引用本文： 扶志敏, 刘建新, 李名鹏, 罗滨. 雷洛昔芬对人主动脉瓣间质细胞增殖和凋亡的影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(2): 143-146. doi: 10.7507/1007-4848.201507053 复制
随着我国人口老龄化趋势的加剧，心脏瓣膜病的发病率逐年增加，其中主动脉瓣病变在心脏瓣膜病变中占很大比例[1-2]。主动脉瓣间质细胞（AVICs）是构成主动脉瓣膜的主要成分，其生物学功能的改变对主动脉瓣膜病变的发生起着重要的作用[3]。雷洛昔芬（raloxifene，RAL）属于第二代选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulation，SERM），表现出对心血管和骨组织的雌激素样作用，对子宫和乳腺组织则有抗雌激素作用，具有明显的组织选择性，有望成为一种治疗心血管疾病的新型药物[4-5]。本实验应用Ⅱ型胶原酶分离出人的 AVICs，并进行体外培养，用不同浓度的 RAL 作用后，检测 RAL 对 AVICs 增殖和凋亡的影响，为进一步研究 RAL 对主动脉瓣病变的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试剂和仪器主要包括雷洛昔芬（Sigma），DMEM 高糖型基础培养基（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），青霉素和链霉素（Hyclone），谷氨酰胺（Beyotime），Ⅱ型胶原酶（Worthington），磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone），细胞增殖与毒性检测试剂盒（MTS，promega），全自动酶标仪（BIO-RAD），0.22 μm 一次性过滤器（Millipore），50 ml 离心管（Corning），100 ml 烧瓶附锡箔纸做盖，眼科剪，细胞刮（Corning），细胞培养箱（Thermo），60 mm、100 mm培养皿，6 孔、96 孔板（Corning），超净工作台（BAKER SterilGARD）。
1.2 AVICs 原代与传代培养
人主动脉瓣取材于郴州市第一人民医院心胸外科心脏移植且无心脏瓣膜病变的 45 岁女性患者，术前签署知情同意书。小心沿主动脉瓣膜根部取下瓣膜，低温带回实验室。依次用 1 000 U/ml 抗生素洗涤 30 s，500 U/ml、200 U/ml、100 U/ml 的抗生素洗涤 3 min。将瓣膜组织放入 60 mm 培养皿，加入含 600 U/mlⅡ型胶原酶的细胞培养基，放入37 °C、5% CO2 培养箱内消化 15 min。细胞刮刮去瓣膜组织表面内皮细胞，在 100 mm 含消化液培养皿用无菌显微剪剪成 1 mm×1 mm 的小块，移至 100 ml 烧瓶中，37 °C、5% CO2 培养箱内消化 6 h，离心得到原代 AVICs，待其达到 90% 融合度时，按 1:3 进行传代培养[6]。
1.3 MTS 检测
按 300 个/孔将 AVICs 接种至 5 块 96 孔板中，每组设 3 个平行复孔，待细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，其中 0 nmol/L RAL 组作为对照组，其余为实验组，分别在加药后的 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d，按每孔 20 μl 量加入 MTS 反应液，放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 2 h，用全自动酶标仪检测 490 nm 波长处的吸光度值（OD值），描绘出生长曲线。
1.4 流式细胞仪检测
1.4.1 检测细胞周期 将 AVICs 按 2×104 个/孔接种于 6 孔板中，待细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 7 d 后，收集细胞，PBS 漂洗，离心，加入 1 ml –20 °C 预冷的 75% 乙醇，重悬样本，做好标记，碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细胞周期。
1.4.2 检测细胞凋亡 将主动脉瓣间质细胞按 8×104 个/孔接种于 6 孔板中。细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，用无血清培养基诱导凋亡培养 7 d 后，离心，去除上清液，加入 100 μl 的 1× 结合缓冲液（binding buffer，BD）重悬细胞。加入 5 μl APC Annexin-V 细胞凋亡检测试剂盒和 5 μl PI（BD），室温避光染色 15 min，上机检测。
1.5 统计学分析
采用 SPSS 17.0 进行统计分析，计量资料以均数 ± 标准差（ ）表示，RAL 不同浓度实验组和对照组之间的比较采用两组间的非配对t 检验，P＜0.05为有差异有统计学意义。
2 结果
2.1 分离得到的 AVICs
用含 10% 胎牛血清的培养基培养分离得到的 AVICs，倒置显微镜下观察细胞贴壁后呈现出狭长条形样改变，主要表现为梭形和多角形（图 1），该细胞生长较为缓慢，每 3 d 更换一次培养基，每 7～10 d 传代。
图1
人主动脉瓣间质细胞 a. ×100；b. ×400
2.2 RAL 对 AVICs 增殖的影响
酶标仪检测第 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d 各个 RAL 浓度作用下 490 nm 波长处 OD 值。与对照组相比，10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 在第 5、7、9 d 时显著抑制 AVICs 增殖（P＜0.05），尽管 1 000 nmol/L RAL 在第 5 d 时也表现出了明显的抑制 AVICs 增殖的作用（P＜0.05，图 2），但这种抑制作用在第 7 d 时表现为 OD 值降低为 0.196±0.029，此时在倒置显微镜下可观察到出现了部分细胞飘落死亡，随着时间的增加，到第 9 d 时 OD 值进一步降为 0.145±0.017，观察细胞发现，此时已有大量细胞死亡。
图2
MTS 检测不同浓度 RAL 对 AVICs 增殖的影响
流式细胞仪检测第 7 d 时不同浓度 RAL 作用下 AVICs 周期，结果显示：0.1 nmol/L 和 1 nmol/L RAL 组分别与对照组相比，细胞的 S 期细胞比例无明显差异。10 nmol/L RAL 组，100 nmol/L RAL 组和 1 000 nmol/L RAL 组 S 期细胞比例明显低于对照组（29.85%±1.61% vs. 45.83%±1.45%，21.67%±2.16% vs. 45.83%±1.45%，4.67%±1.34% vs. 45.83%±1.45%，n=6，P＜0.001，图 3），但结合 MTS 检测结果，考虑 1 000 nmol/L RAL 组 S 期细胞比例的降低（4.67%±1.34%）是由于细胞的死亡所致。
图3
不同浓度 RAL 对 AVICs S 期细胞比例的影响 * 与对照组相比，P＜0.001
2.3 AVICs 凋亡比例的变化
结果显示饥饿处理诱导凋亡成功，0.1 nmol/L RAL 组，1 nmol/L RAL 组和 1 000 nmol/L RAL 组分别与对照组相比，细胞凋亡率（早期凋亡率与晚期凋亡率之和）无明显差异（图 4），10 nmol/L 和 100 mol/L RAL 组细胞凋亡率与对照组相比明显降低（49.34%±2.16% vs. 59.67%±2.81%，41.50%±2.24% vs. 59.67%±2.81%，n=6，P＜0.05）。流式细胞仪结果显示 1 000 nmol/L RAL 组的细胞的凋亡率为 57.43%±4.45%，同时细胞的死亡率高达 41.26%±3.21%。
图4
不同浓度 RAL 对 AVICs 细胞凋亡率的影响 * 与对照组相比，P＜0.05
3 讨论
主动脉瓣病变是一个复杂的病理过程，过去主动脉瓣膜的病变被普遍认为是一种长期机械压力诱导下的被动的、非调控的过程[7-8]。而近 10 余年一系列研究表明，心脏瓣膜的病变不仅仅是一个单纯的被动过程，而是一个受到活跃调控的主动的生物学过程，在这个复杂的调控过程中，瓣膜间质细胞的增殖和凋亡参与了瓣膜病变和钙化形成[9-10]。有研究发现，由高脂饮食所致的高脂血症可诱导新西兰大白兔的瓣膜出现病变，而在病变的瓣膜中细胞凋亡的数目明显增加[11-12]，Jian等[13]发现通过诱导羊 AVICs 的凋亡可促进瓣叶钙化的发生。
RAL 作为新一代 SERM，目前主要用于女性绝经期后骨质疏松症的治疗[14-15]。在心血管方面的作用，研究表明，RAL 和其他一些 SERM 均具有改善血管内皮细胞功能[16-17]、扩张冠状动脉[5,18]、调节血脂[19]等功能，但 RAL 对心脏瓣膜病变的基础和临床研究鲜有报道[20]。
本实验采用不同浓度的 RAL 作用于 AVICs，我们发现 10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 具有明显抑制 AVICs 增殖的作用，这表明 RAL 对 AVICs 的作用具有明显的浓度依赖性，并且这种抑制细胞增殖的作用在第 7 d 最为明显，因此我们采用流式细胞仪检测该时间点时不同浓度下的细胞 S 期的比例，进一步验证 RAL 具有浓度依赖性，然而，随着药物浓度进一步增加为 1 000 nmol/L，AVICs 出现了飘落死亡现象，这可能与药物浓度过高而导致的细胞毒性作用有关。值得重视的是，RAL 对无血清培养基诱导的 AVICs 的凋亡具有抗凋亡的作用，有效浓度仍然为 10 nmol/L、100 nmol/L，而在 1 000 nmol/L 时，流式细胞检测表明，死亡和凋亡的 AVICs 的总比例占具 98% 以上，再次验证了过高浓度的 RAL 具有细胞毒性。鉴于前述，瓣膜间质细胞的增殖和凋亡参与了瓣膜病变和钙化形成，那么我们有理由相信体内合适的有效血药浓度的 RAL 可通过抑制 AVICs 的增殖和抗凋亡的作用，可能具有改善主动脉瓣膜病变的作用。
随着我国人口老龄化趋势的加剧，心脏瓣膜病的发病率逐年增加，其中主动脉瓣病变在心脏瓣膜病变中占很大比例[1-2]。主动脉瓣间质细胞（AVICs）是构成主动脉瓣膜的主要成分，其生物学功能的改变对主动脉瓣膜病变的发生起着重要的作用[3]。雷洛昔芬（raloxifene，RAL）属于第二代选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulation，SERM），表现出对心血管和骨组织的雌激素样作用，对子宫和乳腺组织则有抗雌激素作用，具有明显的组织选择性，有望成为一种治疗心血管疾病的新型药物[4-5]。本实验应用Ⅱ型胶原酶分离出人的 AVICs，并进行体外培养，用不同浓度的 RAL 作用后，检测 RAL 对 AVICs 增殖和凋亡的影响，为进一步研究 RAL 对主动脉瓣病变的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试剂和仪器主要包括雷洛昔芬（Sigma），DMEM 高糖型基础培养基（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），青霉素和链霉素（Hyclone），谷氨酰胺（Beyotime），Ⅱ型胶原酶（Worthington），磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone），细胞增殖与毒性检测试剂盒（MTS，promega），全自动酶标仪（BIO-RAD），0.22 μm 一次性过滤器（Millipore），50 ml 离心管（Corning），100 ml 烧瓶附锡箔纸做盖，眼科剪，细胞刮（Corning），细胞培养箱（Thermo），60 mm、100 mm培养皿，6 孔、96 孔板（Corning），超净工作台（BAKER SterilGARD）。
1.2 AVICs 原代与传代培养
人主动脉瓣取材于郴州市第一人民医院心胸外科心脏移植且无心脏瓣膜病变的 45 岁女性患者，术前签署知情同意书。小心沿主动脉瓣膜根部取下瓣膜，低温带回实验室。依次用 1 000 U/ml 抗生素洗涤 30 s，500 U/ml、200 U/ml、100 U/ml 的抗生素洗涤 3 min。将瓣膜组织放入 60 mm 培养皿，加入含 600 U/mlⅡ型胶原酶的细胞培养基，放入37 °C、5% CO2 培养箱内消化 15 min。细胞刮刮去瓣膜组织表面内皮细胞，在 100 mm 含消化液培养皿用无菌显微剪剪成 1 mm×1 mm 的小块，移至 100 ml 烧瓶中，37 °C、5% CO2 培养箱内消化 6 h，离心得到原代 AVICs，待其达到 90% 融合度时，按 1:3 进行传代培养[6]。
1.3 MTS 检测
按 300 个/孔将 AVICs 接种至 5 块 96 孔板中，每组设 3 个平行复孔，待细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，其中 0 nmol/L RAL 组作为对照组，其余为实验组，分别在加药后的 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d，按每孔 20 μl 量加入 MTS 反应液，放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 2 h，用全自动酶标仪检测 490 nm 波长处的吸光度值（OD值），描绘出生长曲线。
1.4 流式细胞仪检测
1.4.1 检测细胞周期 将 AVICs 按 2×104 个/孔接种于 6 孔板中，待细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 7 d 后，收集细胞，PBS 漂洗，离心，加入 1 ml –20 °C 预冷的 75% 乙醇，重悬样本，做好标记，碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细胞周期。
1.4.2 检测细胞凋亡 将主动脉瓣间质细胞按 8×104 个/孔接种于 6 孔板中。细胞完全贴壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，用无血清培养基诱导凋亡培养 7 d 后，离心，去除上清液，加入 100 μl 的 1× 结合缓冲液（binding buffer，BD）重悬细胞。加入 5 μl APC Annexin-V 细胞凋亡检测试剂盒和 5 μl PI（BD），室温避光染色 15 min，上机检测。
1.5 统计学分析
采用 SPSS 17.0 进行统计分析，计量资料以均数 ± 标准差（ ）表示，RAL 不同浓度实验组和对照组之间的比较采用两组间的非配对t 检验，P＜0.05为有差异有统计学意义。
2 结果
2.1 分离得到的 AVICs
用含 10% 胎牛血清的培养基培养分离得到的 AVICs，倒置显微镜下观察细胞贴壁后呈现出狭长条形样改变，主要表现为梭形和多角形（图 1），该细胞生长较为缓慢，每 3 d 更换一次培养基，每 7～10 d 传代。
图1
人主动脉瓣间质细胞 a. ×100；b. ×400
2.2 RAL 对 AVICs 增殖的影响
酶标仪检测第 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d 各个 RAL 浓度作用下 490 nm 波长处 OD 值。与对照组相比，10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 在第 5、7、9 d 时显著抑制 AVICs 增殖（P＜0.05），尽管 1 000 nmol/L RAL 在第 5 d 时也表现出了明显的抑制 AVICs 增殖的作用（P＜0.05，图 2），但这种抑制作用在第 7 d 时表现为 OD 值降低为 0.196±0.029，此时在倒置显微镜下可观察到出现了部分细胞飘落死亡，随着时间的增加，到第 9 d 时 OD 值进一步降为 0.145±0.017，观察细胞发现，此时已有大量细胞死亡。
图2
MTS 检测不同浓度 RAL 对 AVICs 增殖的影响
流式细胞仪检测第 7 d 时不同浓度 RAL 作用下 AVICs 周期，结果显示：0.1 nmol/L 和 1 nmol/L RAL 组分别与对照组相比，细胞的 S 期细胞比例无明显差异。10 nmol/L RAL 组，100 nmol/L RAL 组和 1 000 nmol/L RAL 组 S 期细胞比例明显低于对照组（29.85%±1.61% vs. 45.83%±1.45%，21.67%±2.16% vs. 45.83%±1.45%，4.67%±1.34% vs. 45.83%±1.45%，n=6，P＜0.001，图 3），但结合 MTS 检测结果，考虑 1 000 nmol/L RAL 组 S 期细胞比例的降低（4.67%±1.34%）是由于细胞的死亡所致。
图3
不同浓度 RAL 对 AVICs S 期细胞比例的影响 * 与对照组相比，P＜0.001
2.3 AVICs 凋亡比例的变化
结果显示饥饿处理诱导凋亡成功，0.1 nmol/L RAL 组，1 nmol/L RAL 组和 1 000 nmol/L RAL 组分别与对照组相比，细胞凋亡率（早期凋亡率与晚期凋亡率之和）无明显差异（图 4），10 nmol/L 和 100 mol/L RAL 组细胞凋亡率与对照组相比明显降低（49.34%±2.16% vs. 59.67%±2.81%，41.50%±2.24% vs. 59.67%±2.81%，n=6，P＜0.05）。流式细胞仪结果显示 1 000 nmol/L RAL 组的细胞的凋亡率为 57.43%±4.45%，同时细胞的死亡率高达 41.26%±3.21%。
图4
不同浓度 RAL 对 AVICs 细胞凋亡率的影响 * 与对照组相比，P＜0.05
3 讨论
主动脉瓣病变是一个复杂的病理过程，过去主动脉瓣膜的病变被普遍认为是一种长期机械压力诱导下的被动的、非调控的过程[7-8]。而近 10 余年一系列研究表明，心脏瓣膜的病变不仅仅是一个单纯的被动过程，而是一个受到活跃调控的主动的生物学过程，在这个复杂的调控过程中，瓣膜间质细胞的增殖和凋亡参与了瓣膜病变和钙化形成[9-10]。有研究发现，由高脂饮食所致的高脂血症可诱导新西兰大白兔的瓣膜出现病变，而在病变的瓣膜中细胞凋亡的数目明显增加[11-12]，Jian等[13]发现通过诱导羊 AVICs 的凋亡可促进瓣叶钙化的发生。
RAL 作为新一代 SERM，目前主要用于女性绝经期后骨质疏松症的治疗[14-15]。在心血管方面的作用，研究表明，RAL 和其他一些 SERM 均具有改善血管内皮细胞功能[16-17]、扩张冠状动脉[5,18]、调节血脂[19]等功能，但 RAL 对心脏瓣膜病变的基础和临床研究鲜有报道[20]。
本实验采用不同浓度的 RAL 作用于 AVICs，我们发现 10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 具有明显抑制 AVICs 增殖的作用，这表明 RAL 对 AVICs 的作用具有明显的浓度依赖性，并且这种抑制细胞增殖的作用在第 7 d 最为明显，因此我们采用流式细胞仪检测该时间点时不同浓度下的细胞 S 期的比例，进一步验证 RAL 具有浓度依赖性，然而，随着药物浓度进一步增加为 1 000 nmol/L，AVICs 出现了飘落死亡现象，这可能与药物浓度过高而导致的细胞毒性作用有关。值得重视的是，RAL 对无血清培养基诱导的 AVICs 的凋亡具有抗凋亡的作用，有效浓度仍然为 10 nmol/L、100 nmol/L，而在 1 000 nmol/L 时，流式细胞检测表明，死亡和凋亡的 AVICs 的总比例占具 98% 以上，再次验证了过高浓度的 RAL 具有细胞毒性。鉴于前述，瓣膜间质细胞的增殖和凋亡参与了瓣膜病变和钙化形成，那么我们有理由相信体内合适的有效血药浓度的 RAL 可通过抑制 AVICs 的增殖和抗凋亡的作用，可能具有改善主动脉瓣膜病变的作用。
