引用本文： 汪志海, 李忠, 杨清杰, 郭明. Ovol2基因的过表达抑制肺腺癌细胞远处转移及侵袭力的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(2): 173-177. doi: 10.7507/1007-4848.20160038 复制
Ovo基因编码一组在进化上从果蝇、线虫、斑马鱼到哺乳动物保守的蛋白家族，该蛋白家族为含有4个DNA结合的C2H2锌指蛋白的转录因子。现已发现的Ovo基因家族中，老鼠的Ovol1基因在表皮分化和精子形成时发挥重要作用；Ovol2基因则在胚胎发育中发挥重要作用[1-2]。研究发现，Ovol2基因敲除小鼠会在胚胎第10 d死亡，表明其参与了更重要的发育过程。深入研究，发现Ovol2还参与胚胎早期神经管的发生[3]。在人体内含有3个Ovo基因（Ovol1、Ovol2和Ovol3)。研究发现，人体Ovol2基因与血管形成以及心脏、胎盘发育密切相关[4]。张婷等[5]的研究表明：Ovol2作为骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路下游的一个重要靶基因，可以抑制神经分化和促进中内胚层的分化。
上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在一些因素的作用下，细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接逐渐丧失，获得侵袭性和远处迁移能力，细胞凋亡被抑制，同时细胞分泌大量细胞外基质成分，具有间质细胞形态和特性的过程[6]。这一过程典型的变化是上调间充质细胞表型的标记如波形蛋白（vimentin），下调上皮细胞表型的标记如E-钙粘蛋白（E-cadherin）[7]。研究指出，EMT能够诱导极化的上皮细胞向间充质细胞转化，在胚胎发育过程中具有重要作用[8]。同时，EMT在乳腺癌、肺癌、结肠癌及肝癌等多种肿瘤的原发性浸润和继发性远处转移中也发挥重要作用。Roca等[9]指出Ovol2基因作为一种转录抑制因子，在肿瘤细胞的间充质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）中发挥重要作用，MET是EMT的逆反过程。因此，研究其在EMT中的作用及其机制将会对寻找恶性肿瘤潜在的治疗靶点提供一定的理论依据[10-11]。根据现有研究报道，我们提出这样的假设：肺癌细胞的转移和侵袭能力可能与Ovol2的表达水平有关，Ovol2高表达的肺癌可能通过抑制EMT使肿瘤细胞的侵袭力和转移力下降。因此，我们通过体外培养肺腺癌细胞株A549，研究Ovol2基因对肺腺癌侵袭及远处转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
A549细胞购买自中国科学院上海细胞库。PLV-BSD-Control和PLV-BSD-Ovol2质粒由实验室保存提供。转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购买自invitrogen公司。DMEM培养基购买自Hyclone公司。兔抗人Ovol2抗体购自abcam公司（货号：ab101580），兔抗人E-钙粘蛋白抗体购自CST公司（货号3195P）、兔抗人N-钙黏蛋白抗体购自Santa Cruz公司（货号sc-7939），兔抗人波形蛋白抗体购自CST公司（货号5741S）。RT-PCR引物序列如下：E-钙粘蛋白F：5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3'，R：5'-CTTCCGAAAAGAAGG-CTGTCC-3'；N-钙粘蛋白F：5'-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3'，R：5'-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3'；波形蛋白F：5'-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3'；R：5'-GATT-CCACTTTCCGT-TCAAGGT-3'；Twist1 F：5'-CGGG-TCATGGCTAACGTG-3', R:5'-CAGCTTGCCATCTT-GGAGTC-3'。
1.2 慢病毒的构建和检测
慢病毒构建采用人胚肾细胞293T（实验室保留）、包装质粒PSP和PMD（实验室保留并转化）及TurboFect转染试剂购自Thermo Scientific公司。10 cm皿培养293T细胞至70%～80%细胞密度，提前更换无血清DMEM培养基，按照混合质粒（目的质粒10μg、PSP 7.5μg、PHR 5μg、Opti-MEM 1 000μl，Turbo 40～50μl）和Turbo转染试剂，静置20 min后，逐滴加入培养皿，16 h后更换含血清及双抗培养基约15 ml。放入37℃，5%CO2培养箱36～48 h收取病毒并过滤分装待用。
应用Real-time PCR及Western blot检测病毒效率。用分装好的病毒感染细胞（6孔板，1 ml/孔）后收取细胞，分别提取RNA和蛋白。检测结果如图 1。
图1
通过Real-time PCR and Western免疫蛋白印迹检测慢病毒有效性
1.3 细胞培养与处理
胞系A549应用加有10%胎牛血清（Hyclone公司产品）及双抗（100×）的DMEM培养基，37℃，5% CO2。分组依据如下：①对照组：感染慢病毒LV-BSD-Control，不影响Ovol2表达水平。②实验组：感染慢病毒LV-BSD-Ovol2，Ovol2基因过表达。
1.4 实时荧光定量PCR检测EMT相关基因mRNA表达水平变化
实验组和对照组总RNA采用TRIzol试剂（购自Invitrogen公司）提取，再反转成cDNA（反转试剂盒工购自北京全式金生物公司），采用25μl体系上机。真核生物核糖体RNA 18s基因作为内参基因，结果采用分析△△CT（CT值为PCR循环数）方法。
1.5 蛋白印迹检测EMT相关蛋白表达水平
实验组、对照组感染病毒后48 h，提取蛋白，按照实验室操作指南检测Ovol2、E-钙粘蛋白及波形蛋白的表达水平。
1.6 肺癌细胞体外侵袭及转移能力
划痕实验首先将25μl基质胶（100μlMatrigel+300μl无血清培养基）加入小室（Millipore公司8.0μm聚碳酸酯膜）的上室，培养箱30 min后凝结成胶，调整实验组及对照组细胞悬液密度至1～10×105，接种至上室，48 h后显微镜下观察通过聚碳酸酯膜的细胞数。侵袭实验则是将相同密度实验组及对照组细胞接种至3.5 cm皿，用枪头从细胞中间垂直划痕（可以平行划痕几条），更换无血清培养基，分别在1 d、2 d、3 d及4 d后观察拍照。
2 结果
2.1 Ovol2抑制EMT相关基因的表达
2.1.1 Real-time PCR检测EMT相关基因mRNA表达水平变化
研究Ovol2与肺癌细胞EMT过程的关系，首先提取实验组和对照组细胞RNA，反转成cDNA再通过Real-time PCR检测E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白以及Twist 1的mRNA表达水平。其中，E-钙粘蛋白是位于细胞膜上面的钙黏蛋白，是EMT过程的重要标记蛋白。在上皮细胞发生间质细胞表型转化以及癌症发生过程中，经常会发现E-钙粘蛋白表达的下调[12-13]。N-钙粘蛋白、波形蛋白和Twist 1均是与EMT相关的重要转录因子。结果显示，E-钙粘蛋白表达上调，而N-钙粘蛋白、波形蛋白和Twist 1的表达被抑制，见图 2。
图2
A549细胞被对照和慢病毒过表达Ovol2转染后E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和Twist 1的mRNA表达变化
2.1.2 Western蛋白印迹法检测EMT相关蛋白表达
水平变化慢病毒感染肺腺癌细胞36～48 h后收取细胞、提取蛋白样品，应用Western Blot实验检测E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达水平。结果显示，E-钙粘蛋白的表达水平上升，波形蛋白的表达下降，与Real-time PCR结果一致，见图 3。
图3
蛋白质印迹法检测慢病毒感染肺腺癌细胞的蛋白质表达水平
2.2 Ovol2抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
划痕实验结果显示：实验组细胞的划痕愈合被抑制、甚至不愈合；侵袭实验结果显示：实验组穿过Matrigel基质胶的细胞数明显少于对照组。因此，我们认为，过表达Ovol2可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，见图 4。
图4
过表达Ovol2可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
Figure4.
A为划痕实验结果; B为侵袭实验结果
3 讨论
肺癌发病率及死亡率均已上升为恶性肿瘤的第一位，其中非小细胞肺癌占80%～90%[14]。在过去的30年，肺癌的死亡率上升了465%；《2012中国肿瘤登记年报》显示，我国每年新发肿瘤病例约312万例，平均每天8 550例，其中发病第一位的就是肺癌[15]。近年来，对肺癌的研究逐渐深入、临床治疗策略在不断发展，但是肺癌的预后依然不容乐观。报道[16]显示其5年生存率仅有11%。Gaorav等[17]指出：肿瘤相关的死亡病例中80%与其远处转移有关。目前大量的研究均指出：发生EMT现象是恶性肿瘤远处转移的关键步骤[18]。因此，研究肺腺癌EMT过程的影响因素及机制，将为其多元化治疗带来一定的理论基础。
EMT作为一种在人体内普遍的、功能多样的可逆过程，影响及调控的因素有很多。涉及的信号通路包括转化生长因子-β（TGF-β）、Wnt、Hedgehog、Notch和NFkB[19]。同时，EMT的调控是一种涉及到肿瘤细胞外微环境的改变、肿瘤细胞快速生长导致缺氧等因素的瞬时调控，而不是永久的遗传学改变[20]，机制更加复杂，也许会涉及到多种转录因子间的相互作用。Larue等[21]就曾指出转录因子Snail、Twist和ZEB-2是作用于基因CDH 1，从而抑制其表达E-钙粘蛋白来促进EMT。而Ovol2作为一种参与多种基因调控的锌指转录因子，在哺乳动物的生长发育过程中发挥着重要作用。研究表明，Ovol2是一些重要的调控生长发育的信号通路如Wnt、BMP和TGF-β的下游靶基因[22-23]。这些信号通路均与EMT的激活和调控有关[24]。但是关于Ovol2基因与恶性肿瘤EMT过程的相关研究依然较少。Watanabe等研究发现Ovol 2能通过抑制Zeb 1、Zeb 2、Twist 1和Snail 1来抑制乳腺细胞的EMT过程，并且可以促进乳腺癌细胞发生MET过程来继续保持上皮细胞表型[25]。吴跃超等的研究发现Ovol 2能够抑制TGF-β信号通路中重要成员Smad 4的表达，从而抑制大肠癌的EMT过程[26]。
现有研究结果[27-29]表明，肺腺癌也发生着EMT，也存在着标记蛋白的表达改变。进一步研究[30-31]表明：E-钙粘蛋白的上调以及波形蛋白的下调与其淋巴结转移和病理分期相关；而Twist 1和Snail 1的高表达则会促进其发生EMT，并在其远处转移和预后中发挥重要作用。但对于其机制的研究甚少。通过研究，我们初步明确了Ovol 2基因的高表达可使肺腺癌细胞的EMT过程受到抑制，细胞的侵袭力和转移能力下降。对于Ovol 2基因抑制EMT的作用机制，我们将在后续的实验中进一步研究，以期能为为肺腺癌的靶向治疗提供一定的理论基础。
Ovo基因编码一组在进化上从果蝇、线虫、斑马鱼到哺乳动物保守的蛋白家族，该蛋白家族为含有4个DNA结合的C2H2锌指蛋白的转录因子。现已发现的Ovo基因家族中，老鼠的Ovol1基因在表皮分化和精子形成时发挥重要作用；Ovol2基因则在胚胎发育中发挥重要作用[1-2]。研究发现，Ovol2基因敲除小鼠会在胚胎第10 d死亡，表明其参与了更重要的发育过程。深入研究，发现Ovol2还参与胚胎早期神经管的发生[3]。在人体内含有3个Ovo基因（Ovol1、Ovol2和Ovol3)。研究发现，人体Ovol2基因与血管形成以及心脏、胎盘发育密切相关[4]。张婷等[5]的研究表明：Ovol2作为骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路下游的一个重要靶基因，可以抑制神经分化和促进中内胚层的分化。
上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在一些因素的作用下，细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接逐渐丧失，获得侵袭性和远处迁移能力，细胞凋亡被抑制，同时细胞分泌大量细胞外基质成分，具有间质细胞形态和特性的过程[6]。这一过程典型的变化是上调间充质细胞表型的标记如波形蛋白（vimentin），下调上皮细胞表型的标记如E-钙粘蛋白（E-cadherin）[7]。研究指出，EMT能够诱导极化的上皮细胞向间充质细胞转化，在胚胎发育过程中具有重要作用[8]。同时，EMT在乳腺癌、肺癌、结肠癌及肝癌等多种肿瘤的原发性浸润和继发性远处转移中也发挥重要作用。Roca等[9]指出Ovol2基因作为一种转录抑制因子，在肿瘤细胞的间充质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）中发挥重要作用，MET是EMT的逆反过程。因此，研究其在EMT中的作用及其机制将会对寻找恶性肿瘤潜在的治疗靶点提供一定的理论依据[10-11]。根据现有研究报道，我们提出这样的假设：肺癌细胞的转移和侵袭能力可能与Ovol2的表达水平有关，Ovol2高表达的肺癌可能通过抑制EMT使肿瘤细胞的侵袭力和转移力下降。因此，我们通过体外培养肺腺癌细胞株A549，研究Ovol2基因对肺腺癌侵袭及远处转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
A549细胞购买自中国科学院上海细胞库。PLV-BSD-Control和PLV-BSD-Ovol2质粒由实验室保存提供。转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购买自invitrogen公司。DMEM培养基购买自Hyclone公司。兔抗人Ovol2抗体购自abcam公司（货号：ab101580），兔抗人E-钙粘蛋白抗体购自CST公司（货号3195P）、兔抗人N-钙黏蛋白抗体购自Santa Cruz公司（货号sc-7939），兔抗人波形蛋白抗体购自CST公司（货号5741S）。RT-PCR引物序列如下：E-钙粘蛋白F：5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3'，R：5'-CTTCCGAAAAGAAGG-CTGTCC-3'；N-钙粘蛋白F：5'-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3'，R：5'-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3'；波形蛋白F：5'-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3'；R：5'-GATT-CCACTTTCCGT-TCAAGGT-3'；Twist1 F：5'-CGGG-TCATGGCTAACGTG-3', R:5'-CAGCTTGCCATCTT-GGAGTC-3'。
1.2 慢病毒的构建和检测
慢病毒构建采用人胚肾细胞293T（实验室保留）、包装质粒PSP和PMD（实验室保留并转化）及TurboFect转染试剂购自Thermo Scientific公司。10 cm皿培养293T细胞至70%～80%细胞密度，提前更换无血清DMEM培养基，按照混合质粒（目的质粒10μg、PSP 7.5μg、PHR 5μg、Opti-MEM 1 000μl，Turbo 40～50μl）和Turbo转染试剂，静置20 min后，逐滴加入培养皿，16 h后更换含血清及双抗培养基约15 ml。放入37℃，5%CO2培养箱36～48 h收取病毒并过滤分装待用。
应用Real-time PCR及Western blot检测病毒效率。用分装好的病毒感染细胞（6孔板，1 ml/孔）后收取细胞，分别提取RNA和蛋白。检测结果如图 1。
图1
通过Real-time PCR and Western免疫蛋白印迹检测慢病毒有效性
1.3 细胞培养与处理
胞系A549应用加有10%胎牛血清（Hyclone公司产品）及双抗（100×）的DMEM培养基，37℃，5% CO2。分组依据如下：①对照组：感染慢病毒LV-BSD-Control，不影响Ovol2表达水平。②实验组：感染慢病毒LV-BSD-Ovol2，Ovol2基因过表达。
1.4 实时荧光定量PCR检测EMT相关基因mRNA表达水平变化
实验组和对照组总RNA采用TRIzol试剂（购自Invitrogen公司）提取，再反转成cDNA（反转试剂盒工购自北京全式金生物公司），采用25μl体系上机。真核生物核糖体RNA 18s基因作为内参基因，结果采用分析△△CT（CT值为PCR循环数）方法。
1.5 蛋白印迹检测EMT相关蛋白表达水平
实验组、对照组感染病毒后48 h，提取蛋白，按照实验室操作指南检测Ovol2、E-钙粘蛋白及波形蛋白的表达水平。
1.6 肺癌细胞体外侵袭及转移能力
划痕实验首先将25μl基质胶（100μlMatrigel+300μl无血清培养基）加入小室（Millipore公司8.0μm聚碳酸酯膜）的上室，培养箱30 min后凝结成胶，调整实验组及对照组细胞悬液密度至1～10×105，接种至上室，48 h后显微镜下观察通过聚碳酸酯膜的细胞数。侵袭实验则是将相同密度实验组及对照组细胞接种至3.5 cm皿，用枪头从细胞中间垂直划痕（可以平行划痕几条），更换无血清培养基，分别在1 d、2 d、3 d及4 d后观察拍照。
2 结果
2.1 Ovol2抑制EMT相关基因的表达
2.1.1 Real-time PCR检测EMT相关基因mRNA表达水平变化
研究Ovol2与肺癌细胞EMT过程的关系，首先提取实验组和对照组细胞RNA，反转成cDNA再通过Real-time PCR检测E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白以及Twist 1的mRNA表达水平。其中，E-钙粘蛋白是位于细胞膜上面的钙黏蛋白，是EMT过程的重要标记蛋白。在上皮细胞发生间质细胞表型转化以及癌症发生过程中，经常会发现E-钙粘蛋白表达的下调[12-13]。N-钙粘蛋白、波形蛋白和Twist 1均是与EMT相关的重要转录因子。结果显示，E-钙粘蛋白表达上调，而N-钙粘蛋白、波形蛋白和Twist 1的表达被抑制，见图 2。
图2
A549细胞被对照和慢病毒过表达Ovol2转染后E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和Twist 1的mRNA表达变化
2.1.2 Western蛋白印迹法检测EMT相关蛋白表达
水平变化慢病毒感染肺腺癌细胞36～48 h后收取细胞、提取蛋白样品，应用Western Blot实验检测E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达水平。结果显示，E-钙粘蛋白的表达水平上升，波形蛋白的表达下降，与Real-time PCR结果一致，见图 3。
图3
蛋白质印迹法检测慢病毒感染肺腺癌细胞的蛋白质表达水平
2.2 Ovol2抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
划痕实验结果显示：实验组细胞的划痕愈合被抑制、甚至不愈合；侵袭实验结果显示：实验组穿过Matrigel基质胶的细胞数明显少于对照组。因此，我们认为，过表达Ovol2可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，见图 4。
图4
过表达Ovol2可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
Figure4.
A为划痕实验结果; B为侵袭实验结果
3 讨论
肺癌发病率及死亡率均已上升为恶性肿瘤的第一位，其中非小细胞肺癌占80%～90%[14]。在过去的30年，肺癌的死亡率上升了465%；《2012中国肿瘤登记年报》显示，我国每年新发肿瘤病例约312万例，平均每天8 550例，其中发病第一位的就是肺癌[15]。近年来，对肺癌的研究逐渐深入、临床治疗策略在不断发展，但是肺癌的预后依然不容乐观。报道[16]显示其5年生存率仅有11%。Gaorav等[17]指出：肿瘤相关的死亡病例中80%与其远处转移有关。目前大量的研究均指出：发生EMT现象是恶性肿瘤远处转移的关键步骤[18]。因此，研究肺腺癌EMT过程的影响因素及机制，将为其多元化治疗带来一定的理论基础。
EMT作为一种在人体内普遍的、功能多样的可逆过程，影响及调控的因素有很多。涉及的信号通路包括转化生长因子-β（TGF-β）、Wnt、Hedgehog、Notch和NFkB[19]。同时，EMT的调控是一种涉及到肿瘤细胞外微环境的改变、肿瘤细胞快速生长导致缺氧等因素的瞬时调控，而不是永久的遗传学改变[20]，机制更加复杂，也许会涉及到多种转录因子间的相互作用。Larue等[21]就曾指出转录因子Snail、Twist和ZEB-2是作用于基因CDH 1，从而抑制其表达E-钙粘蛋白来促进EMT。而Ovol2作为一种参与多种基因调控的锌指转录因子，在哺乳动物的生长发育过程中发挥着重要作用。研究表明，Ovol2是一些重要的调控生长发育的信号通路如Wnt、BMP和TGF-β的下游靶基因[22-23]。这些信号通路均与EMT的激活和调控有关[24]。但是关于Ovol2基因与恶性肿瘤EMT过程的相关研究依然较少。Watanabe等研究发现Ovol 2能通过抑制Zeb 1、Zeb 2、Twist 1和Snail 1来抑制乳腺细胞的EMT过程，并且可以促进乳腺癌细胞发生MET过程来继续保持上皮细胞表型[25]。吴跃超等的研究发现Ovol 2能够抑制TGF-β信号通路中重要成员Smad 4的表达，从而抑制大肠癌的EMT过程[26]。
现有研究结果[27-29]表明，肺腺癌也发生着EMT，也存在着标记蛋白的表达改变。进一步研究[30-31]表明：E-钙粘蛋白的上调以及波形蛋白的下调与其淋巴结转移和病理分期相关；而Twist 1和Snail 1的高表达则会促进其发生EMT，并在其远处转移和预后中发挥重要作用。但对于其机制的研究甚少。通过研究，我们初步明确了Ovol 2基因的高表达可使肺腺癌细胞的EMT过程受到抑制，细胞的侵袭力和转移能力下降。对于Ovol 2基因抑制EMT的作用机制，我们将在后续的实验中进一步研究，以期能为为肺腺癌的靶向治疗提供一定的理论基础。
