引用本文： 尹迎春, 王新美, 李良, 韩红梅, 张保华, 梁霄, 侯震波, 孟云霄. 非小细胞肺癌胸腔积液细胞蜡块检测EGFR与K-ras基因突变和EML4-ALK融合基因及其临床病理特征. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(9): 870-874. doi: 10.7507/1007-4848.20150217 复制
晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 的治疗已进入个体化靶向治疗的时代，分子标志物指导下的治疗已经成为当今研究的热点[1-2]。有研究显示，NSCLC患者表皮生长因子受体（epid-ermal growth factor receptor，EGFR）基因突变在所有相关基因改变中所占比例最大[3-4]，同时因为进行EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治疗，推荐每例NSCLC患者进行EGFR基因突变检测[5]。K-ras及EML4-ALK融合基因是新近发现的NSCLC另一种较为常见的分子亚型。针对K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因的靶向抑制剂厄洛替尼及克唑替尼已经广泛应用于NSCLC临床治疗。目前，EGFR、K-ras和ALK基因突变检测主要采用手术切除的肿瘤组织标本。但大约75%的NSCLC患者诊断时已为晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[6]，可能无法获得手术及组织学标本，细胞学标本可能是唯一可以用于病理诊断及检测基因改变的标本。临床上NSCLC细胞学标本包括胸腔积液（pleural effusion，PLE）、穿刺细胞学悬液、支气管肺泡灌洗液、痰液和脑转移后脑脊液等[7]。因此，探索新的检测通路势在必行。本研究中，我们通过对患者行胸腔穿刺方法获得胸腔积液细胞学标本，探讨采用细胞学标本检测EGFR、K-ras基因突变和EML4-ALK融合基因情况，为NSCLC患者个体化治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2012年1月至2014年6月淄博市中心医院住院268例肺癌患者的胸腔积液标本，患者年龄53.6 （31～76） 岁；其中男165例、女103例。
1.2 方法
1.2.1 胸腔积液细胞蜡块的制备
送检细胞学样本常规涂片完成后，取装胸腔积液容器底部液体20 ml，离心半径10 cm，2 000 r/min离心5 min。弃去上清液，加鸡蛋清1 ml，轻轻振荡离心管底部的细胞，尽量使细胞成团悬浮于蛋清中，2 000 r/min离心5 min，去除多余鸡蛋清，此时只剩下蛋清包裹的细胞沉渣，取出用擦镜纸包好，4%甲醛溶液固定，随常规活组织检查标本脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋、切片、60 ℃烤片备用。
1.2.2 免疫组织化学染色方法
每例样本的细胞蜡块切片同时进行CK7、TTF-1、Calretinin、P63、Syn、CgA、CD56、Ki-67等8项免疫组织化学染色，二抗试剂盒为Dako Envision通用多聚物酶标检测系统。染色采用Lab Vision公司生产的Labvision Autostainer 720型自动免疫组织化学染色，采用Envision法，处理过程与一般的组织学检查相同。阳性结果的判断严格按照组织学检测相同的定位、定性要求进行。
1.2.3 EGFR、K-ras及EML4-ALK基因检测
EGFR和K-ras基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）及EML4-ALK融合基因检测试剂盒（荧光PCR法），均选用厦门艾德生物医药科技有限公司产品。本组中有76例的细胞蜡块样本进行EGFR、K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因的检测。按照说明书每份标本分别提取 DNA后用PCR方法检测EGFR和K-ras基因突变，提取RNA后进行逆转录得到cDNA用PCR方法检测EML4-ALK融合基因。每次实验中，每份样本和阳性对照、阴性对照共同进行分析。
1.3 统计学分析
应用SPSS 17.0统计软件分析，计数资料比较采用四格表χ2检验及四格表校正χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果及组织学分型
胸腔积液脱落细胞离心沉淀后用鸡蛋清凝集成团收集的细胞数量多，经4%甲醛溶液固定后能像组织块一样进行脱水、包埋、切片。HE染色显示细胞数目多，排列结构在切片中比常规胸腔积液细胞学涂片完整，核浆对比清晰、染色鲜艳。可见异型细胞染色质粗、散在或成团分布，见图 1。免疫细胞化学染色显示背景干净，对比度好，阳性细胞数多，阳性信号定位准确，见图 2。甲状腺转录因子1 (thyriod transcription factor 1，TTF-1) 和CK7为肺腺癌指标，p63为鳞癌诊断指标，Calretinin、P63为间皮细胞的诊断指标，Syn、CgA、CD56为神经内分泌肿瘤的指标。结合细胞形态及免疫组织化学结果，268例患者诊断为腺癌48例，鳞状细胞癌45例，神经内分泌肿瘤3例，其他病例172例。因为患者大量胸腔积液，肺部肿瘤巨大或者肿瘤位于特殊部位无法手术。胸腔穿刺，细胞蜡块的制作，保存了有限的肿瘤细胞，为基因检测提供了足够的细胞，提高了恶性肿瘤的阳性检出率，保证了正确的组织学分型和基因分子检测的成功率。
图1
胸腔积液肺癌细胞蜡块标本成团腺癌细胞，排列成团或者聚集成腺管状 HE染色 ×400 图 2 CK7染色阳性免疫组织化学Envision二步法×400
2.2 标本DNA提取及质量控制
93例NSCLC标本，有17例标本DNA和/或RNA提取纯度低而被舍去。细胞学标本提取DNA和/或RNA的满意率为81.72% （76/93）。76例NSCLC包括39例腺癌和37例鳞状细胞癌，均被用于基因检测。同时对这76例患者给予肺部肿瘤穿刺，对穿刺的组织学标本同时进行PCR检测EGFR、K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因。
2.3 EGFR基因突变与患者临床病理因素的关系
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，EGFR基因突变26例，突变率为34.21% （26/76），一致率100%。EGFR基因突变与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。
表1
EGFR基因突变和NSCLC患者76例的临床特征[例（%）]
2.4 K-ras基因突变情况
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，K-ras基因突变5例，突变率为6.58% （5/76），一致率100%。K-ras基因突变与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。
表2
K-ras基因突变和NSCLC患者76例的临床特征[例（%）]
2.5 EML4-ALK融合基因情况
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，EML4-ALK融合基因6例，阳性率为7.89% （6/76），一致率100%。EML4-ALK融合基因阳性率与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义(P＜0.05) ，见表 3。
表3
EML4-ALK基因融合和NSCLC患者76例的临床特征[例(%)]
3 讨论
细胞学样本制作细胞蜡块技术在国内已经成熟，细胞蜡块具有细胞集中、可重复制片、背景清楚等特点是常规涂片所不具备的，在常规涂片制作完成后剩余样本制作细胞蜡块已经成为共识[8]，本组样本结果提示细胞蜡块结合常规涂片及免疫组织化学染色，可使利用制作成功的细胞蜡块细胞学样本做出正确的组织学分型的比例接近90%，对NSCLC的进一步成功分型的比例也达85%，与国外的文献报道接近[9-10]。因此在实际工作中要尽量利用少量宝贵的剩余样本制作细胞蜡块，在常规涂片的基础上，细胞蜡块结合免疫组织化学染色可以最大限度做出正确的组织学分型。
肺癌细胞学样本在组织学分型及分子检测实际工作中主要的问题是样本本身质量和肿瘤细胞数量的不确定性，我们的经验是所有细胞学样本细胞蜡块制作成功率在70%～90%，必须指出少数样本虽然细胞蜡块制作成功，由于肿瘤细胞数量过少仍无法进一步进行免疫组织化学和分子学检测。实时荧光定量RT-PCR操作简便、快速，敏感性高，并同时能明确EGFR、ALK及K-ras基因突变的位点，但需要特定的试剂盒和仪器，目前已经有获得FDA批准用于临床检测的RT-PCR商业化试剂盒。
化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而临床上多凭经验给药，而公式化治疗往往具有盲目性而造成多药耐药，不良反应大，疗效不佳[11]。目前，基于分子靶点的个体化治疗，针对EGFR、K-ras和EML4-ALK融合基因的靶向治疗已使NSCLC的治疗有了跨时代的进步。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通过与EGFR结构域中高度保守的ATP结合位点竞争性结合EGFR，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移和血管生成，促进肿瘤细胞的凋亡[12]。有研究显示，EGFR第18～21外显子和K-ras第12或第13密码子的突变与EGFR-TKIs的疗效有关，且EGFR基因在肺腺癌中的突变率明显高于其他病理类型的肺癌[13]。因此，准确检测肺癌患者中EGFR和K-ras基因的突变状态，有助于筛选出适合EGFR-TKIs治疗的人群。
EGFR在我国NSCLC中的突变率明可达40%左右[14]。本研究中，检测76例NSCLC患者细胞学标本中EGFR及K-ras基因突变，突变率分别为34.21%及6.58%，与文献报道亚裔肺癌患者组织中K-ras基因突变率（4.7%～13.0%）相符[15]。但有关研究显示，欧美NSCLC患者组织标本中K-ras突变率为20%～30%，其中腺癌突变率（20%～40%）明显高于亚裔NSCLC患者，可能与种族相关[16-17]。本研究中，K-ras与EGFR基因突变未发生在同一患者中。有研究表明，K-ras与EGFR基因突变几乎从不同时发生于同一NSCLC患者中，提示在肺癌的发生中K-ras与EGFR基因突变相互排斥[16]。
人们曾经认为EGFR的突变与EML4-ALK融合基因在同一个病例中是互相排斥的[18]，但近年来随着EGFR及EML4-ALK检测的推广、检测人群的增加，发现了存在EGFR与ALK双突变的人群，并且发现这些患者可能会对EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的疗效[19]。对于病理科而言，EGFR与ALK的检测对指导临床靶向治疗有重要意义。ALK融合基因阳性的晚期NSCLC患者可进行克唑替尼治疗[20-21]。
本研究中的76例患者同时进行了PCR检测了EGFR、K-ras基因突变及AML4-ALK融合基因，其阳性率分别为34.21%、6.58%和7.89%，EGFR与ALK融合基因的临床特征明显存在于腺癌、不吸烟、年轻患者的肿瘤样本中，与文献相吻合[22-23]。ALK融合基因阳性（简称ALK阳性）的NSCLC约占NSCLC的7%，主要出现在不吸烟的肺腺癌患者中，且通常与EGFR基因突变不同时存在于同一患者。不吸烟而EGFR未突变的肺腺癌患者的ALK阳性率可达25%～30%；我国EGFR、K-ras均为野生型的腺癌中ALK阳性率高达30%～42%[24]。
对于晚期肺癌患者无法获得肿瘤手术组织，利用胸腔积液的脱落细胞制成细胞蜡块检测EGFR、ALK及K-ras基因突变可以为更多的患者带来治疗机会。EGFR、K-ras和ALK这三个靶点的发现和相关药物的发展，使NSCLC的治疗进入了基于分子靶点的个体化治疗时代。在NSCLC个体化治疗的发展中具有里程碑式的意义[25-26]。
晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 的治疗已进入个体化靶向治疗的时代，分子标志物指导下的治疗已经成为当今研究的热点[1-2]。有研究显示，NSCLC患者表皮生长因子受体（epid-ermal growth factor receptor，EGFR）基因突变在所有相关基因改变中所占比例最大[3-4]，同时因为进行EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治疗，推荐每例NSCLC患者进行EGFR基因突变检测[5]。K-ras及EML4-ALK融合基因是新近发现的NSCLC另一种较为常见的分子亚型。针对K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因的靶向抑制剂厄洛替尼及克唑替尼已经广泛应用于NSCLC临床治疗。目前，EGFR、K-ras和ALK基因突变检测主要采用手术切除的肿瘤组织标本。但大约75%的NSCLC患者诊断时已为晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[6]，可能无法获得手术及组织学标本，细胞学标本可能是唯一可以用于病理诊断及检测基因改变的标本。临床上NSCLC细胞学标本包括胸腔积液（pleural effusion，PLE）、穿刺细胞学悬液、支气管肺泡灌洗液、痰液和脑转移后脑脊液等[7]。因此，探索新的检测通路势在必行。本研究中，我们通过对患者行胸腔穿刺方法获得胸腔积液细胞学标本，探讨采用细胞学标本检测EGFR、K-ras基因突变和EML4-ALK融合基因情况，为NSCLC患者个体化治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2012年1月至2014年6月淄博市中心医院住院268例肺癌患者的胸腔积液标本，患者年龄53.6 （31～76） 岁；其中男165例、女103例。
1.2 方法
1.2.1 胸腔积液细胞蜡块的制备
送检细胞学样本常规涂片完成后，取装胸腔积液容器底部液体20 ml，离心半径10 cm，2 000 r/min离心5 min。弃去上清液，加鸡蛋清1 ml，轻轻振荡离心管底部的细胞，尽量使细胞成团悬浮于蛋清中，2 000 r/min离心5 min，去除多余鸡蛋清，此时只剩下蛋清包裹的细胞沉渣，取出用擦镜纸包好，4%甲醛溶液固定，随常规活组织检查标本脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋、切片、60 ℃烤片备用。
1.2.2 免疫组织化学染色方法
每例样本的细胞蜡块切片同时进行CK7、TTF-1、Calretinin、P63、Syn、CgA、CD56、Ki-67等8项免疫组织化学染色，二抗试剂盒为Dako Envision通用多聚物酶标检测系统。染色采用Lab Vision公司生产的Labvision Autostainer 720型自动免疫组织化学染色，采用Envision法，处理过程与一般的组织学检查相同。阳性结果的判断严格按照组织学检测相同的定位、定性要求进行。
1.2.3 EGFR、K-ras及EML4-ALK基因检测
EGFR和K-ras基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）及EML4-ALK融合基因检测试剂盒（荧光PCR法），均选用厦门艾德生物医药科技有限公司产品。本组中有76例的细胞蜡块样本进行EGFR、K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因的检测。按照说明书每份标本分别提取 DNA后用PCR方法检测EGFR和K-ras基因突变，提取RNA后进行逆转录得到cDNA用PCR方法检测EML4-ALK融合基因。每次实验中，每份样本和阳性对照、阴性对照共同进行分析。
1.3 统计学分析
应用SPSS 17.0统计软件分析，计数资料比较采用四格表χ2检验及四格表校正χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果及组织学分型
胸腔积液脱落细胞离心沉淀后用鸡蛋清凝集成团收集的细胞数量多，经4%甲醛溶液固定后能像组织块一样进行脱水、包埋、切片。HE染色显示细胞数目多，排列结构在切片中比常规胸腔积液细胞学涂片完整，核浆对比清晰、染色鲜艳。可见异型细胞染色质粗、散在或成团分布，见图 1。免疫细胞化学染色显示背景干净，对比度好，阳性细胞数多，阳性信号定位准确，见图 2。甲状腺转录因子1 (thyriod transcription factor 1，TTF-1) 和CK7为肺腺癌指标，p63为鳞癌诊断指标，Calretinin、P63为间皮细胞的诊断指标，Syn、CgA、CD56为神经内分泌肿瘤的指标。结合细胞形态及免疫组织化学结果，268例患者诊断为腺癌48例，鳞状细胞癌45例，神经内分泌肿瘤3例，其他病例172例。因为患者大量胸腔积液，肺部肿瘤巨大或者肿瘤位于特殊部位无法手术。胸腔穿刺，细胞蜡块的制作，保存了有限的肿瘤细胞，为基因检测提供了足够的细胞，提高了恶性肿瘤的阳性检出率，保证了正确的组织学分型和基因分子检测的成功率。
图1
胸腔积液肺癌细胞蜡块标本成团腺癌细胞，排列成团或者聚集成腺管状 HE染色 ×400 图 2 CK7染色阳性免疫组织化学Envision二步法×400
2.2 标本DNA提取及质量控制
93例NSCLC标本，有17例标本DNA和/或RNA提取纯度低而被舍去。细胞学标本提取DNA和/或RNA的满意率为81.72% （76/93）。76例NSCLC包括39例腺癌和37例鳞状细胞癌，均被用于基因检测。同时对这76例患者给予肺部肿瘤穿刺，对穿刺的组织学标本同时进行PCR检测EGFR、K-ras基因突变及EML4-ALK融合基因。
2.3 EGFR基因突变与患者临床病理因素的关系
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，EGFR基因突变26例，突变率为34.21% （26/76），一致率100%。EGFR基因突变与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。
表1
EGFR基因突变和NSCLC患者76例的临床特征[例（%）]
2.4 K-ras基因突变情况
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，K-ras基因突变5例，突变率为6.58% （5/76），一致率100%。K-ras基因突变与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。
表2
K-ras基因突变和NSCLC患者76例的临床特征[例（%）]
2.5 EML4-ALK融合基因情况
76例NSCLC患者细胞学标本及组织学标本PCR结果均显示，EML4-ALK融合基因6例，阳性率为7.89% （6/76），一致率100%。EML4-ALK融合基因阳性率与患者年龄、性别、吸烟及肿瘤组织学类型有关，其差异有统计学意义(P＜0.05) ，见表 3。
表3
EML4-ALK基因融合和NSCLC患者76例的临床特征[例(%)]
3 讨论
细胞学样本制作细胞蜡块技术在国内已经成熟，细胞蜡块具有细胞集中、可重复制片、背景清楚等特点是常规涂片所不具备的，在常规涂片制作完成后剩余样本制作细胞蜡块已经成为共识[8]，本组样本结果提示细胞蜡块结合常规涂片及免疫组织化学染色，可使利用制作成功的细胞蜡块细胞学样本做出正确的组织学分型的比例接近90%，对NSCLC的进一步成功分型的比例也达85%，与国外的文献报道接近[9-10]。因此在实际工作中要尽量利用少量宝贵的剩余样本制作细胞蜡块，在常规涂片的基础上，细胞蜡块结合免疫组织化学染色可以最大限度做出正确的组织学分型。
肺癌细胞学样本在组织学分型及分子检测实际工作中主要的问题是样本本身质量和肿瘤细胞数量的不确定性，我们的经验是所有细胞学样本细胞蜡块制作成功率在70%～90%，必须指出少数样本虽然细胞蜡块制作成功，由于肿瘤细胞数量过少仍无法进一步进行免疫组织化学和分子学检测。实时荧光定量RT-PCR操作简便、快速，敏感性高，并同时能明确EGFR、ALK及K-ras基因突变的位点，但需要特定的试剂盒和仪器，目前已经有获得FDA批准用于临床检测的RT-PCR商业化试剂盒。
化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而临床上多凭经验给药，而公式化治疗往往具有盲目性而造成多药耐药，不良反应大，疗效不佳[11]。目前，基于分子靶点的个体化治疗，针对EGFR、K-ras和EML4-ALK融合基因的靶向治疗已使NSCLC的治疗有了跨时代的进步。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通过与EGFR结构域中高度保守的ATP结合位点竞争性结合EGFR，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移和血管生成，促进肿瘤细胞的凋亡[12]。有研究显示，EGFR第18～21外显子和K-ras第12或第13密码子的突变与EGFR-TKIs的疗效有关，且EGFR基因在肺腺癌中的突变率明显高于其他病理类型的肺癌[13]。因此，准确检测肺癌患者中EGFR和K-ras基因的突变状态，有助于筛选出适合EGFR-TKIs治疗的人群。
EGFR在我国NSCLC中的突变率明可达40%左右[14]。本研究中，检测76例NSCLC患者细胞学标本中EGFR及K-ras基因突变，突变率分别为34.21%及6.58%，与文献报道亚裔肺癌患者组织中K-ras基因突变率（4.7%～13.0%）相符[15]。但有关研究显示，欧美NSCLC患者组织标本中K-ras突变率为20%～30%，其中腺癌突变率（20%～40%）明显高于亚裔NSCLC患者，可能与种族相关[16-17]。本研究中，K-ras与EGFR基因突变未发生在同一患者中。有研究表明，K-ras与EGFR基因突变几乎从不同时发生于同一NSCLC患者中，提示在肺癌的发生中K-ras与EGFR基因突变相互排斥[16]。
人们曾经认为EGFR的突变与EML4-ALK融合基因在同一个病例中是互相排斥的[18]，但近年来随着EGFR及EML4-ALK检测的推广、检测人群的增加，发现了存在EGFR与ALK双突变的人群，并且发现这些患者可能会对EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的疗效[19]。对于病理科而言，EGFR与ALK的检测对指导临床靶向治疗有重要意义。ALK融合基因阳性的晚期NSCLC患者可进行克唑替尼治疗[20-21]。
本研究中的76例患者同时进行了PCR检测了EGFR、K-ras基因突变及AML4-ALK融合基因，其阳性率分别为34.21%、6.58%和7.89%，EGFR与ALK融合基因的临床特征明显存在于腺癌、不吸烟、年轻患者的肿瘤样本中，与文献相吻合[22-23]。ALK融合基因阳性（简称ALK阳性）的NSCLC约占NSCLC的7%，主要出现在不吸烟的肺腺癌患者中，且通常与EGFR基因突变不同时存在于同一患者。不吸烟而EGFR未突变的肺腺癌患者的ALK阳性率可达25%～30%；我国EGFR、K-ras均为野生型的腺癌中ALK阳性率高达30%～42%[24]。
对于晚期肺癌患者无法获得肿瘤手术组织，利用胸腔积液的脱落细胞制成细胞蜡块检测EGFR、ALK及K-ras基因突变可以为更多的患者带来治疗机会。EGFR、K-ras和ALK这三个靶点的发现和相关药物的发展，使NSCLC的治疗进入了基于分子靶点的个体化治疗时代。在NSCLC个体化治疗的发展中具有里程碑式的意义[25-26]。
