引用本文： 张峰懿, 李定彪, 范振宁, 江宇, 李振华. 阻断Wnt-1信号通路对裸鼠非小细胞肺癌的模型研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(6): 608-612. doi: 10.7507/1007-4848.20160144 复制
随着工业的发展和汽车数量的增多，城镇居民肺癌发病率呈逐年增高的趋势。肺癌是男性罹癌致死率最高的肿瘤[1]，其中约80%的患者是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。在西南边陲的云南省，有宣威和个旧两个著名的肺癌高发地。鉴于早期发现和早期诊断在世界范围内仍是未解决的难题，临床医师面对的仍然是大量中晚期肺癌的患者。因而在近几十年来，外科手术加术后化疗仍然是非小细胞肺癌治疗的主要手段[3]。针对非小细胞肺癌，昆明市某医院的研究显示在行根治性手术切除138例患者的5年生存率为44.8%[4]。在单纯的手术方面，伴随电视胸腔镜手术的飞速发展，手术已经基本可以切除无远处转移的低于ⅢB期的肺癌病灶[5]。因此，除了早期诊断和主要的手术治疗之外，药物治疗已经成为基础医学最重要的研究方向。
配合化疗的肺癌患者5年生存率明显提高，但现在作为一线治疗的化疗药物顺铂联合吉西他滨治疗肺癌患者主要不良反应为骨髓抑制及胃肠道反应。严重的不良反应可使阶段性治疗由于一些严重的副作用而暂停甚至终止，影响患者的住院治疗效果和生存率。另外，运用吉西他滨联合紫杉醇治疗非小细胞肺癌患者的1年生存率为46.4%，中位生存期为10.8个月，其副作用主要是骨髓抑制及周围神经毒性。在有效控制血小板和粒细胞的情况下，铂类肿瘤化疗药物等联合化疗方案对情况较差的老年晚期患者仍然不能耐受[6]。由此可见作为一线用药的铂类药物对晚期肺癌患者的有效性仍然有很大的提高空间。
鉴于这种现状，在基础研究方面，Wnt信号通路作为调控胚胎发育和肿瘤发生、发展的热点，越来越得到学界的重视[7]。有免疫组织化学试验研究显示，针对151例肺癌患者Wnt-1的过表达与肺癌的恶性增殖成正相关，其中61例肺癌患者（40.4%）wnt-1表达呈阳性[8]。
对于阻断Wnt-1信号通路对肺癌细胞影响的研究，国内外报道均比较少见。云南省的肺癌发病率和死亡率都居高不下，但针对地域性肺癌的基础研究工作较少。本实验通过对云南省宣威地区肺癌患者切除非小细胞肺癌的肺癌组织培养并接种于裸鼠内体，在活体动物生存期进行Wnt抗体的干涉来研究阻断Wnt信号通路对非小细胞肺癌的影响，以期相关的实验结果能对其临床应用提供理论帮助。
1 资料与方法
1.1 荷瘤鼠模型和细胞系来源
本次实验所用21只雄性Balb/c-Nu裸鼠（16～18 g）均购于北京华阜康生物科技有限公司。裸鼠喂养饲料：Co60灭菌饲料，购于北京华阜康生物科技有限公司。在取得知情同意后，收集昆明医科大学附属延安医院未经放、化疗的住院患者外科切除且病理诊断为非小细胞肺癌的肺癌组织。
1.2 主要试剂、仪器与设备
本次研究使用的主要试剂包括Wnt-1抗体（Milli pore公司）、多西他赛（多帕菲，昆明泽浩公司）、10%小牛血清的PMPI-1640培养基（Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、Hanks液（Sigma公司）。
本次研究所用主要仪器与设备包括二氧化碳细胞培养箱（德国Thermo Fisher Scientific）、倒置相差显微镜（日本Olympus）、超低温冰箱（美国Eectrolux公司）、高速冷冻台式离心机（美国Thermo公司）、高速离心机（美国Thermo公司）、精密电子天平FA2004（上海精科天平)、SPF级动物饲养实验室（昆医附属延安医院中心实验室）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及传代
将瘤组织切成1～2 mm3小块，用Hanks液洗3次，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶中，并将培养瓶置于37℃、5%CO2的普通恒温箱中培养。在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴30 min后液洗3次，盛于完全培养基并制成（5～10）×108个/L细胞浓度的悬液。在37℃、5%CO2含有10%小牛血清的PMPI-1640培养基培养并以此作为初代细胞。每3 d更换一次培养液，并观察、记录细胞贴壁生长情况。当细胞长满培养瓶时，用5 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min直至细胞呈球形回缩时加入5 ml培养液终止消化并将培养瓶中的悬浮液分装传代培养。将第五代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化5 min并加入无血清PMPI-1640液1 200转/min离心三次。
1.3.2 荷瘤模型的构建
在上述细胞液中加入生理盐水稀释至2×107个/ml，并在裸鼠背部皮下接种约0.1 ml细胞液。1周后接种部位均肉眼可见直径约3～5 mm肿瘤结节生长。将接种后的裸鼠置于适宜光照、温度、湿度条件下的SPF级动物饲养室内，定时给予饲料、蒸馏水，每天观察、记录裸鼠活动及死亡情况。间隔三天用游标卡尺测量接种小鼠背部肿瘤结节长径（a）与短径（b），用公式V=1/2ab2计算所测瘤体体积并绘制肿瘤时间-体积曲线。将16只小鼠背部瘤体直径达4 mm时设定为荷瘤第1天。在荷瘤第6天时将裸鼠按体重从小到大编为1～21号并随机分组（表 1）。
表1
裸鼠随机分组表
1.3.3 分组注射抗肿瘤药物
第6天时分别给予实验组、对照组、空白组小鼠背部肿瘤周边皮下注射Wnt-1抗体（0.2 ml/只）、多西他赛（0.2 ml/只）、生理盐水（0.2 ml/只）。每4天注射一次，共进行6次注射。抗瘤药物注射后每3天测量肿瘤体积并观察、记录裸鼠活动及死亡情况，直至最后一次注射后再行两次连续测量为止，瘤体积抑制率：肿瘤体积抑制率=（对照组平均体积 —实验组平均体积）/对照组平均体积×100%。
1.3.4 裸鼠处死取标本
在行第10次测量肿瘤体积后断颈处死裸鼠，将整个移植瘤取下并用天平称取肿瘤组织（图 1）重量（w）。取下组织浸泡在福尔马林溶液中保存备用。
图1
肿瘤组织示意图
注：从左到右依次为空白组、实验组、对照组肿瘤
1.4 统计学分析
应用SPSS20.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（
2 结果
完成最后一次测量前无裸鼠死亡，三组裸鼠外观可见肿瘤体积的差异，部分裸鼠背部肿瘤有溃疡形成。为保证实验的均衡性在第一次开始注射抗瘤药物时（即饲养第6天时）将各组间抗瘤药物注入后及注入前肿瘤体积进行统计学分析，比较各组间移植瘤体积是否有差异（表 2）。
表2
抗瘤药物注射时各组间肿瘤体积比较（
图2
肿瘤时间-体积变化曲线图
上表数据经方差齐性检验符合正态分布，各组间差异无统计学意义（F=0.375，P>0.05），即注射抗瘤药物时随机分为三组时各组间肿瘤体积无差异，说明均衡性较好可以进行抗瘤药物注射。
根据研究数据绘制肿瘤时间-体积变化曲线图，由图可知由于各组注射药物不同，各组间肿瘤体积也出现差异，对照组与空白组差异尤为明显。从第18天起各组间开始出现较明显差异，第27天时空白组与其他两组差异均有统计学意义。多西他赛较Wnt-1抗体有更强的抑制肿瘤的作用。各组测量日的标准差均在正常范围内，差异有统计学意义。第12天时，实验组标准差值为0.352远大于其他两组且曲线高于空白组，考虑原因可能是因为第6天即第一次给A组部分裸鼠注射Wnt-1抗体时出现操作问题。
对各组药物注入裸鼠体内后不同时间段各组间肿瘤体积差异进行比较分析，抗瘤药物注射前6天，三组比较均无差异；第二次注射药物后，对照组出现抑瘤作用；自第三次注射药物时空白组与其他两组相比肿瘤体积有上升趋势，这说明抗瘤药物对肿瘤生长的抑制要在一周至两周时间表现出来；第21天，对照组与实验组相对于空白组出现较为明显的肿瘤抑制作用，其结果与时间-体积曲线图走势相符；第24天，对照组和实验组与空白组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。说明两种抗瘤药物在抑制肿瘤生长方面具均有效且多西他赛相对于Wnt-1抗体抑瘤作用更加明显（表 3、表 4）。
表3
药物注射后不同时间点肿瘤的体积（
表4
抗瘤药物注射后不同时间点肿瘤体积组间比较
根据研究数据绘制肿瘤时间-抑制率曲线图（图 3）。从图中可以看出，抗肿瘤药物在前15 d抑瘤效果不明显，15 d到24 d抑瘤效果对照组强于实验组，从24 d开始至裸鼠解剖抑瘤效果明显提高。二者肿瘤体积抑制率差异有统计学意义。考虑空白组部分裸鼠出现肿瘤溃疡，出现已经明显的恶病质，因此观察至33 d。另外12 d测量Wnt-1组肿瘤相对于空白组肿瘤生长旺盛，考虑原因可能是Wnt-1抗体的注射操作问题。
图3
肿瘤时间-抑制率曲线图
3 讨论
非小细胞肺癌是对人类危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，其发生、发展是一个多因素多步骤的过程，主要表现为生活习惯的改变、环境的变化。治疗主要以根治性手术切除为主，肺癌的发生被认为是一系列多基因改变累积的结果。虽然，在过去的几十年肺癌的诊断和治疗都取得了很大的进展，但是其死亡率依然很高，特别是在肺癌晚期，肺癌细胞发生侵袭和转移。即使抗肿瘤治疗能有效的控制肿瘤迁移，但是效果只是暂时的，大多数转移瘤的复发是很迅速的[9]。其中，经典Wnt信号通路表达失调或其核心成员的异常与肿瘤的发生、进展密切相关[10]。
Wnt信号通路（即果蝇中的Wg信号通路）是一类在发育上保守的信号通路，在动物发育和组织形成后的动态平衡中，具有重要功能[11-12]。Wnt来源于无翅基因（wingless，Wg）与Int基因[13]。Wg基因最早在果蝇中发现，对胚胎发育有重要作用[14]，可促进成年动物的肢体形成[15]，其突变可导致无翅畸形。Int基因最早于1982年由Nusse等在探讨小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）转录机制过程中发现[11-16]。由于Int-1基因与Wg基因具有同源性，现已将有关的两类基因统一命名为Wnt基因家族。在多种细胞中，Wnt信号通路起着关键作用，参与细胞的增殖、分化、凋亡等基本过程，尤其是调控正常组织发育以及肿瘤形成[17-19]。
本实验通过研究Wnt信号通路比较三组间的组间差异来验证Wnt信号通路在非小细胞肺癌中的影响。通过对裸鼠荷瘤模型的构建，研究阻断Wnt信号通路对肿瘤生长的影响。实验发现同为6次抗肿瘤药物注射的Wnt-1抗体与多西他赛比较，其两者有着共同的抑制肿瘤生长的作用。而被人们熟知的多西他赛常与铂类制剂配伍作为抗非小细胞肺癌的二线用药，其效应部位为抗细胞的有丝分裂，并且作为晚期转移性非小细胞肺癌的常规用药，其抗瘤作用已被认可。两种抗肿瘤药物在前15 d抑瘤效果不明显，15 d到24 d抑瘤效果多西他赛组强于Wnt-1组，24天开始至裸鼠解剖，抑瘤效果明显提高。肿瘤体积第27 d时空白组分别与实验组（P=0.002），对照组（P=0.000）出现明显差异，验证了Wnt-1抗体阻断Wnt/β-catenin信号通路后，对活体动物肿瘤生长的抑制影响是确切的。本实验用Wnt-1抗体，主要用于阻断Wnt/β-catenin信号通路，大部分用于免疫组化与Western blotting等实验室应用，国内外目前很少有直接用于裸鼠本身的注射。由于抗体内含有有毒性物质，因此，对裸鼠的生存有一定的影响，所以本实验中参照部分文献给出的最低剂量，给予50 μg/kg注射。33天解剖动物时，实验组无裸鼠死亡。但 50 μg/kg并非抗瘤的最佳剂量，因此，抗瘤效果没有二线用药的多西他赛效果显著。
本研究结果表明，Wnt-1可以作为分子靶向治疗非小细胞肺癌。阻断Wnt-1信号通路，采用小分子或者RNA抑制可以对Wnt-1过表达的非小细胞肺癌患者提供有效的治疗。如今对Wnt信号通路的基本认识，以及Wnt信号通路与肺癌之间关系的各项研究在逐渐增多，但在临床上希望通过该信号传导途径治疗肺癌的研究仍相对较少。美国学者Curtin等[20]针对癌症干细胞的Wnt信号通路进行药物探索方面具有自我更新能力和多潜能性，并能推动肿瘤的发生和维护。首先，确定干细胞在血液系统恶性肿瘤中发挥重要作用，现在被认为肿瘤干细胞存在于多种实体肿瘤，其中包括非小细胞肺癌。通常是通过Wnt信号途径、Notch和Hedgehog（HH）通路来激活各种不同类型的癌症。虽然通过Notch和HH通路进行治疗方面已经取得了实质性的进展，但是Wnt信号通路仍然是一个难以实现的治疗目标。本研究主要是通过了解Wnt信号通路在干细胞和肿瘤细胞生物学的临床意义来针对Wnt和/或β-catenin信号途径进行干预和治疗方面的研究。在非小细胞肺癌方面已被证明其胞内有高水平的游离β-catenin，并且表现出较高基础水平的Wnt/β-catenin的转录激活[21]。
针对Wnt抗体的动物研究发现裸鼠和人的Wnt信号通路，以及它们的受体共享一个高度相关的同源性，并已被证明能在功能上的互换。虽然这些体外实验结果是激动人心的，但是Wnt基因抗体的特性还需要近一步的探索。
前景分析认为，Wnt/β-catenin信号传导途径作为新的靶点进行针对非小细胞肺癌的临床治疗，需要从实验室试剂向药物方面的转化。如何降低药物的毒性作用及提高药物穿透力达到高效能阻断Wnt经典信号通路将决定肿瘤患者预后及远期生存率。
随着工业的发展和汽车数量的增多，城镇居民肺癌发病率呈逐年增高的趋势。肺癌是男性罹癌致死率最高的肿瘤[1]，其中约80%的患者是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。在西南边陲的云南省，有宣威和个旧两个著名的肺癌高发地。鉴于早期发现和早期诊断在世界范围内仍是未解决的难题，临床医师面对的仍然是大量中晚期肺癌的患者。因而在近几十年来，外科手术加术后化疗仍然是非小细胞肺癌治疗的主要手段[3]。针对非小细胞肺癌，昆明市某医院的研究显示在行根治性手术切除138例患者的5年生存率为44.8%[4]。在单纯的手术方面，伴随电视胸腔镜手术的飞速发展，手术已经基本可以切除无远处转移的低于ⅢB期的肺癌病灶[5]。因此，除了早期诊断和主要的手术治疗之外，药物治疗已经成为基础医学最重要的研究方向。
配合化疗的肺癌患者5年生存率明显提高，但现在作为一线治疗的化疗药物顺铂联合吉西他滨治疗肺癌患者主要不良反应为骨髓抑制及胃肠道反应。严重的不良反应可使阶段性治疗由于一些严重的副作用而暂停甚至终止，影响患者的住院治疗效果和生存率。另外，运用吉西他滨联合紫杉醇治疗非小细胞肺癌患者的1年生存率为46.4%，中位生存期为10.8个月，其副作用主要是骨髓抑制及周围神经毒性。在有效控制血小板和粒细胞的情况下，铂类肿瘤化疗药物等联合化疗方案对情况较差的老年晚期患者仍然不能耐受[6]。由此可见作为一线用药的铂类药物对晚期肺癌患者的有效性仍然有很大的提高空间。
鉴于这种现状，在基础研究方面，Wnt信号通路作为调控胚胎发育和肿瘤发生、发展的热点，越来越得到学界的重视[7]。有免疫组织化学试验研究显示，针对151例肺癌患者Wnt-1的过表达与肺癌的恶性增殖成正相关，其中61例肺癌患者（40.4%）wnt-1表达呈阳性[8]。
对于阻断Wnt-1信号通路对肺癌细胞影响的研究，国内外报道均比较少见。云南省的肺癌发病率和死亡率都居高不下，但针对地域性肺癌的基础研究工作较少。本实验通过对云南省宣威地区肺癌患者切除非小细胞肺癌的肺癌组织培养并接种于裸鼠内体，在活体动物生存期进行Wnt抗体的干涉来研究阻断Wnt信号通路对非小细胞肺癌的影响，以期相关的实验结果能对其临床应用提供理论帮助。
1 资料与方法
1.1 荷瘤鼠模型和细胞系来源
本次实验所用21只雄性Balb/c-Nu裸鼠（16～18 g）均购于北京华阜康生物科技有限公司。裸鼠喂养饲料：Co60灭菌饲料，购于北京华阜康生物科技有限公司。在取得知情同意后，收集昆明医科大学附属延安医院未经放、化疗的住院患者外科切除且病理诊断为非小细胞肺癌的肺癌组织。
1.2 主要试剂、仪器与设备
本次研究使用的主要试剂包括Wnt-1抗体（Milli pore公司）、多西他赛（多帕菲，昆明泽浩公司）、10%小牛血清的PMPI-1640培养基（Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、Hanks液（Sigma公司）。
本次研究所用主要仪器与设备包括二氧化碳细胞培养箱（德国Thermo Fisher Scientific）、倒置相差显微镜（日本Olympus）、超低温冰箱（美国Eectrolux公司）、高速冷冻台式离心机（美国Thermo公司）、高速离心机（美国Thermo公司）、精密电子天平FA2004（上海精科天平)、SPF级动物饲养实验室（昆医附属延安医院中心实验室）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及传代
将瘤组织切成1～2 mm3小块，用Hanks液洗3次，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶中，并将培养瓶置于37℃、5%CO2的普通恒温箱中培养。在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴30 min后液洗3次，盛于完全培养基并制成（5～10）×108个/L细胞浓度的悬液。在37℃、5%CO2含有10%小牛血清的PMPI-1640培养基培养并以此作为初代细胞。每3 d更换一次培养液，并观察、记录细胞贴壁生长情况。当细胞长满培养瓶时，用5 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min直至细胞呈球形回缩时加入5 ml培养液终止消化并将培养瓶中的悬浮液分装传代培养。将第五代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化5 min并加入无血清PMPI-1640液1 200转/min离心三次。
1.3.2 荷瘤模型的构建
在上述细胞液中加入生理盐水稀释至2×107个/ml，并在裸鼠背部皮下接种约0.1 ml细胞液。1周后接种部位均肉眼可见直径约3～5 mm肿瘤结节生长。将接种后的裸鼠置于适宜光照、温度、湿度条件下的SPF级动物饲养室内，定时给予饲料、蒸馏水，每天观察、记录裸鼠活动及死亡情况。间隔三天用游标卡尺测量接种小鼠背部肿瘤结节长径（a）与短径（b），用公式V=1/2ab2计算所测瘤体体积并绘制肿瘤时间-体积曲线。将16只小鼠背部瘤体直径达4 mm时设定为荷瘤第1天。在荷瘤第6天时将裸鼠按体重从小到大编为1～21号并随机分组（表 1）。
表1
裸鼠随机分组表
1.3.3 分组注射抗肿瘤药物
第6天时分别给予实验组、对照组、空白组小鼠背部肿瘤周边皮下注射Wnt-1抗体（0.2 ml/只）、多西他赛（0.2 ml/只）、生理盐水（0.2 ml/只）。每4天注射一次，共进行6次注射。抗瘤药物注射后每3天测量肿瘤体积并观察、记录裸鼠活动及死亡情况，直至最后一次注射后再行两次连续测量为止，瘤体积抑制率：肿瘤体积抑制率=（对照组平均体积 —实验组平均体积）/对照组平均体积×100%。
1.3.4 裸鼠处死取标本
在行第10次测量肿瘤体积后断颈处死裸鼠，将整个移植瘤取下并用天平称取肿瘤组织（图 1）重量（w）。取下组织浸泡在福尔马林溶液中保存备用。
图1
肿瘤组织示意图
注：从左到右依次为空白组、实验组、对照组肿瘤
1.4 统计学分析
应用SPSS20.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（
2 结果
完成最后一次测量前无裸鼠死亡，三组裸鼠外观可见肿瘤体积的差异，部分裸鼠背部肿瘤有溃疡形成。为保证实验的均衡性在第一次开始注射抗瘤药物时（即饲养第6天时）将各组间抗瘤药物注入后及注入前肿瘤体积进行统计学分析，比较各组间移植瘤体积是否有差异（表 2）。
表2
抗瘤药物注射时各组间肿瘤体积比较（
图2
肿瘤时间-体积变化曲线图
上表数据经方差齐性检验符合正态分布，各组间差异无统计学意义（F=0.375，P>0.05），即注射抗瘤药物时随机分为三组时各组间肿瘤体积无差异，说明均衡性较好可以进行抗瘤药物注射。
根据研究数据绘制肿瘤时间-体积变化曲线图，由图可知由于各组注射药物不同，各组间肿瘤体积也出现差异，对照组与空白组差异尤为明显。从第18天起各组间开始出现较明显差异，第27天时空白组与其他两组差异均有统计学意义。多西他赛较Wnt-1抗体有更强的抑制肿瘤的作用。各组测量日的标准差均在正常范围内，差异有统计学意义。第12天时，实验组标准差值为0.352远大于其他两组且曲线高于空白组，考虑原因可能是因为第6天即第一次给A组部分裸鼠注射Wnt-1抗体时出现操作问题。
对各组药物注入裸鼠体内后不同时间段各组间肿瘤体积差异进行比较分析，抗瘤药物注射前6天，三组比较均无差异；第二次注射药物后，对照组出现抑瘤作用；自第三次注射药物时空白组与其他两组相比肿瘤体积有上升趋势，这说明抗瘤药物对肿瘤生长的抑制要在一周至两周时间表现出来；第21天，对照组与实验组相对于空白组出现较为明显的肿瘤抑制作用，其结果与时间-体积曲线图走势相符；第24天，对照组和实验组与空白组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。说明两种抗瘤药物在抑制肿瘤生长方面具均有效且多西他赛相对于Wnt-1抗体抑瘤作用更加明显（表 3、表 4）。
表3
药物注射后不同时间点肿瘤的体积（
表4
抗瘤药物注射后不同时间点肿瘤体积组间比较
根据研究数据绘制肿瘤时间-抑制率曲线图（图 3）。从图中可以看出，抗肿瘤药物在前15 d抑瘤效果不明显，15 d到24 d抑瘤效果对照组强于实验组，从24 d开始至裸鼠解剖抑瘤效果明显提高。二者肿瘤体积抑制率差异有统计学意义。考虑空白组部分裸鼠出现肿瘤溃疡，出现已经明显的恶病质，因此观察至33 d。另外12 d测量Wnt-1组肿瘤相对于空白组肿瘤生长旺盛，考虑原因可能是Wnt-1抗体的注射操作问题。
图3
肿瘤时间-抑制率曲线图
3 讨论
非小细胞肺癌是对人类危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，其发生、发展是一个多因素多步骤的过程，主要表现为生活习惯的改变、环境的变化。治疗主要以根治性手术切除为主，肺癌的发生被认为是一系列多基因改变累积的结果。虽然，在过去的几十年肺癌的诊断和治疗都取得了很大的进展，但是其死亡率依然很高，特别是在肺癌晚期，肺癌细胞发生侵袭和转移。即使抗肿瘤治疗能有效的控制肿瘤迁移，但是效果只是暂时的，大多数转移瘤的复发是很迅速的[9]。其中，经典Wnt信号通路表达失调或其核心成员的异常与肿瘤的发生、进展密切相关[10]。
Wnt信号通路（即果蝇中的Wg信号通路）是一类在发育上保守的信号通路，在动物发育和组织形成后的动态平衡中，具有重要功能[11-12]。Wnt来源于无翅基因（wingless，Wg）与Int基因[13]。Wg基因最早在果蝇中发现，对胚胎发育有重要作用[14]，可促进成年动物的肢体形成[15]，其突变可导致无翅畸形。Int基因最早于1982年由Nusse等在探讨小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）转录机制过程中发现[11-16]。由于Int-1基因与Wg基因具有同源性，现已将有关的两类基因统一命名为Wnt基因家族。在多种细胞中，Wnt信号通路起着关键作用，参与细胞的增殖、分化、凋亡等基本过程，尤其是调控正常组织发育以及肿瘤形成[17-19]。
本实验通过研究Wnt信号通路比较三组间的组间差异来验证Wnt信号通路在非小细胞肺癌中的影响。通过对裸鼠荷瘤模型的构建，研究阻断Wnt信号通路对肿瘤生长的影响。实验发现同为6次抗肿瘤药物注射的Wnt-1抗体与多西他赛比较，其两者有着共同的抑制肿瘤生长的作用。而被人们熟知的多西他赛常与铂类制剂配伍作为抗非小细胞肺癌的二线用药，其效应部位为抗细胞的有丝分裂，并且作为晚期转移性非小细胞肺癌的常规用药，其抗瘤作用已被认可。两种抗肿瘤药物在前15 d抑瘤效果不明显，15 d到24 d抑瘤效果多西他赛组强于Wnt-1组，24天开始至裸鼠解剖，抑瘤效果明显提高。肿瘤体积第27 d时空白组分别与实验组（P=0.002），对照组（P=0.000）出现明显差异，验证了Wnt-1抗体阻断Wnt/β-catenin信号通路后，对活体动物肿瘤生长的抑制影响是确切的。本实验用Wnt-1抗体，主要用于阻断Wnt/β-catenin信号通路，大部分用于免疫组化与Western blotting等实验室应用，国内外目前很少有直接用于裸鼠本身的注射。由于抗体内含有有毒性物质，因此，对裸鼠的生存有一定的影响，所以本实验中参照部分文献给出的最低剂量，给予50 μg/kg注射。33天解剖动物时，实验组无裸鼠死亡。但 50 μg/kg并非抗瘤的最佳剂量，因此，抗瘤效果没有二线用药的多西他赛效果显著。
本研究结果表明，Wnt-1可以作为分子靶向治疗非小细胞肺癌。阻断Wnt-1信号通路，采用小分子或者RNA抑制可以对Wnt-1过表达的非小细胞肺癌患者提供有效的治疗。如今对Wnt信号通路的基本认识，以及Wnt信号通路与肺癌之间关系的各项研究在逐渐增多，但在临床上希望通过该信号传导途径治疗肺癌的研究仍相对较少。美国学者Curtin等[20]针对癌症干细胞的Wnt信号通路进行药物探索方面具有自我更新能力和多潜能性，并能推动肿瘤的发生和维护。首先，确定干细胞在血液系统恶性肿瘤中发挥重要作用，现在被认为肿瘤干细胞存在于多种实体肿瘤，其中包括非小细胞肺癌。通常是通过Wnt信号途径、Notch和Hedgehog（HH）通路来激活各种不同类型的癌症。虽然通过Notch和HH通路进行治疗方面已经取得了实质性的进展，但是Wnt信号通路仍然是一个难以实现的治疗目标。本研究主要是通过了解Wnt信号通路在干细胞和肿瘤细胞生物学的临床意义来针对Wnt和/或β-catenin信号途径进行干预和治疗方面的研究。在非小细胞肺癌方面已被证明其胞内有高水平的游离β-catenin，并且表现出较高基础水平的Wnt/β-catenin的转录激活[21]。
针对Wnt抗体的动物研究发现裸鼠和人的Wnt信号通路，以及它们的受体共享一个高度相关的同源性，并已被证明能在功能上的互换。虽然这些体外实验结果是激动人心的，但是Wnt基因抗体的特性还需要近一步的探索。
前景分析认为，Wnt/β-catenin信号传导途径作为新的靶点进行针对非小细胞肺癌的临床治疗，需要从实验室试剂向药物方面的转化。如何降低药物的毒性作用及提高药物穿透力达到高效能阻断Wnt经典信号通路将决定肿瘤患者预后及远期生存率。
