引用本文： 肖正华, 古君, 秦超毅, 胡佳, 方智, 蒙炜. 乌司他丁对机械通气相关性肺损伤的保护作用及其机制研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(10): 1001-1005. doi: 10.7507/1007-4848.20160238 复制
机械通气是临床重症监护中最常使用的支持手段之一，随着机械通气使用率的增加，其所带来的并发症也越来越受到重视。其中机械通气相关性肺损伤（ventilator induced lung injury，VILI）是呼吸机最常见的并发症之一[1-3]。VILI的发生会导致患者住院时间延长，住院费用提高，甚至增加患者死亡率[4-5]。已有文献报道，VILI的形成机制之一是由于机械因素导致高迁移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）释放，从而引起肺炎症反应和肺损伤[6]。乌司他丁是从人尿液中提取的特异性蛋白酶抑制剂，具有降低炎症因子的作用[7]。目前临床已有利用乌司他丁治疗VILI取得良好效果的报道[8]，但尚未明确阐释其可能机制。本研究旨在探讨乌司他丁治疗VILI的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组及模型建立
清洁级健康SD大鼠24只，体重250～300 g，购自四川大学华西实验动物中心。随机分成3组：对照组：常规潮气量（8 ml/kg，呼吸频率90次/min）；呼吸机肺损伤组（VILI组，20 ml/kg，呼吸频率50次/min）；乌司他丁组（通气设置同VILI组，通气前5min尾静脉注射乌司他丁50 000 U/kg）[9]。三组动物通气时长均为2 h，实验完成后处死动物获取标本。
1.2 方法
1.2.1 样本及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）获取和肺组织病理学
实验完成后，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉实验动物，开胸、暴露气管及肺，用套管针插入左支气管并固定，拔出针芯后用2 ml生理盐水灌洗左肺，然后缓慢回抽，如此反复3次，回收率约75%；取出右上肺固定24 h，常规石蜡包埋、切片，行HE染色观察肺组织病理改变情况。
1.2.2 干湿重比（dry/wetratio）
开胸取肺组织，称重后置80℃烤箱烘烤48 h，干燥至恒重。肺干湿比=湿重/干重。
1.2.3 肺组织TLR4蛋白的检测
采用Western蛋白质印迹法，取20 mg冰冻肺组织加入0.5 ml预冷的组织细胞裂解液，匀浆后4 ℃下1 000 r/min离心10 min。采用二辛可宁酸法（BCA法）测定蛋白浓度。每个样本取40 μg总蛋白进行标准Western步骤。使用一抗稀释液1 : 1 000稀释一抗（TLR4抗体，abcam公司），使用1 : 2 000稀释的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后加入化学发光剂，暗室中曝光、显影和定影，使用专门的图像分析仪分析和定量照片。
1.2.4 肺脏组织损伤评分标准
在处死动物后取得的肺病理切片中，对镜下肺组织的以下5种病理改变进行综合评估：肺泡腔壁水肿增厚，肺泡内出血，中性粒细胞浸润肺泡腔或浸润肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根据每项有无指标病变，进行评分（0= 无病变，1= 有病变），累加各项评分的总分作为肺病理损伤评分，0分为正常肺组织，5分为损伤最严重[10]。
1.2.5 BALF中TNF-α、IL-6和HMGB-1的测定
肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、HMGB-1分别采用相应的试剂盒（索莱宝，北京）进行测定，所有步骤均严格按照说明书进行。
1.3 统计学分析
所有数据采用均数±标准差（X±s）的表示。统计数据采用IBM SPSS Statistics 20软件作方差分析及单因素分析ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组实验动物BALF中HMGB-1及炎症因子水平
VILI组BALF中HMGB-1高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组BALF中HMGB-1水平较VILI组降低（P＜0.05）；VILI组BALF中TNF-α、IL-6显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组BALF中HMGB1水平较VILI组显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义，见图 1。
图1
各组实验动物BALF中HMGB1及炎症因子表达情况
注：#与对照组比较
2.2 各组实验动物肺组织TLR4表达情况
VILI组肺组织中TLR4表达水平显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组肺组织中TLR4表达水平较VILI组显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义，见图 2。
图2
各组实验动物肺组织中TLR4表达情况
注：#与对照组比较
2.3 各组实验动物肺损伤情况比较
VILI组肺干湿重比显著高于对照组（P＜0.05，图 3A），VILI+ 乌司他丁组肺干湿重比较VILI组显著降低（P＜0.05）；VILI组肺病理评分显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组肺病理评分较VILI组显著降低（P＜0.05，图 3B）。与对照组（图 4A）比较，VILI组（图 4B） 肺组织出现肺泡壁组织水肿、肺间质出血以及中性粒细胞浸润等典型肺损伤的病理结构改变更大，VILI+ 乌司他丁组（图 4C）肺组织病理损伤程度较VILI组（图 4B）出现显著改善。
图3
各组实验动物肺干湿重比及肺病理评分情况
注：#与对照组比较
图4
各组实验动物肺病理损伤情况 HE ×200
注：A为对照组；B为VILI组；C为VILI+ulinastatin组
3 讨论
既往文献表明，呼吸机使用不当可以造成肺气压伤、容量肺和肺不张等机械性损伤，然后诱发肺炎症细胞浸润和炎性因子释放，引起VILI [11-14]。VILI的中心环节是炎症反应，参与VILI的主要炎症因子有TNF-α和IL-6。TNF-α是导致炎性介质级联反应的始发因子，可促进其他细胞因子的继发释放，促进机体产生炎性反应瀑布效应，同时更能直接作用于肺泡上皮细胞，对肺功能及结构产生直接损伤[9-10]。IL-6在感染或外伤引起的急性炎症反应中诱导急性期反应蛋白的合成，发挥放大炎症反应程度的作用[9]。本研究结果显示VILI大鼠模型BALF中TNF-α和IL-6水平升高，肺干/湿重比较对照组显著升高，肺病理损伤程度明显比对照组严重，说明TNF-α和IL-6参与VILI的形成过程，大潮气量机械通气引起了实验动物肺部严重的炎症反应，继而导致肺损伤。
HMGB-1是核内一类非组蛋白核蛋白，存在于所有真核细胞中，其序列高度保守。结构上HMGB1由三个区域组成，两个含正电荷的区域（A盒和B盒）和一个含负电荷的羧基端；功能上，A盒和B盒为DNA结合区，B盒具有细胞因子样活性，可诱导巨噬细胞分泌其他炎症因子[15-16]。HMGB-1在组织损伤或者细胞破坏后可释放入血直接作为炎症因子参与机体固有免疫应答，激活多形核白细胞、单核巨噬细胞及自然杀伤细胞，促进炎症的发生和发展[17]。研究发现Toll样受体4可作为HMGB-1的受体与HMGB-1结合，继而通过MyD88依赖途径，最后激活NF-кB，引起炎症反应[18]。本研究结果也发现VILI组大鼠肺泡灌洗液中HMGB-1、肺组织中TLR4表达水平均较对照组升高，这说明VILI组肺泡灌洗液中升高的炎症因子可能是由升高的HMGB-1刺激TLR4受体引起的。
乌司他丁是一种广谱的酶抑制剂，对胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、激肽释放酶等具有较强的抑制作用，同时它能稳定线粒体膜，从而抑制多种炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-6）的表达上调[19]。本研究结果显示乌司他丁可抑制VILI模型BALF中HMGB-1、TNF-α和IL-6的表达以及肺组织中TLR4的表达。从机制上讲，破坏的线粒体膜可引起细胞凋亡，进一步导致HMGB-1的释放增加，乌司他丁可以稳定线粒体膜，从而减少HMGB-1的释放[20]，并减少HMGB-1通过TLR4途径引起的下游TNF-α和IL-6水平升高；从另一方面讲，乌司他丁本身具有强大的非特异性抗炎作用，可降低机体TNF-α和IL-6的水平[9]，减少炎症反应对组织的炎性损伤，进一步减少HMGB-1的释放。因此乌司他丁在VILI中的作用在于打破了“细胞损伤-HMGB-1释放-炎症水平升高-细胞损伤”这个恶性循环，从整体上降低了VILI过程中肺的炎症反应水平，从而发挥保护VILI肺功能和结构的作用。
本研究结果发现HMGB-1可能通过TLR4受体途径参与VILI引起的炎症反应和继发的肺炎性损伤；而乌司他丁可以通过减少HMGB-1通过TLR4途径引起的肺炎症因子升高，起到保护肺功能和结构的作用。这为临床使用乌司他丁治疗VILI提供了理论依据和实验基础。
机械通气是临床重症监护中最常使用的支持手段之一，随着机械通气使用率的增加，其所带来的并发症也越来越受到重视。其中机械通气相关性肺损伤（ventilator induced lung injury，VILI）是呼吸机最常见的并发症之一[1-3]。VILI的发生会导致患者住院时间延长，住院费用提高，甚至增加患者死亡率[4-5]。已有文献报道，VILI的形成机制之一是由于机械因素导致高迁移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）释放，从而引起肺炎症反应和肺损伤[6]。乌司他丁是从人尿液中提取的特异性蛋白酶抑制剂，具有降低炎症因子的作用[7]。目前临床已有利用乌司他丁治疗VILI取得良好效果的报道[8]，但尚未明确阐释其可能机制。本研究旨在探讨乌司他丁治疗VILI的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组及模型建立
清洁级健康SD大鼠24只，体重250～300 g，购自四川大学华西实验动物中心。随机分成3组：对照组：常规潮气量（8 ml/kg，呼吸频率90次/min）；呼吸机肺损伤组（VILI组，20 ml/kg，呼吸频率50次/min）；乌司他丁组（通气设置同VILI组，通气前5min尾静脉注射乌司他丁50 000 U/kg）[9]。三组动物通气时长均为2 h，实验完成后处死动物获取标本。
1.2 方法
1.2.1 样本及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）获取和肺组织病理学
实验完成后，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉实验动物，开胸、暴露气管及肺，用套管针插入左支气管并固定，拔出针芯后用2 ml生理盐水灌洗左肺，然后缓慢回抽，如此反复3次，回收率约75%；取出右上肺固定24 h，常规石蜡包埋、切片，行HE染色观察肺组织病理改变情况。
1.2.2 干湿重比（dry/wetratio）
开胸取肺组织，称重后置80℃烤箱烘烤48 h，干燥至恒重。肺干湿比=湿重/干重。
1.2.3 肺组织TLR4蛋白的检测
采用Western蛋白质印迹法，取20 mg冰冻肺组织加入0.5 ml预冷的组织细胞裂解液，匀浆后4 ℃下1 000 r/min离心10 min。采用二辛可宁酸法（BCA法）测定蛋白浓度。每个样本取40 μg总蛋白进行标准Western步骤。使用一抗稀释液1 : 1 000稀释一抗（TLR4抗体，abcam公司），使用1 : 2 000稀释的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后加入化学发光剂，暗室中曝光、显影和定影，使用专门的图像分析仪分析和定量照片。
1.2.4 肺脏组织损伤评分标准
在处死动物后取得的肺病理切片中，对镜下肺组织的以下5种病理改变进行综合评估：肺泡腔壁水肿增厚，肺泡内出血，中性粒细胞浸润肺泡腔或浸润肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根据每项有无指标病变，进行评分（0= 无病变，1= 有病变），累加各项评分的总分作为肺病理损伤评分，0分为正常肺组织，5分为损伤最严重[10]。
1.2.5 BALF中TNF-α、IL-6和HMGB-1的测定
肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、HMGB-1分别采用相应的试剂盒（索莱宝，北京）进行测定，所有步骤均严格按照说明书进行。
1.3 统计学分析
所有数据采用均数±标准差（X±s）的表示。统计数据采用IBM SPSS Statistics 20软件作方差分析及单因素分析ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组实验动物BALF中HMGB-1及炎症因子水平
VILI组BALF中HMGB-1高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组BALF中HMGB-1水平较VILI组降低（P＜0.05）；VILI组BALF中TNF-α、IL-6显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组BALF中HMGB1水平较VILI组显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义，见图 1。
图1
各组实验动物BALF中HMGB1及炎症因子表达情况
注：#与对照组比较
2.2 各组实验动物肺组织TLR4表达情况
VILI组肺组织中TLR4表达水平显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组肺组织中TLR4表达水平较VILI组显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义，见图 2。
图2
各组实验动物肺组织中TLR4表达情况
注：#与对照组比较
2.3 各组实验动物肺损伤情况比较
VILI组肺干湿重比显著高于对照组（P＜0.05，图 3A），VILI+ 乌司他丁组肺干湿重比较VILI组显著降低（P＜0.05）；VILI组肺病理评分显著高于对照组（P＜0.05），VILI+ 乌司他丁组肺病理评分较VILI组显著降低（P＜0.05，图 3B）。与对照组（图 4A）比较，VILI组（图 4B） 肺组织出现肺泡壁组织水肿、肺间质出血以及中性粒细胞浸润等典型肺损伤的病理结构改变更大，VILI+ 乌司他丁组（图 4C）肺组织病理损伤程度较VILI组（图 4B）出现显著改善。
图3
各组实验动物肺干湿重比及肺病理评分情况
注：#与对照组比较
图4
各组实验动物肺病理损伤情况 HE ×200
注：A为对照组；B为VILI组；C为VILI+ulinastatin组
3 讨论
既往文献表明，呼吸机使用不当可以造成肺气压伤、容量肺和肺不张等机械性损伤，然后诱发肺炎症细胞浸润和炎性因子释放，引起VILI [11-14]。VILI的中心环节是炎症反应，参与VILI的主要炎症因子有TNF-α和IL-6。TNF-α是导致炎性介质级联反应的始发因子，可促进其他细胞因子的继发释放，促进机体产生炎性反应瀑布效应，同时更能直接作用于肺泡上皮细胞，对肺功能及结构产生直接损伤[9-10]。IL-6在感染或外伤引起的急性炎症反应中诱导急性期反应蛋白的合成，发挥放大炎症反应程度的作用[9]。本研究结果显示VILI大鼠模型BALF中TNF-α和IL-6水平升高，肺干/湿重比较对照组显著升高，肺病理损伤程度明显比对照组严重，说明TNF-α和IL-6参与VILI的形成过程，大潮气量机械通气引起了实验动物肺部严重的炎症反应，继而导致肺损伤。
HMGB-1是核内一类非组蛋白核蛋白，存在于所有真核细胞中，其序列高度保守。结构上HMGB1由三个区域组成，两个含正电荷的区域（A盒和B盒）和一个含负电荷的羧基端；功能上，A盒和B盒为DNA结合区，B盒具有细胞因子样活性，可诱导巨噬细胞分泌其他炎症因子[15-16]。HMGB-1在组织损伤或者细胞破坏后可释放入血直接作为炎症因子参与机体固有免疫应答，激活多形核白细胞、单核巨噬细胞及自然杀伤细胞，促进炎症的发生和发展[17]。研究发现Toll样受体4可作为HMGB-1的受体与HMGB-1结合，继而通过MyD88依赖途径，最后激活NF-кB，引起炎症反应[18]。本研究结果也发现VILI组大鼠肺泡灌洗液中HMGB-1、肺组织中TLR4表达水平均较对照组升高，这说明VILI组肺泡灌洗液中升高的炎症因子可能是由升高的HMGB-1刺激TLR4受体引起的。
乌司他丁是一种广谱的酶抑制剂，对胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、激肽释放酶等具有较强的抑制作用，同时它能稳定线粒体膜，从而抑制多种炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-6）的表达上调[19]。本研究结果显示乌司他丁可抑制VILI模型BALF中HMGB-1、TNF-α和IL-6的表达以及肺组织中TLR4的表达。从机制上讲，破坏的线粒体膜可引起细胞凋亡，进一步导致HMGB-1的释放增加，乌司他丁可以稳定线粒体膜，从而减少HMGB-1的释放[20]，并减少HMGB-1通过TLR4途径引起的下游TNF-α和IL-6水平升高；从另一方面讲，乌司他丁本身具有强大的非特异性抗炎作用，可降低机体TNF-α和IL-6的水平[9]，减少炎症反应对组织的炎性损伤，进一步减少HMGB-1的释放。因此乌司他丁在VILI中的作用在于打破了“细胞损伤-HMGB-1释放-炎症水平升高-细胞损伤”这个恶性循环，从整体上降低了VILI过程中肺的炎症反应水平，从而发挥保护VILI肺功能和结构的作用。
本研究结果发现HMGB-1可能通过TLR4受体途径参与VILI引起的炎症反应和继发的肺炎性损伤；而乌司他丁可以通过减少HMGB-1通过TLR4途径引起的肺炎症因子升高，起到保护肺功能和结构的作用。这为临床使用乌司他丁治疗VILI提供了理论依据和实验基础。
