引用本文： 王小勇, 廖斌, 于海清, 刘高华, 李多, 肖琳琳, 唐小军. 肿瘤特异性结核抗原Ag85A基因慢病毒表达载体构建. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(11): 1050-1055. doi: 10.7507/1007-4848.20150260 复制
免疫基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域、也是最值得期待的肿瘤治疗新方法之一。引进外源性抗原基因、使其在肿瘤细胞中表达，从而激活宿主免疫系统，对肿瘤细胞产生免疫应答，是肿瘤免疫基因治疗的重要策略[1-2]。目前，来自于一些细菌的抗原基因是肿瘤免疫基因治疗研究中最常用的目的基因，如结核杆菌的Ag85抗原复合物、金黄色葡萄球菌肠毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）、金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）等，国内外多项研究证实了这种治疗方法的可能行和美好前景[3-5]。然而，这些外源性抗原基因的表达，必须局限在肿瘤细胞，才能避免产生广泛、过度的免疫反应而导致严重毒副作用。也就是说，基因治疗效应必须具有肿瘤靶向性。实现肿瘤基因治疗的靶向性，有两条途径：一是目的基因靶向性转导，二是目的基因靶向性表达。用肿瘤特异性启动子对基因转录进行调控，使其只在肿瘤细胞中表达，是实现目的基因靶向性表达的主要方法[6]。端粒酶催化亚单位（telomerase catalytic subunit，TERT）启动子具有肿瘤特异性高、转录活性强和适用范围广的特点，是近年来肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最为广泛的基因表达调控元件。已有研究表明，TERT启动子能驱动多种治疗基因，在肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞中表达，获得对这些肿瘤细胞选择性杀伤[7-9]。本研究克隆了小鼠的TERT启动子，研究了它在小鼠肺癌细胞、小鼠正常细胞，人肺癌细胞、食管癌细胞以及人正常细胞中的转录活性，并构建了以小鼠TERT启动子作为基因转录调控元件的结核杆菌Ag85A基因慢病毒载体，为进一步的肿瘤靶向性免疫基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株
小鼠Lewis肺癌细胞株、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人肺腺癌细胞株A549、人食管癌细胞株EC-109和正常人胚肺成纤维细MRC-5，均购自中国典型培养物保藏中心。用含10%小牛血清（Hyclone公司产品）的dulbecco´s modified eagle medium（DMEM）培养基（Gibco公司产品），于5%CO2，37℃细胞培养箱中培养。
1.1.2 细菌和质粒
大肠杆菌DH5a为本实验室保存，无启动子的荧光素酶报告质粒pGL3- Basic、含SV40启动子的荧光素酶报告质粒pGL3-promoter、含巨细胞病毒（Cytomegalo virus，CMV）启动子和海肾荧光素酶的内对照质粒pRL-CMV 均为Promeaga产品，由四川大学华西医院肿瘤分子诊断研究室王艳萍教授惠赠，慢病毒载体质粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro购自上海生博公司。
1.1.3 主要试剂和仪器
基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自碧云天公司；限制性内切酶，LA-Taq DNA 聚合酶、GC Buffer及DNA连接试剂盒购自Takara公司；荧光素酶检测试剂盒Dual-Glo Luciferase Assy System 购自Promega公司，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工有限公司合成。脂质体lipofectamine2000购自Invitrogen公司。PCR扩增仪为Thermo Hybaid公司PX2型；酶标仪550型、凝胶成像分析仪Gen Doc 2000型为Bio-Rad公司产品，化学发光1420 VICTOR2TM平板读数器为芬兰Wallac 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠TERT启动子（PmTERT）的克隆及其在不同细胞中转录活性的检测
以小鼠Lewis肺癌细胞提取的基因组DNA为模板，PCR 扩增小鼠TERT 启动子片段PmTERT。PCR引物序列为：上游引物 5´- AAA ACG CGT aaa gga agc ccg aga agc at-3，下游引物 5´- AAA AGA TCT TGT GCT CAA GGC CGG GAT-3，5'端分别设计有限制性内切酶Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点（下划线标记）。然后将PCR扩增获得的PmTERT 插入到无启动子的荧光素酶表达载体pGL3-Basic多克隆位点的Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之间，构建PmTERT 驱动的荧光素酶报告质粒pGL3-PmTERT，将连接反应液转化感受态细胞DH5α，在含100 mg/L的氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选，挑取阳性菌落作菌落PCR进行验证，正向引物序列为：5´- CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-，反向引物序列为：5´- CCT TAT GCA GTT GCT CTC C-，该引物位于多克隆位点的下游luciferase基因中，阳性克隆应得到553 bp的片段，阴性克隆应得到231 bp的片段。接种阳性克隆保种，分装100 μl送测序，测序完全正确的克隆，再接种，用质粒小抽试剂盒抽提质粒，所获得的质粒就是pGL3-PmTERT ，用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切再次验证。
1.2.2 PmTERT 在不同细胞中转录活性的检测
将细胞按70%的汇合度接种到24孔板，24 h后用脂质体Lipofectamine 2000分别将待测质粒（pGL3-Basic、pGL3-promoter和pGL3-PmTERT）与内对照质粒pRL-CMV共转染各种细胞。48 h后，弃去培养基，用200 μl 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗1遍，吸尽PBS，每孔加100 μl Passive Lysis Buffer（PLB）裂解液，摇床常温条件下摇15 min，进行裂解，反复吹吸后将裂解好的细胞和PLB并收到无菌EP管，12 000×g，15 s，4℃ 离心后，将上清液吸到另一个无菌EP管中，放到冰里，黑色不透光的96孔板中每孔加50 μl预先混好的LAR Ⅱ，每孔加上清液5 μl，用化学发光仪中检测萤火虫荧光索酶（firefly luciferase）活性，然后每孔加Stop & Glo试剂，混匀，l0 min后检测海肾荧光紊酶(Renilla Luciferase)活性，每组重复4孔，每孔细胞Firefly luciferase的数据除以Renilla luciferase的数据，为转染质粒细胞Luciferase的相对活性。以阳性对照质粒pGL3-promoter组细胞的Luciferase相对活性为1，以pGL3-PmTERT与pGL3-promoter组细胞Luciferase相对活性比值作为评价PmTERT在相应细胞中转录活性的指标，本实验重复3次，取3次实验的平均值作为最终结果。
1.2.3 Ag85A基因慢病毒载体的构建及鉴定
1.2.3.1 CMV启动子驱动的Ag85A基因慢病毒载体pLVx-Ag85A-CMV构建及鉴定
用EcoR和Xba Ⅰ内切酶将慢病毒载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的EGFP-3FLAG片段（810 bp）切掉，电泳回收长约8.1 kb的载体片段；并与EcoR和Xba Ⅰ双酶切的Ag85基因作连接，将连接反应液转化感受态细胞DH5α，在100 mg/L的氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选，挑取阳性菌落作菌落PCR，正向测序引物序列为：5´- CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-，反向引物序列为5´-CAG CGG GGC TGC TAA AGC GCA TGC-，阳性克隆应得到1 307 bp条带，阴性克隆得到1 056 bp条带。接种阳性克隆保种，分装100 μl送测序，测序完全正确的克隆，再接种，用质粒小抽试剂盒抽提质粒，所获质粒就是pLVX-Ag85A-CMV慢病毒载体，-20℃保存备用。
1.2.3.2 PmTERT驱动的Ag85A基因慢病毒载体pLVX-Ag85A-PmTERT构建及鉴定
用Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ切去pLVX-Ag85A-CMV慢病毒载体的CMV启动子片段，插入PmTERT就获得pLVX-Ag85A-PmTERT慢病毒载体。载体重组、筛选和鉴定与1.2.3.1相同。
1.2.4 Western
blot鉴定重组慢病毒质粒pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A- PmTERT
1.2.4.1 质粒转染及细胞总蛋白质提取
转染前一天在六孔板中分别接种小鼠Lewis肺癌细胞和小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞（1×105/孔），24 h后用脂质体分别将重组慢病毒载体pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT转染上述细胞，6 h后，用新鲜培养基更换转染液，继续培养3 d后，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度后，-80℃深低温冰箱保存备用。
1.2.4.2 Western
blot实验每个蛋白样品取40 μg，体积用上样缓冲液补至30 μl，100℃水浴5 min后，置4℃存放备用。蛋白样品加在SDS-PAGE胶上电泳后，电转至硝酸纤维素膜（NC膜）上，经5%脱脂牛奶加Tween的Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）室温封闭1 h，分别与一抗和二抗孵育后，显色。
2 结果
2.1 重组质粒pGL3-PmTERT鉴定结果
DNA测序显示，重组质粒的多克隆位点Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之间有与Genebank中小鼠TERT启动子序列完全一致DNA片段；Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切获得与预期相似的两条DNA条带（图 1）。
图1
重组质粒pGL3-PmTERT的Mlu I和Xho I双酶切鉴定结果
2.2 PmTERT在小鼠及人肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性
PmTERT 在小鼠Lewis肺癌细胞中的转录活性为阳性对照的CMV启动子的1.72倍，PmTERT在小鼠成纤维细胞NIH3T3中无转录活性；PmTERT在在人肺腺癌细胞A549和人食管癌细胞EC-109有转录活性，与阳性对照的CMV启动子活性的比值分别为0.71和0.23，PmTERT在人胚肾成纤维细胞MRC-5细胞中无转录活性（图 2）。
图2
转染pGL3-Basic、pGL3-PmTERT和pGL3-promoter的不同细胞Luciferase活性检测结果
2.3 重组慢病毒载体的鉴定
2.3.1 pLVX-Ag85A-CMV菌落PCR实验结果
所挑取的8个重组质粒转化的阳性菌落，PCR有5个获得预期大小一致的DNA片段图(3)；阳性克隆测序结果表明，和预期的序列完全一致。
图3
菌落PCR结果
注：1为空白对照（蒸馏水为模板）；2为阴性对照（空载体为模板）；3为NA Marker：由大至小分别为2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11为挑取的8个转化子
2.3.2 pLVX-Ag85A-PmTERT菌落PCR实验结果
所挑取的8个重组质粒转化的阳性菌落，PCR均获得与预期大小一致的DNA片段（图 4）。重组质粒pLVX-Ag85A-PmTERT的多克隆位点Mlu和EcoR Ⅰ 之间有与Genebank中小鼠TERT启动子序列完全一致DNA片段。
图4
菌落PCR结果
注： 1为空白对照（蒸馏水为模板）；2为阴性对照（空载体为模板）；3为DNA Marker：由大至小分别为2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11为挑取的8个转化子
2.4 Western blot鉴定结果
用pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT两种慢病毒载体分别感染NIH3T3及Lewis肺癌细胞。结果显示，感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis细胞和NIH3T3细胞均有Ag85A蛋白表达，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的Lewis细胞有Ag85A表达，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3细胞无g85A表达（图 5）。
图5
Western blot检测Ag85A表达
注：1为阴性对照（感染空病毒载体的Lewis细胞）； 2、3为感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3细胞和Lewis细胞；4、5为感染pLVX-Ag85A-CMV的NIH3T3细胞和Lewis细胞
3 讨论
抗原85复合体（Ag85）是存在于各种分枝杆菌中的分泌性蛋白，由A、B、C 三个组分构成，具有分枝菌酸转移酶活性，在分枝杆菌细胞壁合成中有重要作用。已有的研究显示，Ag85复合物具有较强细胞及体液免疫活性，其中以Ag85A的免疫活性最强，能诱导T细胞增殖、刺激机体产生大量的INF-γ和IL-2 [10-11]。从上世纪90年代中后期开始，有研究者将Ag85A及其他结核杆菌抗原基因用于构建预防结核的新型疫苗，取得引人注目的成果[12-13]。近年来，Ag85A基因也被尝试用于肿瘤基因治疗。Zlotta 等[14]的研究显示，曾经患过结核病的膀胱癌患者体内存在能识别Ag85A蛋白的记忆免疫细胞，膀胱腔内灌注卡介苗后Ag85A进入体内可以激活这些记忆细胞，产生强烈免疫反应。Tarrant等[15]用Ag85A基因转染黑色素瘤细胞B16-F10，发现转基因细胞在小鼠体内的成瘤性显著降低，病理检查显示在肿瘤组织中有大量炎性白细胞浸润。Lee等[16]分别构建了结核杆菌Ag85A、Ag85B、Mpt64、PstS3与ESAT6融合基因的表达载体，这些重组载体与IL-12共同应用，能显著抑制膀胱癌细胞MBT-2在小鼠体内的生长。在本研究中，我们也构建了CMV启动子驱动的Ag85A的慢病毒表达载体pLVX-Ag85A-CMV，将其转染小鼠Lewis肺癌细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3，用Western blot方法均检测到Ag85A表达。
在基因治疗中，如果引入的目的基因在机体内无差别的表达，就可能使正常细胞受到基因治疗效应的损伤，从而发生严重的不良反应。用肿瘤特异性启动子对治疗基因进行转录调控，使其表达局限在肿瘤细胞，是实现肿瘤基因治疗肿瘤靶向性的有效方法之一。一些肿瘤标志物基因启动子，如甲胎球蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）启动子以及端粒酶催化亚单位（TERT）启动子都可以用于肿瘤靶向性基因治疗的研究[17-19]。端粒酶（telomerase）是一种广谱肿瘤标志物，在85% 以上的肿瘤细胞中呈现阳性表达，而在正常细胞中，除了生殖细胞和某些干细胞以外，几乎均无表达[20]。因此TERT启动子转录具有高度的肿瘤特异性，是近年来肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最为广泛的基因转录元件[21-22]。在以往的研究中，我们克隆了人TERT启动子序列，发现它在多种肺癌细胞中具有转录活性，其调控的自杀基因HSV-TK/GCV治疗系统能够特异性抑制肺癌细胞A549的体外增殖和在裸鼠体内的生长[23-24]。由于小鼠是肿瘤基因治疗研究中最常使用的实验动物，小鼠TERT启动子（PmTERT）转录活性的研究具有重要意义。Si等[25]克隆了不同长度的PmTERT片段，并检测了这些PmTERT在不同细胞中的转录活性。研究显示，PmTERT的核心区域位于ATG位点上游333 bp内。本研究中，我们克隆了ATG上游331 bp大小的PmTERT片段，Luciferase实验显示，PmTERT在小鼠Lewis肺癌细胞中具有良好的转录活性，其活性还稍强于阳性对照SV40启动子，而在小鼠成纤维细胞NIH3T3中无明显转录活性。由于在人类肿瘤研究中，常常将人类肿瘤细胞移植到实验动物体内，建立各种肿瘤动物模型。因此，有必要明确TERT启动子在不同种属的细胞中，是否有相似的转录特性。Arendt等[26]的研究显示，人TERT启动子在人和犬的肿瘤细胞中有相似的转录活性。本研究显示，PmTERT在人肺腺癌细胞A549和人食管癌细胞EC-109中也有转录活性，但活性明显低于PmTERT在Lewis细胞中的转录活性；PmTERT在人类成纤维细胞MRC-5中无明显转录活性。上述结果提示，PmTERT在人细胞中也具有肿瘤特异性的转录活性。在本研究中，我们还用PmTERT代替CMV启动子，构建了PmTERT驱动的肿瘤特异性Ag85A慢病毒载体pLVX-Ag85A-PmTERT，发现转染pLVX-Ag85A-PmTERT的小鼠Lewis肺癌细胞有Ag85A表达，而转染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3小鼠成纤维细胞无Ag85A表达，提示以PmTERT驱动的Ag85A基因可以在小鼠肺癌细胞中选择性表达，这为肺癌的靶向性免疫基因治疗的深入研究奠定了基础。
免疫基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域、也是最值得期待的肿瘤治疗新方法之一。引进外源性抗原基因、使其在肿瘤细胞中表达，从而激活宿主免疫系统，对肿瘤细胞产生免疫应答，是肿瘤免疫基因治疗的重要策略[1-2]。目前，来自于一些细菌的抗原基因是肿瘤免疫基因治疗研究中最常用的目的基因，如结核杆菌的Ag85抗原复合物、金黄色葡萄球菌肠毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）、金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）等，国内外多项研究证实了这种治疗方法的可能行和美好前景[3-5]。然而，这些外源性抗原基因的表达，必须局限在肿瘤细胞，才能避免产生广泛、过度的免疫反应而导致严重毒副作用。也就是说，基因治疗效应必须具有肿瘤靶向性。实现肿瘤基因治疗的靶向性，有两条途径：一是目的基因靶向性转导，二是目的基因靶向性表达。用肿瘤特异性启动子对基因转录进行调控，使其只在肿瘤细胞中表达，是实现目的基因靶向性表达的主要方法[6]。端粒酶催化亚单位（telomerase catalytic subunit，TERT）启动子具有肿瘤特异性高、转录活性强和适用范围广的特点，是近年来肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最为广泛的基因表达调控元件。已有研究表明，TERT启动子能驱动多种治疗基因，在肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞中表达，获得对这些肿瘤细胞选择性杀伤[7-9]。本研究克隆了小鼠的TERT启动子，研究了它在小鼠肺癌细胞、小鼠正常细胞，人肺癌细胞、食管癌细胞以及人正常细胞中的转录活性，并构建了以小鼠TERT启动子作为基因转录调控元件的结核杆菌Ag85A基因慢病毒载体，为进一步的肿瘤靶向性免疫基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株
小鼠Lewis肺癌细胞株、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人肺腺癌细胞株A549、人食管癌细胞株EC-109和正常人胚肺成纤维细MRC-5，均购自中国典型培养物保藏中心。用含10%小牛血清（Hyclone公司产品）的dulbecco´s modified eagle medium（DMEM）培养基（Gibco公司产品），于5%CO2，37℃细胞培养箱中培养。
1.1.2 细菌和质粒
大肠杆菌DH5a为本实验室保存，无启动子的荧光素酶报告质粒pGL3- Basic、含SV40启动子的荧光素酶报告质粒pGL3-promoter、含巨细胞病毒（Cytomegalo virus，CMV）启动子和海肾荧光素酶的内对照质粒pRL-CMV 均为Promeaga产品，由四川大学华西医院肿瘤分子诊断研究室王艳萍教授惠赠，慢病毒载体质粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro购自上海生博公司。
1.1.3 主要试剂和仪器
基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自碧云天公司；限制性内切酶，LA-Taq DNA 聚合酶、GC Buffer及DNA连接试剂盒购自Takara公司；荧光素酶检测试剂盒Dual-Glo Luciferase Assy System 购自Promega公司，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工有限公司合成。脂质体lipofectamine2000购自Invitrogen公司。PCR扩增仪为Thermo Hybaid公司PX2型；酶标仪550型、凝胶成像分析仪Gen Doc 2000型为Bio-Rad公司产品，化学发光1420 VICTOR2TM平板读数器为芬兰Wallac 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠TERT启动子（PmTERT）的克隆及其在不同细胞中转录活性的检测
以小鼠Lewis肺癌细胞提取的基因组DNA为模板，PCR 扩增小鼠TERT 启动子片段PmTERT。PCR引物序列为：上游引物 5´- AAA ACG CGT aaa gga agc ccg aga agc at-3，下游引物 5´- AAA AGA TCT TGT GCT CAA GGC CGG GAT-3，5'端分别设计有限制性内切酶Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点（下划线标记）。然后将PCR扩增获得的PmTERT 插入到无启动子的荧光素酶表达载体pGL3-Basic多克隆位点的Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之间，构建PmTERT 驱动的荧光素酶报告质粒pGL3-PmTERT，将连接反应液转化感受态细胞DH5α，在含100 mg/L的氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选，挑取阳性菌落作菌落PCR进行验证，正向引物序列为：5´- CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-，反向引物序列为：5´- CCT TAT GCA GTT GCT CTC C-，该引物位于多克隆位点的下游luciferase基因中，阳性克隆应得到553 bp的片段，阴性克隆应得到231 bp的片段。接种阳性克隆保种，分装100 μl送测序，测序完全正确的克隆，再接种，用质粒小抽试剂盒抽提质粒，所获得的质粒就是pGL3-PmTERT ，用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切再次验证。
1.2.2 PmTERT 在不同细胞中转录活性的检测
将细胞按70%的汇合度接种到24孔板，24 h后用脂质体Lipofectamine 2000分别将待测质粒（pGL3-Basic、pGL3-promoter和pGL3-PmTERT）与内对照质粒pRL-CMV共转染各种细胞。48 h后，弃去培养基，用200 μl 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗1遍，吸尽PBS，每孔加100 μl Passive Lysis Buffer（PLB）裂解液，摇床常温条件下摇15 min，进行裂解，反复吹吸后将裂解好的细胞和PLB并收到无菌EP管，12 000×g，15 s，4℃ 离心后，将上清液吸到另一个无菌EP管中，放到冰里，黑色不透光的96孔板中每孔加50 μl预先混好的LAR Ⅱ，每孔加上清液5 μl，用化学发光仪中检测萤火虫荧光索酶（firefly luciferase）活性，然后每孔加Stop & Glo试剂，混匀，l0 min后检测海肾荧光紊酶(Renilla Luciferase)活性，每组重复4孔，每孔细胞Firefly luciferase的数据除以Renilla luciferase的数据，为转染质粒细胞Luciferase的相对活性。以阳性对照质粒pGL3-promoter组细胞的Luciferase相对活性为1，以pGL3-PmTERT与pGL3-promoter组细胞Luciferase相对活性比值作为评价PmTERT在相应细胞中转录活性的指标，本实验重复3次，取3次实验的平均值作为最终结果。
1.2.3 Ag85A基因慢病毒载体的构建及鉴定
1.2.3.1 CMV启动子驱动的Ag85A基因慢病毒载体pLVx-Ag85A-CMV构建及鉴定
用EcoR和Xba Ⅰ内切酶将慢病毒载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的EGFP-3FLAG片段（810 bp）切掉，电泳回收长约8.1 kb的载体片段；并与EcoR和Xba Ⅰ双酶切的Ag85基因作连接，将连接反应液转化感受态细胞DH5α，在100 mg/L的氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选，挑取阳性菌落作菌落PCR，正向测序引物序列为：5´- CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-，反向引物序列为5´-CAG CGG GGC TGC TAA AGC GCA TGC-，阳性克隆应得到1 307 bp条带，阴性克隆得到1 056 bp条带。接种阳性克隆保种，分装100 μl送测序，测序完全正确的克隆，再接种，用质粒小抽试剂盒抽提质粒，所获质粒就是pLVX-Ag85A-CMV慢病毒载体，-20℃保存备用。
1.2.3.2 PmTERT驱动的Ag85A基因慢病毒载体pLVX-Ag85A-PmTERT构建及鉴定
用Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ切去pLVX-Ag85A-CMV慢病毒载体的CMV启动子片段，插入PmTERT就获得pLVX-Ag85A-PmTERT慢病毒载体。载体重组、筛选和鉴定与1.2.3.1相同。
1.2.4 Western
blot鉴定重组慢病毒质粒pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A- PmTERT
1.2.4.1 质粒转染及细胞总蛋白质提取
转染前一天在六孔板中分别接种小鼠Lewis肺癌细胞和小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞（1×105/孔），24 h后用脂质体分别将重组慢病毒载体pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT转染上述细胞，6 h后，用新鲜培养基更换转染液，继续培养3 d后，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度后，-80℃深低温冰箱保存备用。
1.2.4.2 Western
blot实验每个蛋白样品取40 μg，体积用上样缓冲液补至30 μl，100℃水浴5 min后，置4℃存放备用。蛋白样品加在SDS-PAGE胶上电泳后，电转至硝酸纤维素膜（NC膜）上，经5%脱脂牛奶加Tween的Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）室温封闭1 h，分别与一抗和二抗孵育后，显色。
2 结果
2.1 重组质粒pGL3-PmTERT鉴定结果
DNA测序显示，重组质粒的多克隆位点Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之间有与Genebank中小鼠TERT启动子序列完全一致DNA片段；Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切获得与预期相似的两条DNA条带（图 1）。
图1
重组质粒pGL3-PmTERT的Mlu I和Xho I双酶切鉴定结果
2.2 PmTERT在小鼠及人肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性
PmTERT 在小鼠Lewis肺癌细胞中的转录活性为阳性对照的CMV启动子的1.72倍，PmTERT在小鼠成纤维细胞NIH3T3中无转录活性；PmTERT在在人肺腺癌细胞A549和人食管癌细胞EC-109有转录活性，与阳性对照的CMV启动子活性的比值分别为0.71和0.23，PmTERT在人胚肾成纤维细胞MRC-5细胞中无转录活性（图 2）。
图2
转染pGL3-Basic、pGL3-PmTERT和pGL3-promoter的不同细胞Luciferase活性检测结果
2.3 重组慢病毒载体的鉴定
2.3.1 pLVX-Ag85A-CMV菌落PCR实验结果
所挑取的8个重组质粒转化的阳性菌落，PCR有5个获得预期大小一致的DNA片段图(3)；阳性克隆测序结果表明，和预期的序列完全一致。
图3
菌落PCR结果
注：1为空白对照（蒸馏水为模板）；2为阴性对照（空载体为模板）；3为NA Marker：由大至小分别为2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11为挑取的8个转化子
2.3.2 pLVX-Ag85A-PmTERT菌落PCR实验结果
所挑取的8个重组质粒转化的阳性菌落，PCR均获得与预期大小一致的DNA片段（图 4）。重组质粒pLVX-Ag85A-PmTERT的多克隆位点Mlu和EcoR Ⅰ 之间有与Genebank中小鼠TERT启动子序列完全一致DNA片段。
图4
菌落PCR结果
注： 1为空白对照（蒸馏水为模板）；2为阴性对照（空载体为模板）；3为DNA Marker：由大至小分别为2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11为挑取的8个转化子
2.4 Western blot鉴定结果
用pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT两种慢病毒载体分别感染NIH3T3及Lewis肺癌细胞。结果显示，感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis细胞和NIH3T3细胞均有Ag85A蛋白表达，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的Lewis细胞有Ag85A表达，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3细胞无g85A表达（图 5）。
图5
Western blot检测Ag85A表达
注：1为阴性对照（感染空病毒载体的Lewis细胞）； 2、3为感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3细胞和Lewis细胞；4、5为感染pLVX-Ag85A-CMV的NIH3T3细胞和Lewis细胞
3 讨论
抗原85复合体（Ag85）是存在于各种分枝杆菌中的分泌性蛋白，由A、B、C 三个组分构成，具有分枝菌酸转移酶活性，在分枝杆菌细胞壁合成中有重要作用。已有的研究显示，Ag85复合物具有较强细胞及体液免疫活性，其中以Ag85A的免疫活性最强，能诱导T细胞增殖、刺激机体产生大量的INF-γ和IL-2 [10-11]。从上世纪90年代中后期开始，有研究者将Ag85A及其他结核杆菌抗原基因用于构建预防结核的新型疫苗，取得引人注目的成果[12-13]。近年来，Ag85A基因也被尝试用于肿瘤基因治疗。Zlotta 等[14]的研究显示，曾经患过结核病的膀胱癌患者体内存在能识别Ag85A蛋白的记忆免疫细胞，膀胱腔内灌注卡介苗后Ag85A进入体内可以激活这些记忆细胞，产生强烈免疫反应。Tarrant等[15]用Ag85A基因转染黑色素瘤细胞B16-F10，发现转基因细胞在小鼠体内的成瘤性显著降低，病理检查显示在肿瘤组织中有大量炎性白细胞浸润。Lee等[16]分别构建了结核杆菌Ag85A、Ag85B、Mpt64、PstS3与ESAT6融合基因的表达载体，这些重组载体与IL-12共同应用，能显著抑制膀胱癌细胞MBT-2在小鼠体内的生长。在本研究中，我们也构建了CMV启动子驱动的Ag85A的慢病毒表达载体pLVX-Ag85A-CMV，将其转染小鼠Lewis肺癌细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3，用Western blot方法均检测到Ag85A表达。
在基因治疗中，如果引入的目的基因在机体内无差别的表达，就可能使正常细胞受到基因治疗效应的损伤，从而发生严重的不良反应。用肿瘤特异性启动子对治疗基因进行转录调控，使其表达局限在肿瘤细胞，是实现肿瘤基因治疗肿瘤靶向性的有效方法之一。一些肿瘤标志物基因启动子，如甲胎球蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）启动子以及端粒酶催化亚单位（TERT）启动子都可以用于肿瘤靶向性基因治疗的研究[17-19]。端粒酶（telomerase）是一种广谱肿瘤标志物，在85% 以上的肿瘤细胞中呈现阳性表达，而在正常细胞中，除了生殖细胞和某些干细胞以外，几乎均无表达[20]。因此TERT启动子转录具有高度的肿瘤特异性，是近年来肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最为广泛的基因转录元件[21-22]。在以往的研究中，我们克隆了人TERT启动子序列，发现它在多种肺癌细胞中具有转录活性，其调控的自杀基因HSV-TK/GCV治疗系统能够特异性抑制肺癌细胞A549的体外增殖和在裸鼠体内的生长[23-24]。由于小鼠是肿瘤基因治疗研究中最常使用的实验动物，小鼠TERT启动子（PmTERT）转录活性的研究具有重要意义。Si等[25]克隆了不同长度的PmTERT片段，并检测了这些PmTERT在不同细胞中的转录活性。研究显示，PmTERT的核心区域位于ATG位点上游333 bp内。本研究中，我们克隆了ATG上游331 bp大小的PmTERT片段，Luciferase实验显示，PmTERT在小鼠Lewis肺癌细胞中具有良好的转录活性，其活性还稍强于阳性对照SV40启动子，而在小鼠成纤维细胞NIH3T3中无明显转录活性。由于在人类肿瘤研究中，常常将人类肿瘤细胞移植到实验动物体内，建立各种肿瘤动物模型。因此，有必要明确TERT启动子在不同种属的细胞中，是否有相似的转录特性。Arendt等[26]的研究显示，人TERT启动子在人和犬的肿瘤细胞中有相似的转录活性。本研究显示，PmTERT在人肺腺癌细胞A549和人食管癌细胞EC-109中也有转录活性，但活性明显低于PmTERT在Lewis细胞中的转录活性；PmTERT在人类成纤维细胞MRC-5中无明显转录活性。上述结果提示，PmTERT在人细胞中也具有肿瘤特异性的转录活性。在本研究中，我们还用PmTERT代替CMV启动子，构建了PmTERT驱动的肿瘤特异性Ag85A慢病毒载体pLVX-Ag85A-PmTERT，发现转染pLVX-Ag85A-PmTERT的小鼠Lewis肺癌细胞有Ag85A表达，而转染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3小鼠成纤维细胞无Ag85A表达，提示以PmTERT驱动的Ag85A基因可以在小鼠肺癌细胞中选择性表达，这为肺癌的靶向性免疫基因治疗的深入研究奠定了基础。
