引用本文： 李钢, 孙清超, 李德生, 居来提, 艾尼瓦尔·张力为, 买地尼也提·尼亚孜. 维吾尔族食管鳞癌组织中VEGFR-2表达及其临床意义. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(8): 773-777. doi: 10.7507/1007-4848.20150193 复制
食管癌（esophageal carcinoma，EC）是世界第七大肿瘤[1]，90%以上的食管癌是鳞癌。中国肿瘤登记中心发布的《2012年中国肿瘤登记年报》显示，食管癌肿瘤发病率居第五位，死亡率居第四位。同时其在世界范围内发病率呈增长的趋势[2]。新疆是食管癌的高发地区，哈萨克族是食管癌发病最高的民族，其次是蒙古族、维吾尔族[3]。血管内皮生长因子受体-2 （vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）是一种由激酶插入区受体(kinase inserted domain containing receptor，KDR)编码的跨膜蛋白激酶受体。Terman等1991年第一次成功分离获取VEGFR-2。它主要分布在血管内皮细胞中，造血干细胞、巨噬细胞等也能见其表达[4]。VEGFR-2与其配体VEGF相结合后，表现出了较强的蛋白酪氨酸激酶活性，并介导肿瘤血管内皮细胞DNA的合成、增殖[5]。多项研究表明VEGFR-2在多种恶性肿瘤组织中均有表达[6-8]，并且和肿瘤的发生、转移、预后密切相关。长期以来对哈萨克族食管癌的研究较多，而对维吾尔族食管癌研究相对较少。查阅国内外文献，维吾尔族食管癌VEGFR-2研究尚未见报道。本研究检测维吾尔食管鳞癌组织中VEGFR-2的表达，分析其表达与食管癌临床病理因素的关系，并探讨其在患者生存和预后中的意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2007年1月至2009年9月新疆医科大学第一附属医院病理科收集制作的石蜡包埋标本。纳入标准：我院胸外科手术切除的维吾尔族食管鳞癌癌组织及相应的癌旁组织，经病理诊断为食管鳞癌，术后接受常规放化疗治疗。排除标准：术前接受过放化疗治疗，随访中失访的患者。患者肿瘤组织 72例，未发现肿瘤侵犯的癌旁组织28例。其中男56例、女16例，年龄57 （43～79） 岁。临床分期按2012年国际抗癌联盟（UICC）的TMN分期标准进行。Ⅰ期23例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例。肿瘤大小在5 cm 以下40例，大于等于5 cm 32例。组织分化程度：高分化17例，中分化29例，低分化26例。淋巴结转移阴性34例，转移阳性38例。临床随访1～60个月。
1.2 方法
兔抗VEGFR-2多克隆抗体及SP试剂盒购自北京中杉金桥公司。DAB试剂盒、兔抗人VEGFR-2多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。
标本经10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋，连续4 µm厚度切片，以二甲苯脱蜡，然后以3% H2O2抑制内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。0.01 mol/L构橼酸抗原修复液进行微波修复，解冻温度为92～98 ℃，解冻时间13 min，室温下冷却，蒸馏水水洗一遍，PBS洗一遍。滴加羊血清，室温下孵育10 min以阻断非特异性反应。滴加兔抗人VEGFR-2抗体（工作浓度为1︰50）、湿盒内4 ℃孵育过夜，3次PBS洗涤，滴加二抗，37℃孵育30 min。再经3次PBS洗涤，二氨基联苯胺（DAB）显色，然后苏木素复染，脱水，透明，封片。
1.3 VEGFR-2结果判定
VEGFR-2效应产物主要定位于肿瘤细胞的细胞浆，阳性标准参考Sinicrope 改良法标准[9]，按肿瘤细胞染色强度及阳性着色细胞所占百分比二者结合进行判定评分：0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。按肿瘤细胞阳性百分比评分：0分为阴性；1分为＜10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为＞75%。按照染色强度评分与阳性细胞百分比评分的和决定最终染色结果：其中0～3分为阴性，4 分以上为阳性。
1.4 统计学分析
结果处理应用SPSS16.0软件，采用χ2检验和秩和检验评估VEGFR-2的表达和其他变量的相互关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGFR-2的阳性表达
在72例维吾尔族患者食管鳞癌组织中VEGFR-2阳性表达率为80.56% （58/72）（图 1），相应的28例维吾尔族食管鳞癌患者癌旁正常组织VEGFR-2均无阳性表达（0/28）；两组差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。
图1
VEGFR-2在维吾尔族食管鳞癌中的表达
注：A为中分化鳞状细胞癌 HE ×20；B为VEGFR-2阴性表达，中分化鳞状细胞癌免疫组织化学SP法 ×20；C为VEGFR-2阳性表达，中-高分化鳞状细胞癌免疫组织化学SP法 ×20
表1
维吾尔族食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织VEGFR-2阳性表达率的比较（例）
2.2 VEGFR-2阳性表达与食管癌临床病理学特征的关系
VEGFR-2阳性表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期有相关性（P＜0.05），而与肿瘤大小无相关性（P＞0.05，表 2）。
表2
VEGFR-2表达与维吾尔族食管鳞癌临床病理特征的关系（例）
2.3 VEGFR-2阳性表达与维吾尔族食管癌患者生存的关系
58例维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阳性患者中，有45例死于肿瘤复发和转移，1例死于并发症，6例死于心脑血管意外；14例维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性患者中，7例死于肿瘤复发和转移，3例死于心脑血管意外。Kaplan-Meier生存分析显示：维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性组与维吾尔族食管癌VEGFR-2表达阳性组平均5年生存时间分别是51.1个月及40.4个月，95%的可信区间分别是（46.3，55.9）个月和（37.1，43.7）个月。维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性组与维吾尔族VEGFR-2表达阳性组5年中位生存时间分别是50个月及40个月，95%的可信区间分别是（39.6，60.4）个月和（34.8，45.1）个月。log-rank检验显示：维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阴性表达组和维吾尔族食管鳞癌阳性表达组5年生存率分别是50.0%和22.4%，维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阴性表达组生存率明显高于维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阳性表达组，两组差异有统计学意义（χ2=6.457，P=0.011，图 2）。
图2
VEGFR-2阳性组与阴性组累计生存曲线
多因素生存Cox比例模型风险模型分析显示在维吾尔族食管鳞癌患者中VEGFR-2、淋巴结转移及TNM分期具有独立的预后意义（P＜0.05），VEGFR-2阳性表达、淋巴结转移、肿瘤分期将增加维吾尔族食管癌患者的死亡风险（表 3）。
表3
维吾尔族食管鳞癌患者多因素Cox模型分析结果
3 讨论
在肿瘤生长和转移过程中，血管的活跃生长是关键因素之一。血管不仅是肿瘤的氧供和营养通路，也是肿瘤转移的通路。肿瘤细胞进入人体系统循环血管的作用是必不可少的[10]。VEGF是参于肿瘤血管的生成和调控的多种血管生成因子中活性最强、专属性最高的血管生成因子[11]。而VEGF-2是VEGF最主要的功能受体[12-13]。VEGF/VEGFR-2信号转导通路是当今抗肿瘤基因靶向治疗的热点。近期研究中，蒋晓东等[14]研究发现VEGFR-2在肺癌组织中的表达高达60%，VEGFR-2与肺癌的淋巴结转移、分化程度密切相关。蒙玉刚等[15]研究发现高表达水平的VEGFR-2在宫颈癌组织的生长、浸润和转移中起重要作用。查询相关研究报道，在输卵管癌、胃癌和乳腺癌中VEGFR-2的表达与肿瘤临床特征关系密切[16-18]。
本研究结果显示：在维吾尔族食管鳞癌患者中，VEGFR-2阳性表达率高于相应癌旁正常组织，且差异有统计学意义（P＜0.05），这说明VEGFR-2的阳性表达与食管鳞癌的发生关系密切。在维吾尔族食管鳞癌患者中VEGFR-2阳性表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移以及临床分期关系密切。VEGFR-2表达的阳性率可能成为判断食管鳞癌的恶性程度及预测食管鳞癌发生侵袭转移的分子生物学标志物之一。根据生存分析结果，我们认为：在维吾尔族食管鳞癌患者VEGFR-2阴性表达组5年生存率明显高于维吾尔食管鳞癌患者VEGFR-2阳性表达组；VEGFR-2阳性表达、淋巴结转移、肿瘤分期是影响维吾尔族食管鳞癌的重要因素，均具有独立的预后意义，这表明VEGFR-2不仅参与了食管鳞癌血管的生成，对食管鳞癌的进展起促进作用，而且与食管鳞癌的预后同样密切相关。
本次研究中总的食管癌样本量相对不足，由于手术切除的癌旁组织大部分达不到要求导致癌旁组织缺失，这些因素可能对研究结果产生一定的偏移。总之本研究显示：VEGFR-2与维吾尔族食管鳞癌的临床病理参数密切相关，VEGFR-2可能和其它指标结合起来，对维吾尔族食管鳞癌的临床论断、转移风险及预后提供支持依据。
食管癌（esophageal carcinoma，EC）是世界第七大肿瘤[1]，90%以上的食管癌是鳞癌。中国肿瘤登记中心发布的《2012年中国肿瘤登记年报》显示，食管癌肿瘤发病率居第五位，死亡率居第四位。同时其在世界范围内发病率呈增长的趋势[2]。新疆是食管癌的高发地区，哈萨克族是食管癌发病最高的民族，其次是蒙古族、维吾尔族[3]。血管内皮生长因子受体-2 （vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）是一种由激酶插入区受体(kinase inserted domain containing receptor，KDR)编码的跨膜蛋白激酶受体。Terman等1991年第一次成功分离获取VEGFR-2。它主要分布在血管内皮细胞中，造血干细胞、巨噬细胞等也能见其表达[4]。VEGFR-2与其配体VEGF相结合后，表现出了较强的蛋白酪氨酸激酶活性，并介导肿瘤血管内皮细胞DNA的合成、增殖[5]。多项研究表明VEGFR-2在多种恶性肿瘤组织中均有表达[6-8]，并且和肿瘤的发生、转移、预后密切相关。长期以来对哈萨克族食管癌的研究较多，而对维吾尔族食管癌研究相对较少。查阅国内外文献，维吾尔族食管癌VEGFR-2研究尚未见报道。本研究检测维吾尔食管鳞癌组织中VEGFR-2的表达，分析其表达与食管癌临床病理因素的关系，并探讨其在患者生存和预后中的意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2007年1月至2009年9月新疆医科大学第一附属医院病理科收集制作的石蜡包埋标本。纳入标准：我院胸外科手术切除的维吾尔族食管鳞癌癌组织及相应的癌旁组织，经病理诊断为食管鳞癌，术后接受常规放化疗治疗。排除标准：术前接受过放化疗治疗，随访中失访的患者。患者肿瘤组织 72例，未发现肿瘤侵犯的癌旁组织28例。其中男56例、女16例，年龄57 （43～79） 岁。临床分期按2012年国际抗癌联盟（UICC）的TMN分期标准进行。Ⅰ期23例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例。肿瘤大小在5 cm 以下40例，大于等于5 cm 32例。组织分化程度：高分化17例，中分化29例，低分化26例。淋巴结转移阴性34例，转移阳性38例。临床随访1～60个月。
1.2 方法
兔抗VEGFR-2多克隆抗体及SP试剂盒购自北京中杉金桥公司。DAB试剂盒、兔抗人VEGFR-2多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。
标本经10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋，连续4 µm厚度切片，以二甲苯脱蜡，然后以3% H2O2抑制内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。0.01 mol/L构橼酸抗原修复液进行微波修复，解冻温度为92～98 ℃，解冻时间13 min，室温下冷却，蒸馏水水洗一遍，PBS洗一遍。滴加羊血清，室温下孵育10 min以阻断非特异性反应。滴加兔抗人VEGFR-2抗体（工作浓度为1︰50）、湿盒内4 ℃孵育过夜，3次PBS洗涤，滴加二抗，37℃孵育30 min。再经3次PBS洗涤，二氨基联苯胺（DAB）显色，然后苏木素复染，脱水，透明，封片。
1.3 VEGFR-2结果判定
VEGFR-2效应产物主要定位于肿瘤细胞的细胞浆，阳性标准参考Sinicrope 改良法标准[9]，按肿瘤细胞染色强度及阳性着色细胞所占百分比二者结合进行判定评分：0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。按肿瘤细胞阳性百分比评分：0分为阴性；1分为＜10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为＞75%。按照染色强度评分与阳性细胞百分比评分的和决定最终染色结果：其中0～3分为阴性，4 分以上为阳性。
1.4 统计学分析
结果处理应用SPSS16.0软件，采用χ2检验和秩和检验评估VEGFR-2的表达和其他变量的相互关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGFR-2的阳性表达
在72例维吾尔族患者食管鳞癌组织中VEGFR-2阳性表达率为80.56% （58/72）（图 1），相应的28例维吾尔族食管鳞癌患者癌旁正常组织VEGFR-2均无阳性表达（0/28）；两组差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。
图1
VEGFR-2在维吾尔族食管鳞癌中的表达
注：A为中分化鳞状细胞癌 HE ×20；B为VEGFR-2阴性表达，中分化鳞状细胞癌免疫组织化学SP法 ×20；C为VEGFR-2阳性表达，中-高分化鳞状细胞癌免疫组织化学SP法 ×20
表1
维吾尔族食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织VEGFR-2阳性表达率的比较（例）
2.2 VEGFR-2阳性表达与食管癌临床病理学特征的关系
VEGFR-2阳性表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期有相关性（P＜0.05），而与肿瘤大小无相关性（P＞0.05，表 2）。
表2
VEGFR-2表达与维吾尔族食管鳞癌临床病理特征的关系（例）
2.3 VEGFR-2阳性表达与维吾尔族食管癌患者生存的关系
58例维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阳性患者中，有45例死于肿瘤复发和转移，1例死于并发症，6例死于心脑血管意外；14例维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性患者中，7例死于肿瘤复发和转移，3例死于心脑血管意外。Kaplan-Meier生存分析显示：维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性组与维吾尔族食管癌VEGFR-2表达阳性组平均5年生存时间分别是51.1个月及40.4个月，95%的可信区间分别是（46.3，55.9）个月和（37.1，43.7）个月。维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2表达阴性组与维吾尔族VEGFR-2表达阳性组5年中位生存时间分别是50个月及40个月，95%的可信区间分别是（39.6，60.4）个月和（34.8，45.1）个月。log-rank检验显示：维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阴性表达组和维吾尔族食管鳞癌阳性表达组5年生存率分别是50.0%和22.4%，维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阴性表达组生存率明显高于维吾尔族食管鳞癌VEGFR-2阳性表达组，两组差异有统计学意义（χ2=6.457，P=0.011，图 2）。
图2
VEGFR-2阳性组与阴性组累计生存曲线
多因素生存Cox比例模型风险模型分析显示在维吾尔族食管鳞癌患者中VEGFR-2、淋巴结转移及TNM分期具有独立的预后意义（P＜0.05），VEGFR-2阳性表达、淋巴结转移、肿瘤分期将增加维吾尔族食管癌患者的死亡风险（表 3）。
表3
维吾尔族食管鳞癌患者多因素Cox模型分析结果
3 讨论
在肿瘤生长和转移过程中，血管的活跃生长是关键因素之一。血管不仅是肿瘤的氧供和营养通路，也是肿瘤转移的通路。肿瘤细胞进入人体系统循环血管的作用是必不可少的[10]。VEGF是参于肿瘤血管的生成和调控的多种血管生成因子中活性最强、专属性最高的血管生成因子[11]。而VEGF-2是VEGF最主要的功能受体[12-13]。VEGF/VEGFR-2信号转导通路是当今抗肿瘤基因靶向治疗的热点。近期研究中，蒋晓东等[14]研究发现VEGFR-2在肺癌组织中的表达高达60%，VEGFR-2与肺癌的淋巴结转移、分化程度密切相关。蒙玉刚等[15]研究发现高表达水平的VEGFR-2在宫颈癌组织的生长、浸润和转移中起重要作用。查询相关研究报道，在输卵管癌、胃癌和乳腺癌中VEGFR-2的表达与肿瘤临床特征关系密切[16-18]。
本研究结果显示：在维吾尔族食管鳞癌患者中，VEGFR-2阳性表达率高于相应癌旁正常组织，且差异有统计学意义（P＜0.05），这说明VEGFR-2的阳性表达与食管鳞癌的发生关系密切。在维吾尔族食管鳞癌患者中VEGFR-2阳性表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移以及临床分期关系密切。VEGFR-2表达的阳性率可能成为判断食管鳞癌的恶性程度及预测食管鳞癌发生侵袭转移的分子生物学标志物之一。根据生存分析结果，我们认为：在维吾尔族食管鳞癌患者VEGFR-2阴性表达组5年生存率明显高于维吾尔食管鳞癌患者VEGFR-2阳性表达组；VEGFR-2阳性表达、淋巴结转移、肿瘤分期是影响维吾尔族食管鳞癌的重要因素，均具有独立的预后意义，这表明VEGFR-2不仅参与了食管鳞癌血管的生成，对食管鳞癌的进展起促进作用，而且与食管鳞癌的预后同样密切相关。
本次研究中总的食管癌样本量相对不足，由于手术切除的癌旁组织大部分达不到要求导致癌旁组织缺失，这些因素可能对研究结果产生一定的偏移。总之本研究显示：VEGFR-2与维吾尔族食管鳞癌的临床病理参数密切相关，VEGFR-2可能和其它指标结合起来，对维吾尔族食管鳞癌的临床论断、转移风险及预后提供支持依据。
