引用本文： 何金波, 陈玲珑, 王贤裕, 罗梓垠, 刘亚坤, 汪洋, 王万铁. 离体大鼠心肌缺氧/复氧不同时间点心肌组织中TNF-α水平的动态变化及意义. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(12): 1147-1151. doi: 10.7507/1007-4848.20150285 复制
近些年来，随着心肌梗死发病率的节节攀高，心肌梗死后再灌注治疗已经成为挽救濒死心肌，降低心肌梗死死亡率的重要方法[1]，但伴发的再灌注损伤可使心肌再灌注治疗的有效性大大降低[2]。心肌缺氧/复氧损伤（myocardial hypoxia/reoxygenation injury，MH/RI）的临床要表现主要为再灌注性心律失常、心肌无复流、顿抑、心肌酶谱的升高、梗死面积扩大等。据文献报道，再灌注期间形成MH/RI的原因包括大量自由基生成、细胞钙超载、炎症反应、凋亡等[3-5]。l975年，Carswell等[6]首次在研究中发现了一种内毒素诱导产生的血清因子可以导致肿瘤组织坏死，即肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞产生的细胞因子，作为炎症反应的启动物质，它是最早发挥作用的前炎性因子[7]。TNF-α具有复杂的生物学活性，包括抗肿瘤、抗病毒、免疫调节和诱发炎症反应等[8]。TNF-α在许多心脏疾病，如冠心病、心肌梗死的发生与发展中扮演着重要角色[9]。本文通过观察离体大鼠心肌缺氧/复氧早期不同时间点心肌中TNF-α的表达，探讨TNF-α与MH/RI的关系。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料
SD大鼠，雄性，体重250～280 g，其它试剂同参考文献10。
1.1.2 实验分组
48只雄性SD大鼠随机分为对照组（sham组）、缺氧/复氧组（H/R 0.5 h组、1 h组、2 h组），每组12只。采用离体灌流系统，sham组平衡灌注20 min后将心脏保存；H/R 0.5 h组、H/R 1 h组、H/R 2 h组的灌注方法同参考文献6。
1.2 方法
1.2.1 离体心脏H/R模型
1.2.2 心肌组织中TNF-α和CK-MB的浓度检测
1.2.3 逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法检测心肌组织中TNF-α
mRNA的表达水平 Trizol一步法[14]提取大鼠心肌组织总RNA，蛋白核酸仪测定OD 260/280比值（1.8～2.0） 以及OD 260的值。合成cDNA产物采用参考文献10中描述的方法，引物序列见表 1。
表1
引物序列
1.2.4 电镜标本制备
各组停灌后迅速从心尖部同一部位取材，在生理盐水中漂洗1 min，切成1 mm3大小的组织块，浸入2.5%的戊二醛中固定，按电镜常规制样流程制样，透射电镜下观察心肌细胞超微结构的改变。
1.3 统计学分析
数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组心功能参数的变化
与对照组相比，缺氧/复氧组的左心室发展压（1eft ventricular development pressure，LVDP）、左心室发展压最大上升/下降速率（maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，± dp/dtmax）、心率（heart rate，HR）值明显降低（P＜0.05) ；H/R 0.5 h 组、H/R1 h组、H/R 2 h组随着灌注时间延长，LVDP、±dp/dtmax、HR的值逐渐下降，H/R 0.5 h、H/R1 h、H/R2 h组间LVDP、±dp/dtmax、HR的值两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；H/R2 h组与其他组相比，LVDP、±dp/dtmax、HR值达到最低（P＜0.05) ；见表 2。
表2
各组大鼠心功能参数的比较（2.2 大鼠心肌组织TNF-α和CK-MB的浓度
缺氧/复氧组与对照组相比，心肌组织中TNF-α的含量明显增高(P＜0.05) ，CK-MB的浓度上升(P＜0.05) ；随着灌注时间的延长，TNF-α和CK-MB的水平呈上升趋势，提示心肌损伤加重，H/R 0.5 h、H/R1 h、H/R2 h组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05) ；与其他组相比，H/R 2 h组心肌组织中TNF-α和CK-MB的表达达到高峰，见表 3。
表3
各组大鼠心肌组织TNF-α和CK-MB的变化（2.3 TNF-α mRNA相对表达量的比较
与对照组相比，缺氧/复氧组TNF-α mRNA的相对表达量显著升高（P＜0.05) ；随着灌注时间的延长，TNF-α mRNA的表达量呈上升趋势（P＜0.05) ，H/R 0.5 h组、H/R1h组、H/R2h组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05) ，与其他组相比，H/R 2h组TNF-α mRNA的表达量最高，见图 1。
图1
各组TNF-α mRNA相对表达量的比较
注：A为sham组；B为H/R 0.5 h组；C为H/R 1 h组；D为H/R 2 h组；与sham组相比*
2.4 相关性分析
离体大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α的浓度呈显著负相关（P＜0.01），心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01），心肌TNF-α mRNA相对表达量与TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01），心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α mRNA相对表达量呈显著负相关（P＜0.05），大鼠心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α mRNA相对表达量呈显著正相关（P＜0.01）；见图 2、3。
图2
大鼠心功能指标与心肌组织TNF-α浓度相关性分析
图3
大鼠心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α浓度相关性分析
2.5 心肌组织超微结构的观察
心肌组织电镜观察结果：对照组心肌纤维结构清晰，横纹明显，肌丝排列规则，线粒体形态正常，板层嵴密集，结构清楚；缺氧/复氧0.5 h组心肌纤维走形稍紊乱，横纹不明显，线粒体开始出现畸形；缺氧/复氧1 h组心肌纤维结构紊乱，横纹消失，线粒体肿胀、畸形，嵴断裂、溶解及空泡形成；缺氧/复氧2 h组出现肌丝大面积的断裂、溶解，线粒体嵴肿胀十分明显，见图 4。
图4
电镜下心肌超微结构的改变
注：A为sham 组；B为H/R 0.5 h组；C为H/R 1 h组；D为H/R 2 h组
3 讨论
各种临床和基础研究证明，炎症反应在心脏疾病的发生与发展中发挥着很重要的作用[15-16]，炎性细胞的浸润、激活及细胞因子的释放是导致心肌间质重塑的重要机制[17-18]。TNF-α是炎症反应中最重要的细胞因子，它贯穿了炎症损伤的整个过程[19]，它可以通过改变内皮细胞基因表达激活内皮细胞产生其他炎性介质，并且产生引起基质重构的酶，增加在内皮细胞表面形成血栓的能力[20]。TNF-α可促进中性粒细胞聚集，使间叶细胞释放蛋白溶解酶，并且可引起机体的发热、食欲不振、产生慢波睡眠、促进骨髓向末梢血液循环释放中性粒细胞、促进促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质激素的释放[21]。TNF-α通过两个不同的跨膜受体即肿瘤坏死因子受体1 （tumor necrosis factor receptor1）和TNFR2来介导炎症反应，TNFR1有其特殊的死亡结构域，在TNFR1被TNF-α激活后，其TNF受体相关死亡结构域（TNF receptor-associated death domain，TRADD）死亡结构域与fas死亡结构域蛋白质（fas associated death domain，FADD）结合，招募Caspases8，启动级联反应，介导细胞的凋亡，TNFR1还可以与TRADD、受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）、 肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2）和细胞凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of cellular apoptosis proteins-1，cIAP1）结合成复合物，共同激活NF-ĸB，介导炎症反应[22]。与TNFR1不同，TNFR2没有死亡结构域，被TNF-α激活后，通过招募TRAF2、TRAF3、cIAP1和cIAP2形成复合物，从而通过促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径和核因子诱导激酶（NIK）途径分别激活转录因子AP-1和NF‐κB，启动炎症反应[23]。在对心脏疾病的研究中发现，TNF-α的过度表达可以引起左心室功能下降,引起左心室重塑以及内皮功能障碍[24]，Levine等[25]首次在心力衰竭患者中发现血清TNF-α浓度较健康对照组呈升高趋势，在Cugno等[26]的研究中证实，抗TNF-α治疗可以明显改善类风湿性关节炎所引起的心脏损伤。
目前，体外循环心脏直视手术已在许多医院开展，术中出现的MH/RI已引起广泛关注，MH/RI还常发生于急性心肌梗死患者冠状动旁路移植术、经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）及冠状动脉内溶栓术中，严重影响患者的康复和预后。MH/RI是临床上心肌缺血性疾病及心脏外科手术中常见的一种严重病理损伤，机体的许多损伤机制均参与其中，为了探讨TNF-α在心肌缺氧/复氧不同时间点的表达及其与心肌损伤的关系，我们采用Langendorff离体灌流系统制备大鼠心脏缺氧/复氧模型，以模拟临床上心脏直视手术。研究结果显示，作为提示心功能早期损伤的敏感指标，复氧期间CK-MB在心肌中的表达量逐渐升高，LVDP、±dp/dtmax、HR的值呈下降趋势，随着复氧时间延长，心肌损伤加重。缺氧/复氧组的心肌TNF-α的含量普遍高于对照组（P＜0.05），而在缺氧/复氧组内，H/R 0.5 h组、H/R1 h组、H/R2 h 组随着再灌注时间的延长，TNF-α的表达量逐渐上升，组间两两比较其差异均有统计学意义（P＜0.05）。相关性分析结果显示，大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α的浓度呈显著负相关（P＜0.05) ，心肌组织CK-MB的表达量与心肌组织TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01) ，提示TNF-α所介导的炎症损伤是导致MH/RI的重要机制。
综上所述，本研究发现在心肌缺氧/复氧过程中，心肌组织TNF-α的高表达所介导的炎症损伤是引起再灌注损伤的重要机制，这对临床上心内直视手术中MH/RI的预防与治疗有一定的指导意义。
近些年来，随着心肌梗死发病率的节节攀高，心肌梗死后再灌注治疗已经成为挽救濒死心肌，降低心肌梗死死亡率的重要方法[1]，但伴发的再灌注损伤可使心肌再灌注治疗的有效性大大降低[2]。心肌缺氧/复氧损伤（myocardial hypoxia/reoxygenation injury，MH/RI）的临床要表现主要为再灌注性心律失常、心肌无复流、顿抑、心肌酶谱的升高、梗死面积扩大等。据文献报道，再灌注期间形成MH/RI的原因包括大量自由基生成、细胞钙超载、炎症反应、凋亡等[3-5]。l975年，Carswell等[6]首次在研究中发现了一种内毒素诱导产生的血清因子可以导致肿瘤组织坏死，即肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞产生的细胞因子，作为炎症反应的启动物质，它是最早发挥作用的前炎性因子[7]。TNF-α具有复杂的生物学活性，包括抗肿瘤、抗病毒、免疫调节和诱发炎症反应等[8]。TNF-α在许多心脏疾病，如冠心病、心肌梗死的发生与发展中扮演着重要角色[9]。本文通过观察离体大鼠心肌缺氧/复氧早期不同时间点心肌中TNF-α的表达，探讨TNF-α与MH/RI的关系。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料
SD大鼠，雄性，体重250～280 g，其它试剂同参考文献10。
1.1.2 实验分组
48只雄性SD大鼠随机分为对照组（sham组）、缺氧/复氧组（H/R 0.5 h组、1 h组、2 h组），每组12只。采用离体灌流系统，sham组平衡灌注20 min后将心脏保存；H/R 0.5 h组、H/R 1 h组、H/R 2 h组的灌注方法同参考文献6。
1.2 方法
1.2.1 离体心脏H/R模型
1.2.2 心肌组织中TNF-α和CK-MB的浓度检测
1.2.3 逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法检测心肌组织中TNF-α
mRNA的表达水平 Trizol一步法[14]提取大鼠心肌组织总RNA，蛋白核酸仪测定OD 260/280比值（1.8～2.0） 以及OD 260的值。合成cDNA产物采用参考文献10中描述的方法，引物序列见表 1。
表1
引物序列
1.2.4 电镜标本制备
各组停灌后迅速从心尖部同一部位取材，在生理盐水中漂洗1 min，切成1 mm3大小的组织块，浸入2.5%的戊二醛中固定，按电镜常规制样流程制样，透射电镜下观察心肌细胞超微结构的改变。
1.3 统计学分析
数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组心功能参数的变化
与对照组相比，缺氧/复氧组的左心室发展压（1eft ventricular development pressure，LVDP）、左心室发展压最大上升/下降速率（maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，± dp/dtmax）、心率（heart rate，HR）值明显降低（P＜0.05) ；H/R 0.5 h 组、H/R1 h组、H/R 2 h组随着灌注时间延长，LVDP、±dp/dtmax、HR的值逐渐下降，H/R 0.5 h、H/R1 h、H/R2 h组间LVDP、±dp/dtmax、HR的值两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；H/R2 h组与其他组相比，LVDP、±dp/dtmax、HR值达到最低（P＜0.05) ；见表 2。
表2
各组大鼠心功能参数的比较（2.2 大鼠心肌组织TNF-α和CK-MB的浓度
缺氧/复氧组与对照组相比，心肌组织中TNF-α的含量明显增高(P＜0.05) ，CK-MB的浓度上升(P＜0.05) ；随着灌注时间的延长，TNF-α和CK-MB的水平呈上升趋势，提示心肌损伤加重，H/R 0.5 h、H/R1 h、H/R2 h组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05) ；与其他组相比，H/R 2 h组心肌组织中TNF-α和CK-MB的表达达到高峰，见表 3。
表3
各组大鼠心肌组织TNF-α和CK-MB的变化（2.3 TNF-α mRNA相对表达量的比较
与对照组相比，缺氧/复氧组TNF-α mRNA的相对表达量显著升高（P＜0.05) ；随着灌注时间的延长，TNF-α mRNA的表达量呈上升趋势（P＜0.05) ，H/R 0.5 h组、H/R1h组、H/R2h组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05) ，与其他组相比，H/R 2h组TNF-α mRNA的表达量最高，见图 1。
图1
各组TNF-α mRNA相对表达量的比较
注：A为sham组；B为H/R 0.5 h组；C为H/R 1 h组；D为H/R 2 h组；与sham组相比*
2.4 相关性分析
离体大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α的浓度呈显著负相关（P＜0.01），心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01），心肌TNF-α mRNA相对表达量与TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01），心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α mRNA相对表达量呈显著负相关（P＜0.05），大鼠心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α mRNA相对表达量呈显著正相关（P＜0.01）；见图 2、3。
图2
大鼠心功能指标与心肌组织TNF-α浓度相关性分析
图3
大鼠心肌组织CK-MB的表达量与TNF-α浓度相关性分析
2.5 心肌组织超微结构的观察
心肌组织电镜观察结果：对照组心肌纤维结构清晰，横纹明显，肌丝排列规则，线粒体形态正常，板层嵴密集，结构清楚；缺氧/复氧0.5 h组心肌纤维走形稍紊乱，横纹不明显，线粒体开始出现畸形；缺氧/复氧1 h组心肌纤维结构紊乱，横纹消失，线粒体肿胀、畸形，嵴断裂、溶解及空泡形成；缺氧/复氧2 h组出现肌丝大面积的断裂、溶解，线粒体嵴肿胀十分明显，见图 4。
图4
电镜下心肌超微结构的改变
注：A为sham 组；B为H/R 0.5 h组；C为H/R 1 h组；D为H/R 2 h组
3 讨论
各种临床和基础研究证明，炎症反应在心脏疾病的发生与发展中发挥着很重要的作用[15-16]，炎性细胞的浸润、激活及细胞因子的释放是导致心肌间质重塑的重要机制[17-18]。TNF-α是炎症反应中最重要的细胞因子，它贯穿了炎症损伤的整个过程[19]，它可以通过改变内皮细胞基因表达激活内皮细胞产生其他炎性介质，并且产生引起基质重构的酶，增加在内皮细胞表面形成血栓的能力[20]。TNF-α可促进中性粒细胞聚集，使间叶细胞释放蛋白溶解酶，并且可引起机体的发热、食欲不振、产生慢波睡眠、促进骨髓向末梢血液循环释放中性粒细胞、促进促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质激素的释放[21]。TNF-α通过两个不同的跨膜受体即肿瘤坏死因子受体1 （tumor necrosis factor receptor1）和TNFR2来介导炎症反应，TNFR1有其特殊的死亡结构域，在TNFR1被TNF-α激活后，其TNF受体相关死亡结构域（TNF receptor-associated death domain，TRADD）死亡结构域与fas死亡结构域蛋白质（fas associated death domain，FADD）结合，招募Caspases8，启动级联反应，介导细胞的凋亡，TNFR1还可以与TRADD、受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）、 肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2）和细胞凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of cellular apoptosis proteins-1，cIAP1）结合成复合物，共同激活NF-ĸB，介导炎症反应[22]。与TNFR1不同，TNFR2没有死亡结构域，被TNF-α激活后，通过招募TRAF2、TRAF3、cIAP1和cIAP2形成复合物，从而通过促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径和核因子诱导激酶（NIK）途径分别激活转录因子AP-1和NF‐κB，启动炎症反应[23]。在对心脏疾病的研究中发现，TNF-α的过度表达可以引起左心室功能下降,引起左心室重塑以及内皮功能障碍[24]，Levine等[25]首次在心力衰竭患者中发现血清TNF-α浓度较健康对照组呈升高趋势，在Cugno等[26]的研究中证实，抗TNF-α治疗可以明显改善类风湿性关节炎所引起的心脏损伤。
目前，体外循环心脏直视手术已在许多医院开展，术中出现的MH/RI已引起广泛关注，MH/RI还常发生于急性心肌梗死患者冠状动旁路移植术、经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）及冠状动脉内溶栓术中，严重影响患者的康复和预后。MH/RI是临床上心肌缺血性疾病及心脏外科手术中常见的一种严重病理损伤，机体的许多损伤机制均参与其中，为了探讨TNF-α在心肌缺氧/复氧不同时间点的表达及其与心肌损伤的关系，我们采用Langendorff离体灌流系统制备大鼠心脏缺氧/复氧模型，以模拟临床上心脏直视手术。研究结果显示，作为提示心功能早期损伤的敏感指标，复氧期间CK-MB在心肌中的表达量逐渐升高，LVDP、±dp/dtmax、HR的值呈下降趋势，随着复氧时间延长，心肌损伤加重。缺氧/复氧组的心肌TNF-α的含量普遍高于对照组（P＜0.05），而在缺氧/复氧组内，H/R 0.5 h组、H/R1 h组、H/R2 h 组随着再灌注时间的延长，TNF-α的表达量逐渐上升，组间两两比较其差异均有统计学意义（P＜0.05）。相关性分析结果显示，大鼠心肌缺氧/复氧期间LVDP、±dp/dtmax、HR的值与心肌组织TNF-α的浓度呈显著负相关（P＜0.05) ，心肌组织CK-MB的表达量与心肌组织TNF-α的浓度呈显著正相关（P＜0.01) ，提示TNF-α所介导的炎症损伤是导致MH/RI的重要机制。
综上所述，本研究发现在心肌缺氧/复氧过程中，心肌组织TNF-α的高表达所介导的炎症损伤是引起再灌注损伤的重要机制，这对临床上心内直视手术中MH/RI的预防与治疗有一定的指导意义。
