有与巨噬细胞M2型相同的细胞功能。至于miR-155在不同巨噬细胞中发挥作用的详细机制，还需要进一步研究。
