引用本文： 许士俊, 穆军升, 张健群, 伯平. 小鼠诱导多能干细胞与PHBHHx膜体外共培养的实验研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(8): 822-826. doi: 10.7507/1007-4848.20160196 复制
干细胞替代疗法是一种具有巨大潜力的可以治疗多种疾病（如心肌梗死等）的有效方法[1]。成熟哺乳动物的大部分正常体细胞损伤后可以再生，但是处于分化终末阶段的细胞，如心肌细胞、脑细胞和软骨细胞，一旦受损或凋亡后便不能再生，只能由成纤维细胞替代，使脏器功能受损，极大地损害了人类的健康。干细胞移植可以利用干细胞的分化潜能从而替代受损细胞，改善受损脏器的部分功能[2]。然而，干细胞移植过程中因为缺乏相应的载体，导致移植细胞难以在移植区良好的存活和增殖，因此寻找一种能为细胞提供适宜的生长环境、有效减少细胞流失的生物材料显得尤为重要[3-4]。诱导多能干细胞（iPSCs）是将与胚胎干细胞多能性密切相关的4个转录因子（Oct-4，Sox2、c-Myc和Klf）通过逆转录病毒导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞而重编程为的多能干细胞[5]。iPSCs在细胞形态、生长特点、基因表达谱和形成畸胎瘤方面与ESCs（胚胎干细胞）类似，也具有相似的全能性，能够在体外适宜的条件下分化为心肌细胞、脑细胞、软骨细胞等所有三胚层类型的细胞[6]，且解决了胚胎干细胞与生俱有的免疫排斥、伦理和道德等问题，是非常理想的种子细胞。细胞补片能够为种子细胞提供生存和增殖的细胞外环境，防止细胞的流失。因此，细胞补片材料需要有良好的生物相容性、无毒及可降解等特性[7]。所以探索寻找一种适合细胞生长增殖的支架材料是制作细胞补片的重要环节之一。聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）作为PHA家族中的一员，已经证实与多种细胞能够很好的融合[8]。具有作为生物医学材料的潜力，但是作为iPSCs的补片材料应用到干细胞移植治疗领域还缺乏相应的研究。本研究通过小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）与PHBHHx材料补片共培养，观察PHBHHx细胞补片对miPSCs粘附及增殖的影响，以探索寻找适合细胞粘附和增殖，并具有良好生物相容性和可降解特性的生物材料。
1 材料与方法
1.1 材料
孕13.5 d的昆明白鼠，由中国军事科学院提供。小鼠诱导多能干细胞来自于中国科学院动物研究所。高糖DMEM（Hyclone）、1%的非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇、青链霉素、5%的血清替代物（SR）、磷酸盐缓冲液（PBS）、0.05%胰酶EDTA（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）、明胶（BD Phar-mingen），PHBHHx材料由清华大学化工系高分子研究所合成
1.2 方法
小鼠诱导多能干细胞饲养层的制备[9]：将孕期13.5 d的昆明白孕鼠拉颈处死，浸入酒精，放入超净台中，无菌条件下取出子宫，PBS充分洗去血迹。剪开子宫和胎膜，取出胚胎，用镊子去其头部和内脏，充分洗涤，将其剪成1 mm3以下的碎块，滤网过滤去除未剪碎的组织块，将滤过液吸于离心管中静置5～10 min，上清吸弃，加入1 ml 0.25%胰酶EDTA溶液，轻吹并消化2 min，加入等体积的MEF培养液（含10%普通胎牛血清的高糖DMEM）终止消化，吹打重悬，移入离心机中，800 r/min，离心5 min，上清吸弃。计数后以5×105/ml重悬于MEF生长培养基上，37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养至90%的融合度后传代，传至第三代后，10 μg/ml的丝裂霉素C处理细胞2.5 h，胰酶消化后，800 r/min离心4 min，收集细胞后重悬于培养基中，计数细胞，以5×104/ml接种于0.1%明胶包被的100 mm培养皿中，多余细胞冻存备用。
复苏、培养小鼠诱导多能干细胞：从液氮罐中取出一支冻存的miPSCs，浸入37℃的水浴锅中迅速解冻，移入15 ml离心管中，加入1 ml干细胞培养基（高糖DMEM、5%的干细胞胎牛血清、5%的血清替代物、1000 U/ml LIF、1%的非必须氨基酸、1%的L-谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇），800 r/min离心4 min，弃去上清，2 ml干细胞培养基重悬细胞，接种于经过丝裂霉素C预处理的小鼠胚胎纤维细胞饲养层上，放入培养箱中培养，隔天更换培养基。当miPSCs克隆过大或者过密时消化传代，差速贴壁法去除MEF，接种于未加MEF饲养层的培养皿中，继续培养。
miPSCs的鉴定采用碱性磷酸酶染色：吸弃培养基，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛固定1～2 min（不要超过2 min），吸弃，PBS洗2次，吸出PBS，PBST润洗一次；配制染色试剂（溶液A :溶液B :溶液C=50 μl:50 μl:400 μl），加适量的（使染色液覆盖孔底）染色试剂，室温避光放置10～15 min；将染色液吸出，PBS润洗一次，然后保存在PBS溶液中，显微镜下观察（分化的细胞无色，未分化细胞被染为蓝/紫色）。免疫荧光染色：吸出培养基，PBS洗3次（用摇床），4%的多聚甲醛固定10 min，吸弃，PBS洗3遍，每次5 min。用0.1%Triton-X100处理细胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用5%牛血清蛋白（BSA）封闭30 min，PBS洗3遍。加入山羊抗小鼠一抗Nanog、SSE-4（1:200，PBS稀释），4℃过夜，PBS洗3遍，加入兔抗山羊二抗（1:200，PBS稀释）和DAPI染液，室温避光45～60 min，PBS洗5次，加入适量封片剂后，指甲油固定，激光共聚焦显微镜下读片。
与PHBHHx膜共培养及细胞活力测定：在接种miPSCs之前，PHBHHx膜用打孔器剪成直径0.5 cm的圆形片，经75%酒精浸泡2 h，紫外线正反两面各照射2 h消毒，放入96孔板中，保持膜表面平整，培养基浸泡过夜备用。将培养至三代的miPSCs经过0.25%胰酶-EDTA消化后，细胞计数，调整细胞浓度为1×104个/ml，接种至96孔板中，分为两组，一组与细胞补片共培养，另一组用传统的培养皿培养miPSCs，每孔加入干细胞培养基200 μl。在细胞培养3 d后，CCK-8法测定细胞活力。
扫描电镜样品制备：细胞在PHBHHx膜上粘附生长3 d后，PBS洗涤3次，用2.5%的戊二醛固定（冰上）；再经0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸洗10 min后用1%四氧化锇固定液固定2 h（冰上）；然后再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸洗10 min后用乙醇梯度脱水并经乙酸异戊脂浸泡10 min；临界点干燥；喷金后扫描电镜下观察拍照[10]。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计分析，计数资料均采用均数±标准差（
2 结果
光镜下小鼠诱导多能干细胞的观察到miPSCs呈克隆生长，形成集落、类似球形、边缘齐整、立体感强、细胞排列紧密、细胞界限难以分清，见图 1A。对呈簇生长的小鼠诱导多能干细胞经胰酶消化后，通过差速离心法去除MEF饲养层后进行碱性磷酸酶染色鉴定，见图 1B（分化的细胞为无色，未分化细胞被染成蓝紫色）。SSE-4和Nanog为干细胞的特异性标志蛋白，对miPSCs进行免疫荧光观察SSE-4和Nanog的表达，见图 1C和1D（细胞核被染为蓝色，红色为SSE-4和Nanog蛋白表达）。
图1
光镜下小鼠诱导多能干细胞观察图
注：A：小鼠诱导多能干细胞在光镜下×200；B：miPSCs鉴定，AP染色×200；C：免疫荧光鉴定miPSCs标志蛋白SSE-4，细胞核为蓝色，蛋白红色；D：免疫荧光鉴定miPSCs标志蛋白Nanog，细胞核为蓝色，蛋白红色
miPSCs与PHBHHx膜共培养细胞活力测定示miPSCs生长迅速，一般培养3 d即可传代，传代后生长更快。当克隆长大后，胰酶消化后重悬细胞，细胞计数后接种于预先处理的PHBHHx膜中培养，在培养3 d后对其进行CCK-8测定细胞活力，结果见图 2，PHBHHx膜OD值大于传统的细胞培养皿培养的OD值（0.617±0.019 vs. 0.312±0.004，P < 0.05），PHBHHx膜培养效果明显优于传统的培养皿培养。并对miPSCs与PHBHHx膜共培养3 d后进行DAPI染色观察miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长情况，见图 3，细胞与PHBHHx膜粘附良好，细胞生长迅速。
图2
PHBHHx膜与miPSCs共培养3 d后细胞活力测定结果图
图3
miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长行DAPI染色图
扫描电镜观察miPSCs在PHBHHx膜上的生长粘附状态，见图 4，在miPSCs与PHBHHx膜共培养3 d后，吸弃培养基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成扫描电镜标本后上机检测。细胞粘附在PHBHHx膜上，生长良好。
图4
电镜观察miPSCs在PHBHHx膜上的生长粘附状态图
注：A：扫描电镜观察PHBHHx膜表面形态×1000；B：miPSCs在PHBHHx膜上生长×2000
3 讨论
干细胞具有自我复制和分化能力，是目前进行细胞治疗的主要种子细胞[11]。干细胞按照发育阶段可以分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞。ESC是一种高度未分化的细胞，具有分化为体内所有细胞类型的能力。但其存在免疫排斥及伦理学等问题，限制了ESC的应用前景[12]。2006年，Takahashi等[5]通过转入4种转录因子，成功的将成纤维细胞重新编程从而获得了具有ESC特性的全能干细胞—诱导多能干细胞。iPSC与ESC在形态、增殖分化潜力、细胞表面抗原、类胚体和畸胎瘤生成能力方面与ESC类似，而且还避免了伦理学和细胞免疫排斥等问题，因此具有巨大的应用潜力[13-14]。心肌梗死是由于冠状动脉狭窄或者闭塞导致的远端心肌细胞缺血、缺氧而发生坏死性疾病，发病凶险、死亡率高、预后不良。目前的治疗方法只能改善缺血区的心肌供血，并不能从根本上改变心肌细胞坏死的结局。而且，大片的心肌坏死后会导致心脏射血功能下降，出现心力衰竭，危及生命。
研究者在体外利用诱导多能干细胞分化为心肌细胞，注射到事先构建好的小鼠梗死模型中，与单纯注入成纤维细胞相比，发现移植入诱导多能干细胞的小鼠左心室收缩功能得到了明显改善，心室壁增厚和心室重构也得到了抑制，同时还增加了心电稳定性[15-16]。但是，干细胞移植治疗的过程中，移植区细胞会随着血流的冲刷或伴随机械活动，导致移植细胞的流失[17]。所以，miPSCs移植到梗死心肌细胞表面需要载体依托，保证移植细胞能够在心脏表面粘附并增殖。因此，我们需要寻找一种能够为细胞生长增殖提供合适的生存环境，具有良好的生物相容性和物理特性，以及在体内可降解吸收的材料，提高移植细胞在移植区的存活和增殖，从而更好地治疗疾病，改善疾病的预后。
生物可降解高分子聚合材料是组织工程学材料研究中最活跃的领域[18]。PHA家族是近年来被广泛关注的新型生物材料[19]，由于组成各种PHA材料的单体结构不同，其机械性能和生物相容性也不同。PHBHHx是PHA家族中具有很好生物相容性、合适的物理特性和可降解特性的新型材料[20]。鉴于此，我们选择PHBHHx支架材料作为细胞补片，将miPSCs与PHBHHx膜共培养。实验中，通过DAPI染色可以看到小鼠诱导多能干细胞粘附在PHBHHx膜上，形态正常（图 3）；制作电镜标本后，经过扫面电镜可以清晰的观察到PHBHHx的表面形态，miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长，挤作一团、呈簇生长、类似球形。3 d后进行CCK-8法测定细胞的活力，酶标仪测定450 mm处的吸光度，与PHBHHx膜共培养组OD值为0.617±0.019，显著大于传统的细胞培养皿培养的OD值0.312±0.004（P < 0.05）；说明PHBHHx膜不仅能够与miPSCs良好的融合，而且miPSCs在PHBHHx材料上生长更加活跃，PHBHHx可以促进miPSCs的增殖。因此，PHBHHx材料有希望成为治疗多种疾病的细胞培养支架材料。
本实验虽然证明了PHBHHx与miPSCs具有良好的相容性，miPSCs在PHBHHx膜上可以很好的粘附、存活和增殖，但是，我们并不知道补片材料能否促进miPSCs的分化以及补片材料移植入体内降解吸收后对机体的影响，是否会发生免疫排斥等情况。接下来我们会进一步研究PHBHHx作为心肌补片能否促进miPSCs向心肌细胞分化，为干细胞治疗心肌梗死走上临床奠定实验基础。
干细胞替代疗法是一种具有巨大潜力的可以治疗多种疾病（如心肌梗死等）的有效方法[1]。成熟哺乳动物的大部分正常体细胞损伤后可以再生，但是处于分化终末阶段的细胞，如心肌细胞、脑细胞和软骨细胞，一旦受损或凋亡后便不能再生，只能由成纤维细胞替代，使脏器功能受损，极大地损害了人类的健康。干细胞移植可以利用干细胞的分化潜能从而替代受损细胞，改善受损脏器的部分功能[2]。然而，干细胞移植过程中因为缺乏相应的载体，导致移植细胞难以在移植区良好的存活和增殖，因此寻找一种能为细胞提供适宜的生长环境、有效减少细胞流失的生物材料显得尤为重要[3-4]。诱导多能干细胞（iPSCs）是将与胚胎干细胞多能性密切相关的4个转录因子（Oct-4，Sox2、c-Myc和Klf）通过逆转录病毒导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞而重编程为的多能干细胞[5]。iPSCs在细胞形态、生长特点、基因表达谱和形成畸胎瘤方面与ESCs（胚胎干细胞）类似，也具有相似的全能性，能够在体外适宜的条件下分化为心肌细胞、脑细胞、软骨细胞等所有三胚层类型的细胞[6]，且解决了胚胎干细胞与生俱有的免疫排斥、伦理和道德等问题，是非常理想的种子细胞。细胞补片能够为种子细胞提供生存和增殖的细胞外环境，防止细胞的流失。因此，细胞补片材料需要有良好的生物相容性、无毒及可降解等特性[7]。所以探索寻找一种适合细胞生长增殖的支架材料是制作细胞补片的重要环节之一。聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）作为PHA家族中的一员，已经证实与多种细胞能够很好的融合[8]。具有作为生物医学材料的潜力，但是作为iPSCs的补片材料应用到干细胞移植治疗领域还缺乏相应的研究。本研究通过小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）与PHBHHx材料补片共培养，观察PHBHHx细胞补片对miPSCs粘附及增殖的影响，以探索寻找适合细胞粘附和增殖，并具有良好生物相容性和可降解特性的生物材料。
1 材料与方法
1.1 材料
孕13.5 d的昆明白鼠，由中国军事科学院提供。小鼠诱导多能干细胞来自于中国科学院动物研究所。高糖DMEM（Hyclone）、1%的非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇、青链霉素、5%的血清替代物（SR）、磷酸盐缓冲液（PBS）、0.05%胰酶EDTA（Gibco）、丝裂霉素C（Sigma）、明胶（BD Phar-mingen），PHBHHx材料由清华大学化工系高分子研究所合成
1.2 方法
小鼠诱导多能干细胞饲养层的制备[9]：将孕期13.5 d的昆明白孕鼠拉颈处死，浸入酒精，放入超净台中，无菌条件下取出子宫，PBS充分洗去血迹。剪开子宫和胎膜，取出胚胎，用镊子去其头部和内脏，充分洗涤，将其剪成1 mm3以下的碎块，滤网过滤去除未剪碎的组织块，将滤过液吸于离心管中静置5～10 min，上清吸弃，加入1 ml 0.25%胰酶EDTA溶液，轻吹并消化2 min，加入等体积的MEF培养液（含10%普通胎牛血清的高糖DMEM）终止消化，吹打重悬，移入离心机中，800 r/min，离心5 min，上清吸弃。计数后以5×105/ml重悬于MEF生长培养基上，37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养至90%的融合度后传代，传至第三代后，10 μg/ml的丝裂霉素C处理细胞2.5 h，胰酶消化后，800 r/min离心4 min，收集细胞后重悬于培养基中，计数细胞，以5×104/ml接种于0.1%明胶包被的100 mm培养皿中，多余细胞冻存备用。
复苏、培养小鼠诱导多能干细胞：从液氮罐中取出一支冻存的miPSCs，浸入37℃的水浴锅中迅速解冻，移入15 ml离心管中，加入1 ml干细胞培养基（高糖DMEM、5%的干细胞胎牛血清、5%的血清替代物、1000 U/ml LIF、1%的非必须氨基酸、1%的L-谷氨酰胺、1%的青链霉素、0.1%的β-巯基乙醇），800 r/min离心4 min，弃去上清，2 ml干细胞培养基重悬细胞，接种于经过丝裂霉素C预处理的小鼠胚胎纤维细胞饲养层上，放入培养箱中培养，隔天更换培养基。当miPSCs克隆过大或者过密时消化传代，差速贴壁法去除MEF，接种于未加MEF饲养层的培养皿中，继续培养。
miPSCs的鉴定采用碱性磷酸酶染色：吸弃培养基，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛固定1～2 min（不要超过2 min），吸弃，PBS洗2次，吸出PBS，PBST润洗一次；配制染色试剂（溶液A :溶液B :溶液C=50 μl:50 μl:400 μl），加适量的（使染色液覆盖孔底）染色试剂，室温避光放置10～15 min；将染色液吸出，PBS润洗一次，然后保存在PBS溶液中，显微镜下观察（分化的细胞无色，未分化细胞被染为蓝/紫色）。免疫荧光染色：吸出培养基，PBS洗3次（用摇床），4%的多聚甲醛固定10 min，吸弃，PBS洗3遍，每次5 min。用0.1%Triton-X100处理细胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用5%牛血清蛋白（BSA）封闭30 min，PBS洗3遍。加入山羊抗小鼠一抗Nanog、SSE-4（1:200，PBS稀释），4℃过夜，PBS洗3遍，加入兔抗山羊二抗（1:200，PBS稀释）和DAPI染液，室温避光45～60 min，PBS洗5次，加入适量封片剂后，指甲油固定，激光共聚焦显微镜下读片。
与PHBHHx膜共培养及细胞活力测定：在接种miPSCs之前，PHBHHx膜用打孔器剪成直径0.5 cm的圆形片，经75%酒精浸泡2 h，紫外线正反两面各照射2 h消毒，放入96孔板中，保持膜表面平整，培养基浸泡过夜备用。将培养至三代的miPSCs经过0.25%胰酶-EDTA消化后，细胞计数，调整细胞浓度为1×104个/ml，接种至96孔板中，分为两组，一组与细胞补片共培养，另一组用传统的培养皿培养miPSCs，每孔加入干细胞培养基200 μl。在细胞培养3 d后，CCK-8法测定细胞活力。
扫描电镜样品制备：细胞在PHBHHx膜上粘附生长3 d后，PBS洗涤3次，用2.5%的戊二醛固定（冰上）；再经0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸洗10 min后用1%四氧化锇固定液固定2 h（冰上）；然后再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸洗10 min后用乙醇梯度脱水并经乙酸异戊脂浸泡10 min；临界点干燥；喷金后扫描电镜下观察拍照[10]。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计分析，计数资料均采用均数±标准差（
2 结果
光镜下小鼠诱导多能干细胞的观察到miPSCs呈克隆生长，形成集落、类似球形、边缘齐整、立体感强、细胞排列紧密、细胞界限难以分清，见图 1A。对呈簇生长的小鼠诱导多能干细胞经胰酶消化后，通过差速离心法去除MEF饲养层后进行碱性磷酸酶染色鉴定，见图 1B（分化的细胞为无色，未分化细胞被染成蓝紫色）。SSE-4和Nanog为干细胞的特异性标志蛋白，对miPSCs进行免疫荧光观察SSE-4和Nanog的表达，见图 1C和1D（细胞核被染为蓝色，红色为SSE-4和Nanog蛋白表达）。
图1
光镜下小鼠诱导多能干细胞观察图
注：A：小鼠诱导多能干细胞在光镜下×200；B：miPSCs鉴定，AP染色×200；C：免疫荧光鉴定miPSCs标志蛋白SSE-4，细胞核为蓝色，蛋白红色；D：免疫荧光鉴定miPSCs标志蛋白Nanog，细胞核为蓝色，蛋白红色
miPSCs与PHBHHx膜共培养细胞活力测定示miPSCs生长迅速，一般培养3 d即可传代，传代后生长更快。当克隆长大后，胰酶消化后重悬细胞，细胞计数后接种于预先处理的PHBHHx膜中培养，在培养3 d后对其进行CCK-8测定细胞活力，结果见图 2，PHBHHx膜OD值大于传统的细胞培养皿培养的OD值（0.617±0.019 vs. 0.312±0.004，P < 0.05），PHBHHx膜培养效果明显优于传统的培养皿培养。并对miPSCs与PHBHHx膜共培养3 d后进行DAPI染色观察miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长情况，见图 3，细胞与PHBHHx膜粘附良好，细胞生长迅速。
图2
PHBHHx膜与miPSCs共培养3 d后细胞活力测定结果图
图3
miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长行DAPI染色图
扫描电镜观察miPSCs在PHBHHx膜上的生长粘附状态，见图 4，在miPSCs与PHBHHx膜共培养3 d后，吸弃培养基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成扫描电镜标本后上机检测。细胞粘附在PHBHHx膜上，生长良好。
图4
电镜观察miPSCs在PHBHHx膜上的生长粘附状态图
注：A：扫描电镜观察PHBHHx膜表面形态×1000；B：miPSCs在PHBHHx膜上生长×2000
3 讨论
干细胞具有自我复制和分化能力，是目前进行细胞治疗的主要种子细胞[11]。干细胞按照发育阶段可以分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞。ESC是一种高度未分化的细胞，具有分化为体内所有细胞类型的能力。但其存在免疫排斥及伦理学等问题，限制了ESC的应用前景[12]。2006年，Takahashi等[5]通过转入4种转录因子，成功的将成纤维细胞重新编程从而获得了具有ESC特性的全能干细胞—诱导多能干细胞。iPSC与ESC在形态、增殖分化潜力、细胞表面抗原、类胚体和畸胎瘤生成能力方面与ESC类似，而且还避免了伦理学和细胞免疫排斥等问题，因此具有巨大的应用潜力[13-14]。心肌梗死是由于冠状动脉狭窄或者闭塞导致的远端心肌细胞缺血、缺氧而发生坏死性疾病，发病凶险、死亡率高、预后不良。目前的治疗方法只能改善缺血区的心肌供血，并不能从根本上改变心肌细胞坏死的结局。而且，大片的心肌坏死后会导致心脏射血功能下降，出现心力衰竭，危及生命。
研究者在体外利用诱导多能干细胞分化为心肌细胞，注射到事先构建好的小鼠梗死模型中，与单纯注入成纤维细胞相比，发现移植入诱导多能干细胞的小鼠左心室收缩功能得到了明显改善，心室壁增厚和心室重构也得到了抑制，同时还增加了心电稳定性[15-16]。但是，干细胞移植治疗的过程中，移植区细胞会随着血流的冲刷或伴随机械活动，导致移植细胞的流失[17]。所以，miPSCs移植到梗死心肌细胞表面需要载体依托，保证移植细胞能够在心脏表面粘附并增殖。因此，我们需要寻找一种能够为细胞生长增殖提供合适的生存环境，具有良好的生物相容性和物理特性，以及在体内可降解吸收的材料，提高移植细胞在移植区的存活和增殖，从而更好地治疗疾病，改善疾病的预后。
生物可降解高分子聚合材料是组织工程学材料研究中最活跃的领域[18]。PHA家族是近年来被广泛关注的新型生物材料[19]，由于组成各种PHA材料的单体结构不同，其机械性能和生物相容性也不同。PHBHHx是PHA家族中具有很好生物相容性、合适的物理特性和可降解特性的新型材料[20]。鉴于此，我们选择PHBHHx支架材料作为细胞补片，将miPSCs与PHBHHx膜共培养。实验中，通过DAPI染色可以看到小鼠诱导多能干细胞粘附在PHBHHx膜上，形态正常（图 3）；制作电镜标本后，经过扫面电镜可以清晰的观察到PHBHHx的表面形态，miPSCs在PHBHHx膜上粘附生长，挤作一团、呈簇生长、类似球形。3 d后进行CCK-8法测定细胞的活力，酶标仪测定450 mm处的吸光度，与PHBHHx膜共培养组OD值为0.617±0.019，显著大于传统的细胞培养皿培养的OD值0.312±0.004（P < 0.05）；说明PHBHHx膜不仅能够与miPSCs良好的融合，而且miPSCs在PHBHHx材料上生长更加活跃，PHBHHx可以促进miPSCs的增殖。因此，PHBHHx材料有希望成为治疗多种疾病的细胞培养支架材料。
本实验虽然证明了PHBHHx与miPSCs具有良好的相容性，miPSCs在PHBHHx膜上可以很好的粘附、存活和增殖，但是，我们并不知道补片材料能否促进miPSCs的分化以及补片材料移植入体内降解吸收后对机体的影响，是否会发生免疫排斥等情况。接下来我们会进一步研究PHBHHx作为心肌补片能否促进miPSCs向心肌细胞分化，为干细胞治疗心肌梗死走上临床奠定实验基础。
