引用本文： 王玉庆, 董力, 石应康, 侯江龙, 江虹, 付博. 汉族人心脏瓣膜置换术后华法林用药剂量与基因型关系的相关性研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(1): 1-6. doi: 10.7507/1007-4848.20160001 复制
华法林是属香豆素类口服抗凝剂，心脏机械瓣膜置换术( mechanical heart valve replacement，MHVR)及部分生物瓣膜置换术后患者均需终身服用华法林行抗凝治疗，然而该药治疗窗窄，其个体剂量差异可以相差多达20倍以上[1]，治疗不当导致的出血与栓塞成为机械瓣膜置换术后最常见的严重并发症[2]。华法林在临床治疗过程中，造成其剂量个体差异的原因很多，可分为遗传因素和非遗传因素[3]。从华法林药动学和药效学研究结果显示，CYP2C9和VKORC1基因多态性是影响华法林剂量重要的遗传因素。结合年龄和体重等非遗传因素，VKORC1和CYP2C9基因多态性可解释50%～60%的华法林剂量个体差异[4-6]。目前研究结果证实，利用药物基因组学信息和临床相关特征建立的华法林用药剂量运算预测模型能够更准确地估计其用药剂量，降低治疗开始阶段抗凝治疗过量导致的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。尽管如此，很多研究仍存在方法上的限制，如未纳入凝血因子、血药浓度等与华法林药效学和药代学密切相关的检测指标以及其他影响华法林用药剂量变异的因素。此外，这些研究纳入的患者多为高加索人、非洲人，亚洲人种样本量较少。与高加索人相比，汉族人在抗凝治疗过程中更容易发生出血并发症而较少发生栓塞并发症，目前国内多采用低强度抗凝治疗[国际标准化比值（INR）1.5～2.5）]，但该治疗的基础研究如基因多态性与个体化抗凝治疗的关系目前甚少报道。本研究以心脏瓣膜置换术后患者作为研究对象，明确VKORC1和CYP2C9等基因多态性与中国人华法林剂量个体差异的相关性，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄及体表面积等非遗传因素，预测患者华法林抗凝治疗的合理用药剂量，实现抗凝监测的个体化管理，减少其并发症的发生。
1 资料与方法
1.1 研究对象和分组
1.1.1 临床资料
连续性纳入《中国人心脏瓣膜置换术后抗凝治疗数据库》中2011年1月1日至2012年12月31日在四川大学华西医院行心脏瓣膜置换术、术后服用华法林行抗凝治疗并接受抗凝监测INR的患者103例，其中男32例、女71例，年龄21～85 （48.64±11.66）岁；身高147～180 （160.59±6.89）cm，体重43～78 （57.17±8.38）kg；华法林用药剂量为0.62～10.00 （2.99±1.41) mg/d；抗凝强度INR目标值：主动脉瓣置换术（AVR）1.5～1.8，二尖瓣置换术（MVR）及双瓣（主动脉瓣和二尖瓣）置换术（DVR）1.8～2.0，三尖瓣置换术（TVR）（含其他瓣膜置换）2.0～2.5，患者均未发生出血或者栓塞等并发症。
1.1.2 分组
按INR实测值在其目标值范围的频数（time within therapeutic INR target range，TTR）的高低将患者分为剂量稳定组（TTR > 75.7%）与不稳定组（TTR < 75.7%）[7]；再将稳定组按华法林剂量分为低剂量组（< 2.5 mg/d），中剂量组（2.5～5.0 mg/d）与高剂量组（> 5.0 mg/d）三组[8]；最后按CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）两个基因的突变情况将患者分为CYP2C9*1/*1组、CYP2C9*1/*3组和CYP2C9* 3/* 3组以及VKORC1-1639AA组、VKORC1-1639AG组和VKORC1-1639GG组。
1.2 方法
每位患者抽取2 ml外周静脉全血，使用乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）抗凝。置于冰箱-20℃保存；基因组DNA的提取采用磁珠法，使用思洛生物技术股份有限公司的SnoMag Blood DNA Extraction Kit来提取患者基因组DNA，-20℃冷冻保存；分批将提取好的患者基因组DNA进行CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）位点聚合酶链反应（PCR），对所需片段进行扩增，采用限制性片段长度多态性（RFLP）方法和测序技术对患者进行基因检测。在基因检测的同时，抽取2 ml外周静脉全血，使用Sysmex CA7000 analyser试剂盒（Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany）检测凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅳ、Ⅹ活性。将服用华法林钠片（山东齐鲁制药厂，2.5 mg/片）治疗2个月后的患者，在早晨同一时间（与测定PT-INR同一时间）采用超高效液相色谱法（HPLC）[9]检测患者华法林血药浓度。
1.3 统计学分析
计量资料用均数±标准差（x±s）表示，计数资料用频数、频率表示。计量资料的比较采用t检验或方差分析，计数资料的比较使用χ2检验。将年龄与华法林用药剂量进行单因素方差分析，多因素线性回归方法分析探讨各因素对华法林用药剂量影响的程度，用决定系数r2表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 华法林用药剂量与性别、年龄、体重、身高等之间的相关性
男性患者华法林用药剂量（3.08±1.15）mg/d，女性患者华法林用药剂量（2.95±1.51）mg/d，不同性别间华法林用药剂量差异无统计学意义（P > 0.05）。
103例患者按年龄段分为20～29岁、30～39岁、40～49岁、50～59岁、60～69岁以及> 70岁共6组（表 1），ANOVA分析结果显示各年龄组之间华法林用药剂量差异均有统计学意义（P < 0.05），患者华法林用药剂量随年龄的增高有递减的趋势。
表1
不同年龄组华法林用药剂量情况（x±s）
体表面积（body surface area，BSA)是由体重和身高计算得出。体表面积与华法林用药剂量的相关性采用直线回归进行检验，以体表面积为自变量，华法林用药剂量为应变量，拟建立一个直线回归方程：Y=2.047X-0.463，经方差分析示：F=3.972，P=0.049，该方程式成立，故可认为华法林用药剂量与体表面积之间有直线关系（图 1），体表面积每增加1 m2，华法林用药剂量的需求相应增加2.047 mg。
图1
体表面积对华法林用药剂量的影响
2.2 不同组别的华法林用药剂量与基因多态性和华法林血药浓度之间的关系
比较剂量稳定组和剂量不稳定组的华法林用药剂量与基因多态性的关系（表 2），结果显示：剂量稳定组中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG所占比例分别为84.95%、15.05%和0.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3基因型所占比例分别为96.77%和3.23%，未发现CYP2C9*3/*3基因型。剂量不稳定组中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分别为30.00%、50.00%和20.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP-2C9*1/*3基因型所占比例分别为60.00%和40.00%，未发现CYP2C9*3/*3基因型。对剂量不稳定组的患者加做CYP4F2、GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6基因位点检测。发现（1）GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6四个基因位点突变率为0，（2）CYP4F2的突变率较高，其中CYP4F2TT和CYP4F2CT均为30.00%。
表2
华法林剂量稳定组与不稳定组患者基因多态性比较[例（%）]
比较低剂量组、中剂量组和高剂量组患者的基因多态性及华法林血药浓度（表 3），结果显示：低剂量组中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AA为主，所占比例为93.75%，VKORC1-1639AG基因型为6.25%，而VKORC1-1639GG基因型为0.00，CYP2C9*1/*3基因型较高，为12.50%；中等剂量组中，VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分别为81.25%、17.19%和1.56%，CYP2C9*1/*3基因型为4.69%；高剂量组中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG为主，分别占85.71%、14.29%，CYP2C9*1/*3基因型为0；各组均未发现CYP2C9*3/*3基因型。
表3
华法林不同剂量组别患者基因多态性比较[例（%）]
2.3 华法林用药剂量与基因多态性之间的相关性
对103例患者根据CYP2C9 （rs1057910）、VKORC （rs9923231）两个基因的突变情况进行分组，比较每组的华法林用药剂量与基因多态性的关系，结果显示：CYP2C9*1/*3基因型患者所需的华法林用药剂量为（2.43±1.08）mg/d，显著低于CYP2C9*1/*1基因型患者[（3.03±1.42）mg/d，P=0.001]。VKORC1-1639GG基因型患者所需华法林用药剂量为（5.05±1.25）mg/d，AG基因型为（4.35±2.15）mg/d，AA基因型为（2.62±0.87）mg /d，差异有统计学意义（P < 0.05），VKORC1-1639 AG基因型和GG基因型患者所需华法林用药剂量大于VKORC1-1639 AA基因型患者（表 4）。
表4
基因多态性对患者华法林用药剂量的影响（x±s）
2.4 华法林用药剂量与血药浓度、凝血因子及基因多态性之间的关系
心脏瓣膜置换术后患者达到稳定INR后，华法林血药浓度平均值为484.5～2 788.5 （1 202.68±434.95）ng/ml （图 2）。本组华法林血药浓度主要集中在700～1 800 ng/ml区间中，随访中所有患者均无出血及栓塞等抗凝并发症发生。
图2
103例心脏瓣膜置换术后患者华法林血药浓度
不同基因型患者分组比较华法林用药剂量与血药浓度之间的关系（表 5）。就CYP2C9基因型分组分析可见，CYP2C9*1/*1组的患者华法林用药剂量（3.03±1.42）mg/d比CYP2C9*1/*3组的华法林用药剂量（2.42±1.08）mg/d明显增高（P < 0.05），但两组患者的华法林血药浓度差异无统计学意义（P > 0.05）。而对于VKORC1基因型分组分析可见，患者华法林用药剂量及血药浓度在VKORC1-1639AA组、VKORC1-1639AG组及VKORC1-1639GG组中均呈递增状态，组间剂量差异有统计学意义（P < 0.05）。
表5
不同基因型患者华法林用药剂量与血药浓度的关系（x±s）
2.5 多元线形回归分析
本研究以华法林用药剂量为因变量（Y），以年龄、性别、体表面积、华法林血药浓度、凝血因子活性和基因型等为自变量，进行多元线性回归分析结果（表 6）显示：性别、体表面积和凝血因子活性与华法林用药剂量差异无统计学意义（P > 0.05），说明上述三因素对华法林用药剂量的影响相对较弱；CYP2C9 *3、VKORC1-1639、华法林血药浓度及年龄与华法林用药剂量差异有统计学意义（P < 0.05），说明它们对华法林用药剂量的影响相对较强；上述四因素对华法林用药剂量的影响程度（r2）分别为1.2%、26.5%、43.4%和5.0%。并由此推导出回归方程：Y=1.963-0.986×（CYP2C9*3）+0.893×（VKORC1-1639）+0.002×（华法林血药浓度）-0.019×（年龄），F值为26.146，P=0.000，说明逐步拟合的多元线性回归方程差异有统计学意义。r2=0.516，说明该回归方程可解释约51.6%华法林剂量个体差异。
表6
多元线性回归分析结果
3 讨论
心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜结构及功能损害的有效手段，我国每年瓣膜疾病总的手术量20余万例[10]，占成人心脏外科手术第一位。国内瓣膜置换手术的病因以风湿性瓣膜疾病为主，患者的平均年龄较轻，选用心脏机械瓣膜的比例高达85%以上[2]，术后必须终身抗凝治疗。华法林在临床治疗过程中，造成其用量个体差异的原因很多，可分为遗传因素和非遗传因素[3]。因此本研究以心脏瓣膜置换术后患者作为研究对象，研究VKORC1和CYP2C9等基因多态性与中国人华法林剂量个体差异的相关性，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄、体重等非遗传因素，探讨建立华法林合理用药剂量预测方法，其目标是确定明确的抗凝监测频率，并让剂量不稳定的患者在短时间内达到华法林用药剂量稳定，减少抗凝并发症的发生。
本研究结果可见：华法林用药剂量差异无统计学意义，这与国外的研究结果[11-12]比较一致。年龄对华法林用药剂量个体差异的影响是不可忽视的因素之一[11-14]，患者华法林用药剂量随年龄的增高有递减的趋势；此外，体表面积与华法林用药剂量也呈正性相关[15]，随着体表面积的增加，华法林用药剂量则增大。然而，非遗传因素只是导致华法林用量个体差异大的部分原因。
随着华法林药理作用分子机制的阐明和药物基因组学的发展，目前国内外多项研究显示遗传因素是造成华法林用量个体差异主要因素，其中CYP2C9和VKORC1基因多态性是影响华法林剂量重要的遗传因素[16]。据美国FDA推荐指南，CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6对华法林剂量的个体差异性影响较大。本研究对剂量不稳定组进行CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6三个位点的基因检测，说明三种基因的突变率较低，对华法林用量及不良反应无明显影响。CYP2C9*3以野生型（*1/*1型）为主，占总数的93.2%，CYP2C9*3基因突变型（*1/*3型）频率为6.8%，与文献报道[17]基本一致。CYP2C9*3的突变型编码的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[18]，CYP酶活性降低，使患者体内华法林代谢速度减慢，导致有效血药浓度升高，进而使药物疗效增强。本组CYP2C9*1/*1基因型患者所需华法林用药剂量高于CYP2C9*1/*3基因型患者（P < 0.05）。因此，对国人来说，CYP2C9*1/*3基因型患者对华法林敏感，所需用药剂量较少，故在常规给药情况下容易导致使用初期出血率增加。
维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1 （VKORC1）基因编码维生素K环氧化物还原酶，其在肝脏维生素K循环中起重要作用，也是华法林结合的一个靶点，其基因突变导致华法林与其结合力降低，抗凝作用减弱[19]。本研究结果示：VKORC1-1639AA型79.61%，GA型18.45%，GG型1.94%，与文献报道基本一致，而西方高加索人群分别为16.3%，48.9%和36.7%[20]；且发现VKORC1-1639 （GG+AG）型患者需要的华法林剂量（4.42±2.07）mg/d明显高于基因型为AA患者（2.62±0.87）mg/d （P < 0.01），这一分布规律与临床观察到的种族之间华法林用药剂量的差异一致，即中国汉族人群华法林用药剂量明显低于高加索人，这也是亚洲人群抗凝治疗华法林用药剂量较少的内在原因。因此，对于汉族人来说，在达到相同的抗凝强度时，VKORC1基因发生变异的患者需要更高的华法林用药剂量。
CYP2C9基因型对华法林血药浓度几乎无影响，VKORC1基因型和CYP4F2基因型华法林血药浓度影响较大。通过监测血药浓度可以准确稳定、定量地监测抗凝治疗，我们建议将INR在1.5～2.5范围内，达到华法林用药剂量稳定的心脏机械瓣膜置换术后患者的血药浓度监测指标建立在700～1 800 ng/ml区间。华法林血药浓度与VKORC1基因型的多态性有较好的相关性，鉴于华法林血药浓度检测价格低廉、简便易行，临床上可部分取代基因检测，了解华法林用药剂量个体性差异。
本研究通过心脏瓣膜置换术后患者华法林用药剂量与基因型关系的分析，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄、体表面积等非遗传因素，探讨了华法林用药剂量预测方法，部分揭示了不同人群用药剂量个体差异性的原因。更精确的预测方法的建立，仍需大样本多中心临床研究。口服华法林前若能对患者进行基因学检测，并根据其基因分型指导华法林的用药剂量，势必会减少抗凝相关并发症的发生，避免多次华法林剂量调整带来出血或栓塞并发症的发生以及经济负担，从而节约医疗资源，达到个体化用药的目的。
华法林是属香豆素类口服抗凝剂，心脏机械瓣膜置换术( mechanical heart valve replacement，MHVR)及部分生物瓣膜置换术后患者均需终身服用华法林行抗凝治疗，然而该药治疗窗窄，其个体剂量差异可以相差多达20倍以上[1]，治疗不当导致的出血与栓塞成为机械瓣膜置换术后最常见的严重并发症[2]。华法林在临床治疗过程中，造成其剂量个体差异的原因很多，可分为遗传因素和非遗传因素[3]。从华法林药动学和药效学研究结果显示，CYP2C9和VKORC1基因多态性是影响华法林剂量重要的遗传因素。结合年龄和体重等非遗传因素，VKORC1和CYP2C9基因多态性可解释50%～60%的华法林剂量个体差异[4-6]。目前研究结果证实，利用药物基因组学信息和临床相关特征建立的华法林用药剂量运算预测模型能够更准确地估计其用药剂量，降低治疗开始阶段抗凝治疗过量导致的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。尽管如此，很多研究仍存在方法上的限制，如未纳入凝血因子、血药浓度等与华法林药效学和药代学密切相关的检测指标以及其他影响华法林用药剂量变异的因素。此外，这些研究纳入的患者多为高加索人、非洲人，亚洲人种样本量较少。与高加索人相比，汉族人在抗凝治疗过程中更容易发生出血并发症而较少发生栓塞并发症，目前国内多采用低强度抗凝治疗[国际标准化比值（INR）1.5～2.5）]，但该治疗的基础研究如基因多态性与个体化抗凝治疗的关系目前甚少报道。本研究以心脏瓣膜置换术后患者作为研究对象，明确VKORC1和CYP2C9等基因多态性与中国人华法林剂量个体差异的相关性，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄及体表面积等非遗传因素，预测患者华法林抗凝治疗的合理用药剂量，实现抗凝监测的个体化管理，减少其并发症的发生。
1 资料与方法
1.1 研究对象和分组
1.1.1 临床资料
连续性纳入《中国人心脏瓣膜置换术后抗凝治疗数据库》中2011年1月1日至2012年12月31日在四川大学华西医院行心脏瓣膜置换术、术后服用华法林行抗凝治疗并接受抗凝监测INR的患者103例，其中男32例、女71例，年龄21～85 （48.64±11.66）岁；身高147～180 （160.59±6.89）cm，体重43～78 （57.17±8.38）kg；华法林用药剂量为0.62～10.00 （2.99±1.41) mg/d；抗凝强度INR目标值：主动脉瓣置换术（AVR）1.5～1.8，二尖瓣置换术（MVR）及双瓣（主动脉瓣和二尖瓣）置换术（DVR）1.8～2.0，三尖瓣置换术（TVR）（含其他瓣膜置换）2.0～2.5，患者均未发生出血或者栓塞等并发症。
1.1.2 分组
按INR实测值在其目标值范围的频数（time within therapeutic INR target range，TTR）的高低将患者分为剂量稳定组（TTR > 75.7%）与不稳定组（TTR < 75.7%）[7]；再将稳定组按华法林剂量分为低剂量组（< 2.5 mg/d），中剂量组（2.5～5.0 mg/d）与高剂量组（> 5.0 mg/d）三组[8]；最后按CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）两个基因的突变情况将患者分为CYP2C9*1/*1组、CYP2C9*1/*3组和CYP2C9* 3/* 3组以及VKORC1-1639AA组、VKORC1-1639AG组和VKORC1-1639GG组。
1.2 方法
每位患者抽取2 ml外周静脉全血，使用乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）抗凝。置于冰箱-20℃保存；基因组DNA的提取采用磁珠法，使用思洛生物技术股份有限公司的SnoMag Blood DNA Extraction Kit来提取患者基因组DNA，-20℃冷冻保存；分批将提取好的患者基因组DNA进行CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）位点聚合酶链反应（PCR），对所需片段进行扩增，采用限制性片段长度多态性（RFLP）方法和测序技术对患者进行基因检测。在基因检测的同时，抽取2 ml外周静脉全血，使用Sysmex CA7000 analyser试剂盒（Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany）检测凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅳ、Ⅹ活性。将服用华法林钠片（山东齐鲁制药厂，2.5 mg/片）治疗2个月后的患者，在早晨同一时间（与测定PT-INR同一时间）采用超高效液相色谱法（HPLC）[9]检测患者华法林血药浓度。
1.3 统计学分析
计量资料用均数±标准差（x±s）表示，计数资料用频数、频率表示。计量资料的比较采用t检验或方差分析，计数资料的比较使用χ2检验。将年龄与华法林用药剂量进行单因素方差分析，多因素线性回归方法分析探讨各因素对华法林用药剂量影响的程度，用决定系数r2表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 华法林用药剂量与性别、年龄、体重、身高等之间的相关性
男性患者华法林用药剂量（3.08±1.15）mg/d，女性患者华法林用药剂量（2.95±1.51）mg/d，不同性别间华法林用药剂量差异无统计学意义（P > 0.05）。
103例患者按年龄段分为20～29岁、30～39岁、40～49岁、50～59岁、60～69岁以及> 70岁共6组（表 1），ANOVA分析结果显示各年龄组之间华法林用药剂量差异均有统计学意义（P < 0.05），患者华法林用药剂量随年龄的增高有递减的趋势。
表1
不同年龄组华法林用药剂量情况（x±s）
体表面积（body surface area，BSA)是由体重和身高计算得出。体表面积与华法林用药剂量的相关性采用直线回归进行检验，以体表面积为自变量，华法林用药剂量为应变量，拟建立一个直线回归方程：Y=2.047X-0.463，经方差分析示：F=3.972，P=0.049，该方程式成立，故可认为华法林用药剂量与体表面积之间有直线关系（图 1），体表面积每增加1 m2，华法林用药剂量的需求相应增加2.047 mg。
图1
体表面积对华法林用药剂量的影响
2.2 不同组别的华法林用药剂量与基因多态性和华法林血药浓度之间的关系
比较剂量稳定组和剂量不稳定组的华法林用药剂量与基因多态性的关系（表 2），结果显示：剂量稳定组中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG所占比例分别为84.95%、15.05%和0.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3基因型所占比例分别为96.77%和3.23%，未发现CYP2C9*3/*3基因型。剂量不稳定组中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分别为30.00%、50.00%和20.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP-2C9*1/*3基因型所占比例分别为60.00%和40.00%，未发现CYP2C9*3/*3基因型。对剂量不稳定组的患者加做CYP4F2、GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6基因位点检测。发现（1）GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6四个基因位点突变率为0，（2）CYP4F2的突变率较高，其中CYP4F2TT和CYP4F2CT均为30.00%。
表2
华法林剂量稳定组与不稳定组患者基因多态性比较[例（%）]
比较低剂量组、中剂量组和高剂量组患者的基因多态性及华法林血药浓度（表 3），结果显示：低剂量组中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AA为主，所占比例为93.75%，VKORC1-1639AG基因型为6.25%，而VKORC1-1639GG基因型为0.00，CYP2C9*1/*3基因型较高，为12.50%；中等剂量组中，VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分别为81.25%、17.19%和1.56%，CYP2C9*1/*3基因型为4.69%；高剂量组中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG为主，分别占85.71%、14.29%，CYP2C9*1/*3基因型为0；各组均未发现CYP2C9*3/*3基因型。
表3
华法林不同剂量组别患者基因多态性比较[例（%）]
2.3 华法林用药剂量与基因多态性之间的相关性
对103例患者根据CYP2C9 （rs1057910）、VKORC （rs9923231）两个基因的突变情况进行分组，比较每组的华法林用药剂量与基因多态性的关系，结果显示：CYP2C9*1/*3基因型患者所需的华法林用药剂量为（2.43±1.08）mg/d，显著低于CYP2C9*1/*1基因型患者[（3.03±1.42）mg/d，P=0.001]。VKORC1-1639GG基因型患者所需华法林用药剂量为（5.05±1.25）mg/d，AG基因型为（4.35±2.15）mg/d，AA基因型为（2.62±0.87）mg /d，差异有统计学意义（P < 0.05），VKORC1-1639 AG基因型和GG基因型患者所需华法林用药剂量大于VKORC1-1639 AA基因型患者（表 4）。
表4
基因多态性对患者华法林用药剂量的影响（x±s）
2.4 华法林用药剂量与血药浓度、凝血因子及基因多态性之间的关系
心脏瓣膜置换术后患者达到稳定INR后，华法林血药浓度平均值为484.5～2 788.5 （1 202.68±434.95）ng/ml （图 2）。本组华法林血药浓度主要集中在700～1 800 ng/ml区间中，随访中所有患者均无出血及栓塞等抗凝并发症发生。
图2
103例心脏瓣膜置换术后患者华法林血药浓度
不同基因型患者分组比较华法林用药剂量与血药浓度之间的关系（表 5）。就CYP2C9基因型分组分析可见，CYP2C9*1/*1组的患者华法林用药剂量（3.03±1.42）mg/d比CYP2C9*1/*3组的华法林用药剂量（2.42±1.08）mg/d明显增高（P < 0.05），但两组患者的华法林血药浓度差异无统计学意义（P > 0.05）。而对于VKORC1基因型分组分析可见，患者华法林用药剂量及血药浓度在VKORC1-1639AA组、VKORC1-1639AG组及VKORC1-1639GG组中均呈递增状态，组间剂量差异有统计学意义（P < 0.05）。
表5
不同基因型患者华法林用药剂量与血药浓度的关系（x±s）
2.5 多元线形回归分析
本研究以华法林用药剂量为因变量（Y），以年龄、性别、体表面积、华法林血药浓度、凝血因子活性和基因型等为自变量，进行多元线性回归分析结果（表 6）显示：性别、体表面积和凝血因子活性与华法林用药剂量差异无统计学意义（P > 0.05），说明上述三因素对华法林用药剂量的影响相对较弱；CYP2C9 *3、VKORC1-1639、华法林血药浓度及年龄与华法林用药剂量差异有统计学意义（P < 0.05），说明它们对华法林用药剂量的影响相对较强；上述四因素对华法林用药剂量的影响程度（r2）分别为1.2%、26.5%、43.4%和5.0%。并由此推导出回归方程：Y=1.963-0.986×（CYP2C9*3）+0.893×（VKORC1-1639）+0.002×（华法林血药浓度）-0.019×（年龄），F值为26.146，P=0.000，说明逐步拟合的多元线性回归方程差异有统计学意义。r2=0.516，说明该回归方程可解释约51.6%华法林剂量个体差异。
表6
多元线性回归分析结果
3 讨论
心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜结构及功能损害的有效手段，我国每年瓣膜疾病总的手术量20余万例[10]，占成人心脏外科手术第一位。国内瓣膜置换手术的病因以风湿性瓣膜疾病为主，患者的平均年龄较轻，选用心脏机械瓣膜的比例高达85%以上[2]，术后必须终身抗凝治疗。华法林在临床治疗过程中，造成其用量个体差异的原因很多，可分为遗传因素和非遗传因素[3]。因此本研究以心脏瓣膜置换术后患者作为研究对象，研究VKORC1和CYP2C9等基因多态性与中国人华法林剂量个体差异的相关性，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄、体重等非遗传因素，探讨建立华法林合理用药剂量预测方法，其目标是确定明确的抗凝监测频率，并让剂量不稳定的患者在短时间内达到华法林用药剂量稳定，减少抗凝并发症的发生。
本研究结果可见：华法林用药剂量差异无统计学意义，这与国外的研究结果[11-12]比较一致。年龄对华法林用药剂量个体差异的影响是不可忽视的因素之一[11-14]，患者华法林用药剂量随年龄的增高有递减的趋势；此外，体表面积与华法林用药剂量也呈正性相关[15]，随着体表面积的增加，华法林用药剂量则增大。然而，非遗传因素只是导致华法林用量个体差异大的部分原因。
随着华法林药理作用分子机制的阐明和药物基因组学的发展，目前国内外多项研究显示遗传因素是造成华法林用量个体差异主要因素，其中CYP2C9和VKORC1基因多态性是影响华法林剂量重要的遗传因素[16]。据美国FDA推荐指南，CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6对华法林剂量的个体差异性影响较大。本研究对剂量不稳定组进行CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6三个位点的基因检测，说明三种基因的突变率较低，对华法林用量及不良反应无明显影响。CYP2C9*3以野生型（*1/*1型）为主，占总数的93.2%，CYP2C9*3基因突变型（*1/*3型）频率为6.8%，与文献报道[17]基本一致。CYP2C9*3的突变型编码的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[18]，CYP酶活性降低，使患者体内华法林代谢速度减慢，导致有效血药浓度升高，进而使药物疗效增强。本组CYP2C9*1/*1基因型患者所需华法林用药剂量高于CYP2C9*1/*3基因型患者（P < 0.05）。因此，对国人来说，CYP2C9*1/*3基因型患者对华法林敏感，所需用药剂量较少，故在常规给药情况下容易导致使用初期出血率增加。
维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1 （VKORC1）基因编码维生素K环氧化物还原酶，其在肝脏维生素K循环中起重要作用，也是华法林结合的一个靶点，其基因突变导致华法林与其结合力降低，抗凝作用减弱[19]。本研究结果示：VKORC1-1639AA型79.61%，GA型18.45%，GG型1.94%，与文献报道基本一致，而西方高加索人群分别为16.3%，48.9%和36.7%[20]；且发现VKORC1-1639 （GG+AG）型患者需要的华法林剂量（4.42±2.07）mg/d明显高于基因型为AA患者（2.62±0.87）mg/d （P < 0.01），这一分布规律与临床观察到的种族之间华法林用药剂量的差异一致，即中国汉族人群华法林用药剂量明显低于高加索人，这也是亚洲人群抗凝治疗华法林用药剂量较少的内在原因。因此，对于汉族人来说，在达到相同的抗凝强度时，VKORC1基因发生变异的患者需要更高的华法林用药剂量。
CYP2C9基因型对华法林血药浓度几乎无影响，VKORC1基因型和CYP4F2基因型华法林血药浓度影响较大。通过监测血药浓度可以准确稳定、定量地监测抗凝治疗，我们建议将INR在1.5～2.5范围内，达到华法林用药剂量稳定的心脏机械瓣膜置换术后患者的血药浓度监测指标建立在700～1 800 ng/ml区间。华法林血药浓度与VKORC1基因型的多态性有较好的相关性，鉴于华法林血药浓度检测价格低廉、简便易行，临床上可部分取代基因检测，了解华法林用药剂量个体性差异。
本研究通过心脏瓣膜置换术后患者华法林用药剂量与基因型关系的分析，结合凝血因子活性和华法林血药浓度、年龄、体表面积等非遗传因素，探讨了华法林用药剂量预测方法，部分揭示了不同人群用药剂量个体差异性的原因。更精确的预测方法的建立，仍需大样本多中心临床研究。口服华法林前若能对患者进行基因学检测，并根据其基因分型指导华法林的用药剂量，势必会减少抗凝相关并发症的发生，避免多次华法林剂量调整带来出血或栓塞并发症的发生以及经济负担，从而节约医疗资源，达到个体化用药的目的。
