充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）是心肌梗死的并发症，严重影响人类的健康，尽管目前药物治疗CHF的效果已经有很大提高，但如何彻底使由心肌梗死所导致的损伤心肌复原仍然是个世界性问题。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植已被证实能够修复梗死的心肌，大量证据表明MSCs可以在人和动物体内产生新的心肌细胞。本篇综述将探讨MSCs移植治疗CHF这一问题。
引用本文： 刘圣辰, 王强, 卢子润, 王东进. 骨髓间充质干细胞治疗充血性心力衰竭的研究现状. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(11): 1108-1111. doi: 10.7507/1007-4848.20160259 复制
随着心肌梗死治疗技术的进步以及对心肌缺血早期诊断的增加，心肌缺血性疾病的院内死亡率已经显著下降，这也间接导致缺血后患有充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）的患者数量明显增加[1-2]。常规药物治疗不能使受损的心肌复原，因此并不能使CHF得到显著改善[3]。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很高的分化潜能，已被证实可以用于治疗CHF[4-5]。用MSCs治疗CHF主要涉及到心肌缺血后局部细胞因子的表达变化、细胞因子干细胞的趋化归巢作用以及干细胞归巢后的治疗作用。有研究表明，MSCs移植疗法能增加有功能的心肌细胞数目，修复受损的心肌细胞，继而使心肌梗死灶面积减小，左心室射血分数增加，显著改善心脏功能[6-9]。因此，MSCs可能是治疗CHF最有效的方法之一。本文主要对现有的间充质干细胞治疗心肌梗死的现状、原理及前景做较全面的论述，以期为将来的临床治疗提供更好的理论指导。
1 骨髓间充质干细胞的分化潜能
目前用于尝试治疗CHF的干细胞主要是MSCs，因为其特有的优势：（1）MSCs是造血组织的前体细胞，它可以相对较容易地从自身骨髓中获得；（2）通过体外扩增，这些MSCs依然具有多向分化的潜能，表现出较低的免疫原性，并且容易冷冻；（3）MSCs可以在具有血管内皮生长因子的培养条件下分化成血管内皮细胞，而且可以在刺激下分化成心肌细胞[10-11]；（4）其分化来的心肌细胞能与周围宿主心肌细胞形成有效的电-机械耦联。因此，MSCs更适用于临床。
通过修复和再生受损的心肌是对传统的治疗机制的挑战。内源性修复方式是将MSCs移植到受损的心肌区域，使之增殖分化，形成新的血管和心肌组织，从而修补损伤的心肌细胞，恢复心肌的功能[12-14]。已有的研究表明，心肌梗死后将MSCs移植入损伤的心脏之后，可以分化成心肌细胞和血管内皮细胞[15-17]。Fukuda [18]证明在体外实验中，MSCs在5氮胞苷的作用下可以自发转化为心肌肌管样组织。Supokawej等[19]发现经过5氮胞苷处理过的间充质干细胞可以表达包括心房肽、脑钠素、心肌细胞特异性转录因子及Nkx2.5/Csx在内的心肌细胞基因。此外，这些细胞还显示出了心肌细胞连接所特有的闰盘结构，形成肌丝并且自发的产生收缩。Wang等报道MSCs注射进入心肌组织之后，甚至不需要5氮胞苷处理就可以分化并表现出心肌细胞的特性，而且注射的间充质干细胞在正常心肌中较疤痕组织中更易分化为心肌细胞。Madonna等[20]证明移植MSCs可以使受损的心室中形成新的心肌组织。标记的移植干细胞可以表达心肌细胞增强因子，心肌特异性转录因子-4和连接蛋白-43。在体内实验的啮齿类和大型动物实验模型以及Meta分析的结果均显示干细胞处理组可以显著改善左心室射血分数，减少梗死瘢痕的面积，并降低左心室收缩期末容积，还可以进一步减少心肌梗死、死亡，心衰再入院以及重复的血运重建的发生[21-23]。
2 心肌细胞再生的机制
围绕受损心肌的修复和再生问题，学者们做了许多工作，探讨心肌细胞再生的可能性和了解心肌细胞再生的机制，以发现有效修复受损心肌细胞及功能的方法。目前对心肌细胞再生的机制有如下3种假设。
2.1 转分化理论
此理论是在间充质干细胞与乳鼠心肌细胞共培养之后，发现可以表达连接蛋白-43、心房肽以及肌钙蛋白-I，而第一次被提出的。这些有意义的结果和转分化理论的提出是有争议的，在2004年Murry等[24]用基因失踪技术来研究注射入心肌梗死之后的小鼠心脏中的干细胞，结果他们未发现任何的转分化证据。一系列的研究表明移植以后的干细胞保存在体内的机率很低，因此转分化理论可能并不是干细胞分化的机制。
2.2 心肌融合理论
Rose等[25]将用绿色荧光蛋白标记的MSCs注入急性缺血的心肌组织中，接着他们发现绿色荧光蛋白阳性的细胞可以表现出心肌细胞特异的标记和形态。他们用转基因技术标记的基因证明了这些细胞是已经融合的结果而不是转分化的结果。然而，相关研究也表明这种融合机率非常低。尽管细胞融合看起来是存在的，但是这并不是细胞心肌化的最主要机制。
2.3 干细胞调节的旁分泌作用
目前，这种假说理论已经被广泛接受。这种理论的支持者认为干细胞释放的炎症趋化因子和炎性分子的作用上调宿主细胞的再生过程。梗死的心肌组织中植入干细胞以后，组织中的血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子（bFGF）以及胰岛素样生长因子-1的表达量都出现上调，这些都有可能改善心功能。将收集到的培养干细胞的条件培养基加入到缺血的心肌组织中可以对心肌组织产生有利的作用[26]。这些研究表明，即使是在没有干细胞存在的条件下，干细胞分泌到培养基中的因子依然可以起到刺激心肌再生的作用。此外，Dayan等[27]证明当干细胞被注射到急性心肌缺血的心肌中之后可以分泌较低水平的促炎及抗炎因子，其中一个重要的抗炎症因子（IL-10）将会被分泌出来，而金属肽酶-1的抑制剂金属肽酶-2的分泌则会减少，这些都可以促进心脏左心室射血分数的增加。上述有利证据表明干细胞的旁分泌作用可能是心肌细胞再生的主要机制。
3 现有的MSCs移植方法
许多移植干细胞方法已报道，但所有方法都是试图转移最大量干细胞到梗死的心肌中去。在这些报道中，心肌内、静脉的和经冠状动脉内注射是最常见的移植干细胞到坏死心肌中的方法[28]。尽管这些方法都具有他们自己的优势，但这些均有高度侵入性精细操作，缺乏特异性的靶目标而且还有很高器官栓塞机率。为克服这些问题，运用各种载体工具来转移干细胞已经为人们所共识。在一项研究中发现，运用纤维蛋白胶转移干细胞可以显著增加移植细胞存活数量，减少梗死面积并增加缺血心肌血流量[29]。在另一项研究中，运用可注射的基底膜来转移干细胞的研究结果显示，相对于只接受了干细胞移植的对照组，干细胞基质胶组表现出更好的心肌恢复效果，移植/梗死比例在干细胞基质胶组中显著升高（P < 0.034）[30]。近来，有研究者认为通过植入MSCs的热敏凝胶进行心肌内递送[31]。成肌细胞板由感温、高分子接枝的细胞培养皿构成，两个单层构造的成肌细胞板（5×106个细胞/板）的植入，结合造血干细胞的聚集，通过释放基质细胞衍生因子-1和其他生长因子，可以成功修复受损心肌，减少心肌的纤维化，并阻止心肌重塑。以往的研究已经表明了干细胞疗法对心肌再生的剂量-反应关系上的效果，这说明对梗死部位最佳的细胞送达十分重要[32-33]。
因此，尽管这些新方案较常规方法具有更多有益的结构和操作上的优势，但这些新方案和直接干细胞注射一样，仍然构成一种无差别的心脏给药方式，具有很高的随机性，需要进一步改善。因此，依然需要为干细胞的定向递送设计一个适合的干细胞递送系统。
4 干细胞疗法在心肌再生中的作用以及其局限性
2001年，Strauer等[34]报道1例在心肌梗死后6 d接受自体骨髓干细胞移植术的46岁患者。结果表明该患者在移植了干细胞之后其心脏梗死面积从24.6%下降至15.7%，而且左心室射血分数也增加了20%。这一原始结果非常令人吃惊，进而促进了一系列临床试验的开展。到2007年底，三个重要的临床研究已经完成：急性心肌梗死后输入大量的祖细胞用来完成心肌重建、通过骨髓移植来加强ST段抬高的梗死心肌的再生、在急性心肌缺血的冠状动脉内的骨髓干细胞移植术。这些试验中采用了类似的设计，包括收获自体的干细胞，以及随后的缺血24 h至7 d之内冠状动脉内输入干细胞。总的来说，这些研究都表明干细胞输入可以使左心室射血分数提升3.3%～5.9%[35-37]。Abdel-Latif等[38]对18组随机和队列的研究进行了Meta分析，研究共纳入999例患者，结果发现左心室射血分数增加3.66%。另一项仅限于随机试验的Meta分析综合了7例冠状动脉或心脏内注射干细胞的试验研究，共纳入237例患者，结果表明左心室射血分数增加3.7%。以上研究结果都为心肌梗死的治疗展示了令人期待的临床治疗途径[39]。
尽管动物实验跟临床试验之间都存在差异，但迄今为止所有的证据都证明干细胞移植技术没有对患者预后产生不利的影响。这表明，在临床实施方案中观察到的干细胞治疗缺乏全细胞潜能，这可能与异质细胞的类型和数量有关，与细胞滞留状况较差和成熟MSCs质量较差以及选的传递路径有关。体内外研究表明，在干细胞注射到体内的第一个24 h内细胞存活率仅为10%～44.8%[40-41]。一直以来，移植以后干细胞的丢失都推测是由于细胞的死亡，或者是由于心脏的跳动引起的一种机械性的驱赶。将干细胞移植到受损的心肌中的最主要问题是由于灌注不足再加上大量的自由基形成从而导致了细胞的坏死和凋亡[42-43]。这些因素都促发了激烈的炎症反应，并可能引起新的心肌缺血。因此，细胞凋亡加上由于心跳所导致的机械性因素进一步降低了干细胞的滞留，进而影响了干细胞移植治疗的效果。
5 MSCs治疗方法的前景
大量的实验已经证实，MSCs移植入受损的心脏中可以减小梗死面积，提高左心室射血分数[44-45]。但是，用MSCs移植疗法治疗缺血性心脏疾病还没有完全发挥其应有的治疗潜能，一个很重要的受限因素就是移植后的MSCs只有很少一部分能存活下来。如何解决这个问题依然是干细胞移植疗法治疗CHF的一个重要环节。如果能找到某种方法来提高干细胞的存活率，那么干细胞治疗心肌梗死以及CHF的疗效将大大的提高。
随着心肌梗死治疗技术的进步以及对心肌缺血早期诊断的增加，心肌缺血性疾病的院内死亡率已经显著下降，这也间接导致缺血后患有充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）的患者数量明显增加[1-2]。常规药物治疗不能使受损的心肌复原，因此并不能使CHF得到显著改善[3]。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很高的分化潜能，已被证实可以用于治疗CHF[4-5]。用MSCs治疗CHF主要涉及到心肌缺血后局部细胞因子的表达变化、细胞因子干细胞的趋化归巢作用以及干细胞归巢后的治疗作用。有研究表明，MSCs移植疗法能增加有功能的心肌细胞数目，修复受损的心肌细胞，继而使心肌梗死灶面积减小，左心室射血分数增加，显著改善心脏功能[6-9]。因此，MSCs可能是治疗CHF最有效的方法之一。本文主要对现有的间充质干细胞治疗心肌梗死的现状、原理及前景做较全面的论述，以期为将来的临床治疗提供更好的理论指导。
1 骨髓间充质干细胞的分化潜能
目前用于尝试治疗CHF的干细胞主要是MSCs，因为其特有的优势：（1）MSCs是造血组织的前体细胞，它可以相对较容易地从自身骨髓中获得；（2）通过体外扩增，这些MSCs依然具有多向分化的潜能，表现出较低的免疫原性，并且容易冷冻；（3）MSCs可以在具有血管内皮生长因子的培养条件下分化成血管内皮细胞，而且可以在刺激下分化成心肌细胞[10-11]；（4）其分化来的心肌细胞能与周围宿主心肌细胞形成有效的电-机械耦联。因此，MSCs更适用于临床。
通过修复和再生受损的心肌是对传统的治疗机制的挑战。内源性修复方式是将MSCs移植到受损的心肌区域，使之增殖分化，形成新的血管和心肌组织，从而修补损伤的心肌细胞，恢复心肌的功能[12-14]。已有的研究表明，心肌梗死后将MSCs移植入损伤的心脏之后，可以分化成心肌细胞和血管内皮细胞[15-17]。Fukuda [18]证明在体外实验中，MSCs在5氮胞苷的作用下可以自发转化为心肌肌管样组织。Supokawej等[19]发现经过5氮胞苷处理过的间充质干细胞可以表达包括心房肽、脑钠素、心肌细胞特异性转录因子及Nkx2.5/Csx在内的心肌细胞基因。此外，这些细胞还显示出了心肌细胞连接所特有的闰盘结构，形成肌丝并且自发的产生收缩。Wang等报道MSCs注射进入心肌组织之后，甚至不需要5氮胞苷处理就可以分化并表现出心肌细胞的特性，而且注射的间充质干细胞在正常心肌中较疤痕组织中更易分化为心肌细胞。Madonna等[20]证明移植MSCs可以使受损的心室中形成新的心肌组织。标记的移植干细胞可以表达心肌细胞增强因子，心肌特异性转录因子-4和连接蛋白-43。在体内实验的啮齿类和大型动物实验模型以及Meta分析的结果均显示干细胞处理组可以显著改善左心室射血分数，减少梗死瘢痕的面积，并降低左心室收缩期末容积，还可以进一步减少心肌梗死、死亡，心衰再入院以及重复的血运重建的发生[21-23]。
2 心肌细胞再生的机制
围绕受损心肌的修复和再生问题，学者们做了许多工作，探讨心肌细胞再生的可能性和了解心肌细胞再生的机制，以发现有效修复受损心肌细胞及功能的方法。目前对心肌细胞再生的机制有如下3种假设。
2.1 转分化理论
此理论是在间充质干细胞与乳鼠心肌细胞共培养之后，发现可以表达连接蛋白-43、心房肽以及肌钙蛋白-I，而第一次被提出的。这些有意义的结果和转分化理论的提出是有争议的，在2004年Murry等[24]用基因失踪技术来研究注射入心肌梗死之后的小鼠心脏中的干细胞，结果他们未发现任何的转分化证据。一系列的研究表明移植以后的干细胞保存在体内的机率很低，因此转分化理论可能并不是干细胞分化的机制。
2.2 心肌融合理论
Rose等[25]将用绿色荧光蛋白标记的MSCs注入急性缺血的心肌组织中，接着他们发现绿色荧光蛋白阳性的细胞可以表现出心肌细胞特异的标记和形态。他们用转基因技术标记的基因证明了这些细胞是已经融合的结果而不是转分化的结果。然而，相关研究也表明这种融合机率非常低。尽管细胞融合看起来是存在的，但是这并不是细胞心肌化的最主要机制。
2.3 干细胞调节的旁分泌作用
目前，这种假说理论已经被广泛接受。这种理论的支持者认为干细胞释放的炎症趋化因子和炎性分子的作用上调宿主细胞的再生过程。梗死的心肌组织中植入干细胞以后，组织中的血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子（bFGF）以及胰岛素样生长因子-1的表达量都出现上调，这些都有可能改善心功能。将收集到的培养干细胞的条件培养基加入到缺血的心肌组织中可以对心肌组织产生有利的作用[26]。这些研究表明，即使是在没有干细胞存在的条件下，干细胞分泌到培养基中的因子依然可以起到刺激心肌再生的作用。此外，Dayan等[27]证明当干细胞被注射到急性心肌缺血的心肌中之后可以分泌较低水平的促炎及抗炎因子，其中一个重要的抗炎症因子（IL-10）将会被分泌出来，而金属肽酶-1的抑制剂金属肽酶-2的分泌则会减少，这些都可以促进心脏左心室射血分数的增加。上述有利证据表明干细胞的旁分泌作用可能是心肌细胞再生的主要机制。
3 现有的MSCs移植方法
许多移植干细胞方法已报道，但所有方法都是试图转移最大量干细胞到梗死的心肌中去。在这些报道中，心肌内、静脉的和经冠状动脉内注射是最常见的移植干细胞到坏死心肌中的方法[28]。尽管这些方法都具有他们自己的优势，但这些均有高度侵入性精细操作，缺乏特异性的靶目标而且还有很高器官栓塞机率。为克服这些问题，运用各种载体工具来转移干细胞已经为人们所共识。在一项研究中发现，运用纤维蛋白胶转移干细胞可以显著增加移植细胞存活数量，减少梗死面积并增加缺血心肌血流量[29]。在另一项研究中，运用可注射的基底膜来转移干细胞的研究结果显示，相对于只接受了干细胞移植的对照组，干细胞基质胶组表现出更好的心肌恢复效果，移植/梗死比例在干细胞基质胶组中显著升高（P < 0.034）[30]。近来，有研究者认为通过植入MSCs的热敏凝胶进行心肌内递送[31]。成肌细胞板由感温、高分子接枝的细胞培养皿构成，两个单层构造的成肌细胞板（5×106个细胞/板）的植入，结合造血干细胞的聚集，通过释放基质细胞衍生因子-1和其他生长因子，可以成功修复受损心肌，减少心肌的纤维化，并阻止心肌重塑。以往的研究已经表明了干细胞疗法对心肌再生的剂量-反应关系上的效果，这说明对梗死部位最佳的细胞送达十分重要[32-33]。
因此，尽管这些新方案较常规方法具有更多有益的结构和操作上的优势，但这些新方案和直接干细胞注射一样，仍然构成一种无差别的心脏给药方式，具有很高的随机性，需要进一步改善。因此，依然需要为干细胞的定向递送设计一个适合的干细胞递送系统。
4 干细胞疗法在心肌再生中的作用以及其局限性
2001年，Strauer等[34]报道1例在心肌梗死后6 d接受自体骨髓干细胞移植术的46岁患者。结果表明该患者在移植了干细胞之后其心脏梗死面积从24.6%下降至15.7%，而且左心室射血分数也增加了20%。这一原始结果非常令人吃惊，进而促进了一系列临床试验的开展。到2007年底，三个重要的临床研究已经完成：急性心肌梗死后输入大量的祖细胞用来完成心肌重建、通过骨髓移植来加强ST段抬高的梗死心肌的再生、在急性心肌缺血的冠状动脉内的骨髓干细胞移植术。这些试验中采用了类似的设计，包括收获自体的干细胞，以及随后的缺血24 h至7 d之内冠状动脉内输入干细胞。总的来说，这些研究都表明干细胞输入可以使左心室射血分数提升3.3%～5.9%[35-37]。Abdel-Latif等[38]对18组随机和队列的研究进行了Meta分析，研究共纳入999例患者，结果发现左心室射血分数增加3.66%。另一项仅限于随机试验的Meta分析综合了7例冠状动脉或心脏内注射干细胞的试验研究，共纳入237例患者，结果表明左心室射血分数增加3.7%。以上研究结果都为心肌梗死的治疗展示了令人期待的临床治疗途径[39]。
尽管动物实验跟临床试验之间都存在差异，但迄今为止所有的证据都证明干细胞移植技术没有对患者预后产生不利的影响。这表明，在临床实施方案中观察到的干细胞治疗缺乏全细胞潜能，这可能与异质细胞的类型和数量有关，与细胞滞留状况较差和成熟MSCs质量较差以及选的传递路径有关。体内外研究表明，在干细胞注射到体内的第一个24 h内细胞存活率仅为10%～44.8%[40-41]。一直以来，移植以后干细胞的丢失都推测是由于细胞的死亡，或者是由于心脏的跳动引起的一种机械性的驱赶。将干细胞移植到受损的心肌中的最主要问题是由于灌注不足再加上大量的自由基形成从而导致了细胞的坏死和凋亡[42-43]。这些因素都促发了激烈的炎症反应，并可能引起新的心肌缺血。因此，细胞凋亡加上由于心跳所导致的机械性因素进一步降低了干细胞的滞留，进而影响了干细胞移植治疗的效果。
5 MSCs治疗方法的前景
大量的实验已经证实，MSCs移植入受损的心脏中可以减小梗死面积，提高左心室射血分数[44-45]。但是，用MSCs移植疗法治疗缺血性心脏疾病还没有完全发挥其应有的治疗潜能，一个很重要的受限因素就是移植后的MSCs只有很少一部分能存活下来。如何解决这个问题依然是干细胞移植疗法治疗CHF的一个重要环节。如果能找到某种方法来提高干细胞的存活率，那么干细胞治疗心肌梗死以及CHF的疗效将大大的提高。