引用本文： 黄骏荣, 祝忠群, 刘刚, 陈会文, 冯林音. 新生小鼠脑切片体外循环灌流模型中白质损伤的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(4): 295-300. doi: 10.7507/1007-4848.201605007 复制
以往认为脑白质损伤是早产儿特有的神经损伤，近年随着新生儿先天性心脏病手术的开展，核磁共振研究发现，在足月新生儿体外循环手术后也发生脑白质损伤，而且发生率高达 25%～50% 以上[1-2]，严重影响患儿神经和心理发育，导致在手术近、远期出现包括精细和粗大运动缺陷等在内的严重神经发育障碍和心理行为问题[3]。
尽管在临床上观察到体外循环后白质损伤现象，但是在人体研究中，由于技术和伦理等因素的影响，至今还没有直接的人类体外循环下白质损伤的病理学和细胞学证据，因此人们只有通过借助动物体外循环模型来证实白质损伤的存在。先前研究者往往采用大动物或小动物进行模拟人类体外循环灌注的方式来研究脑损伤[4-6]，由于这类模型影响因素众多，实验条件控制难度也比较大，对脑组织损伤的评价很难做到精确定位和实时取材，近年来许多研究者采用脑组织切片进行体外灌流的模型来研究白质损伤[7-9]，为此我们拟建立新生大鼠离体脑切片体外灌注模型，通过控制灌流温度及采用氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）方法来模拟不同温度体外循环灌注以及停循环状态[10-11]，研究这一模型是否可以模拟体外循环和停循环的病理生理过程，并探讨在 OGD 状态下是否可以造成白质中少突胶质前体细胞（preoligodendrocytes，preOL）损伤，为体外循环白质损伤提供直接的细胞学证据。
1 材料及方法
1.1 实验动物、试剂及分组
1.1.1 实验动物 7 天龄 Sprague-Dawley（SD）大鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验操作严格遵守中国科学院上海药物研究所实验动物管理委员会规定。
1.1.2 实验试剂 少突胶质细胞标记物 O4（O4 为脑硫脂）抗体购自 Millipore 公司。髓鞘碱性蛋白 MBP 抗体购自 Abcam 公司。羊抗兔 IgG 荧光二抗购自 Invitrogen 公司。其他相关试剂均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.1.3 分组 将 40 只 SD 大鼠随机制作活体脑切片，每只大鼠约切出 3～5 片脑切片，后将脑切片随机分为 5 组，每组含脑切片 24 片，包括 36℃ 氧合人工脑脊液对照组及 60 min 不同温度下（36℃，32℃，25℃，15℃）的OGD组。
1.2 脑切片灌流模型建立
1.2.1 实验方法 将大鼠麻醉，无菌条件下迅速解剖动物的大脑，并立即置入冰冷的切片用人工脑脊液（SaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 葡萄糖，75 mmol/L 蔗糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）内。用 Mcllwain 组织切割器将大脑以冠状切面切成 400 μm 厚脑切片，并将其置于含有氧合 SaCSF 的培养皿，在 37℃，95% 湿度及 5% CO2 浓度下培养至少 1 h。最后将脑切片转移至含有灌流用人工脑脊液（PaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L葡萄糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）的定制灌流培养皿中，连接管道建立灌流系统，并将其放置于可调控温度的培养箱（上海博讯实业有限公司，中国）中，模拟体外循环灌流及其温度变化。
表1
人工脑脊液灌流液成分
1.2.2 氧糖剥夺 OGD被用于复制深低温停循环在心脏手术中的应用。通过改变灌流溶液，其中 PaCSF 中的葡萄糖被取代为 10 mmol/L 的蔗糖，并以 95% 氮气/5% 二氧化碳进行气体混合。当 OGD 结束后将灌流溶液更换回 PaCSF 溶液，并进行 24 h 持续灌流。
1.2.3 灌流系统和流程 在 36℃ 下建立平衡灌流系统后，用约 30 min 降温至目标温度，之后在目标温度水平更换 OGD 溶液，以此进行 60 min 氧糖剥夺过程。当 OGD 结束时，将灌流溶液更换为氧合 PaCSF，进行 10 min 再氧合，随后用约 30 min 复温至 36℃，并维持持续灌注约 24 h。对照组为在 36℃ 及相同周期下持续灌流氧合 PaCSF。灌流系统和流程见图 1、图 2。
图1
实验灌流系统示意图
图2
灌流程序示意图
1.3 免疫鉴定方法
灌流程序结束后，取出脑切片并加入 4% 多聚甲醛（PFA）于室温固定 1 h，磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH=7.4）清洗 3 遍；然后加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱过夜孵育；切底脱水后用组织冰冻切片包埋剂（OCT）在冰冻切片机包埋，将脑片切成 20 μm 切片并置于载玻片上；室温下用含 10% 葡萄糖及 5% 牛血清白蛋白的封闭液封闭 1 h。将稀释好的一抗孵育玻片上的脑切片，湿盒中 4℃ 冰箱过夜孵育。少突胶质细胞标记物 O4 抗体及髓鞘碱性蛋白 MBP 抗体的稀释浓度分别为：1：100 及 1：200。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1：200 比例稀释联有荧光的二抗，用与一抗相同的方法加 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育玻片，室温避光 1 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬灭封片剂 Dako Cytomation 封片，Olympus 倒置荧光显微镜观察。图形的定量处理用 Image-pro plus 5.1 软件完成。每一张脑切片在胼胝体部位随机选取 3 个视野采 400 倍照片，并计算每个视野的 O4 阳性染色数量与 DAPI 阳性染色数量的百分比值。荧光绿色提示为 O4 阳性表达，蓝色提示为 DAPI 阳性表达。
1.4 统计学分析
对免疫荧光染色的实验结果进行统计学分析，各组数据之间利用 GraphPad Prism 6 软件通过 one way ANOVA 及 Bonferroni post hoc test 进行差异性检验。计量资料以均数±标准差（ ）表示。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑切片灌流 OGD 后髓鞘碱性蛋白 MBP 荧光表达及形态
MBP 表达的变化可作为脑白质损伤程度的指标。为探讨本实验脑切片模型能否有效复制体外循环 DHCA 所引起的脑白质损伤，测试了在灌流程序后髓鞘 MBP 的表达程度。MBP 免疫荧光染色表明，MBP 阳性细胞的形态学和荧光表达改变在对照组及 15℃ OGD 组之间差异无统计学意义。然而，MBP 阳性细胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 组均出现不同程度的形态改变以及荧光表达减少，并与 OGD 温度呈显著正相关（图 3）。
图3
离体脑切片 OGD 灌流模型 MBP 免疫荧光鉴定 ×400，MBP 阳性免疫荧光染色呈白色； a. 对照组； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD；e. 36℃ OGD
2.2 脑切片灌流 OGD 后 O4 荧光表达
少突胶质细胞前体细胞（preOL，O4+）是在人类孕中后期及婴幼儿期脑白质损伤的主要目标细胞。脑切片以 O4 抗体标记来评价 OGD 对 preOL 细胞的损伤程度。O4 阳性细胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 组均出现不同程度的荧光表达减少，并与 OGD 温度呈显著正相关。O4 阳性细胞的形态学和荧光表达改变在对照组及 15℃ OGD 组之间差异无统计学意义（图 4）。
图4
离体脑切片 OGD 灌流模型 O4 免疫荧光鉴定 ×400，O4 阳性免疫荧光染色呈绿色，DAPI 阳性免疫荧光染色呈蓝色； a. 对照组； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD； e. 36℃ OGD； f. 统计图，各组 O4 阳性细胞与 DAPI 阳性细胞百分比，与对照组比较，*P<0.01
3 讨论
3.1 离体脑切片灌流模型的建立与意义
在小儿心脏外科体外循环脑损伤研究中，一般采用大动物如幼年猪、狗和羊或者小动物如幼年大鼠和豚鼠等在体外利用氧合器和滚轴泵建立类似手术中体外循环，来模拟体外循环和深低温停循环过程，进而研究和评价脑损伤及其程度以及各种防治方法有效性[4-6]。这一模型完全模拟病人手术中体外循环状态，较准确反映了体外循环下全身器官灌注和损伤，但是这种模型虽然反映了脑整体器官的病理生理状态，但是在评价脑组织细微结构以及组织和分子生物学方面，不能做到脑区域精确定位、不能及时有效地获得脑组织、而且在取材时脑组织容易受损从而影响脑损伤的评价，同时在动物模型干扰因素众多、费用较贵。
近年来，脑切片灌流方法广泛应用各种脑病理生理以及各种药物评价研究中[12-14]，其优点在于：（1）能够较为精确定位病变区域，在组织、细胞以及分子水平上观察脑损伤状况；（2）灌流系统能够很好控制实验条件，如脑组织灌流温度、PH 值、灌流液体化学成份、氧合情况以及灌流时间等，实验重复性好；（3）取材方便、简单易行且费用低廉。最近美国国立儿童医院也采用脑切片灌流模型用于研究脑白质损伤[7-9]，通过控制灌流温度和采用 OGD，较好地模拟类似手术中体外循环和 DHCA 脑损伤的特点。受到这些研究的启发，我们在中国科学院上海药物研究所的帮助下，建立了新生小鼠脑切片灌流系统，并采用 OGD 方法模拟 DHCA，研究结果发现，调整不同的灌注和 OGD 温度时，脑白质中形成轴突髓鞘的成熟少突胶质细胞（MBP 阳性）受损，而且随着温度上升，细胞形态变化和荧光表达明显减低，这种细胞损伤程度变化与体外循环和停循环病理生理完全灌注模型较好地复制了手术中体外循环及 DHCA 病理生理过程和效应。
相比一些体外细胞实验模型，脑切片灌流模型仍有相对较完整的组织细胞结构，更全面地反应脑细胞在损伤过程中的共同作用，状态更接近体内实验，可以达到体内动物模型同样的研究效应能力，在研究白质损伤中具有得天独厚的优势。但是这一模型在研究整体机体状态，如血流动力学、脑组织变化以及长期神经系统发育等方面较为欠缺[15-16]。
3.2 CPB/DHCA 对白质的损伤
本研究部分应用离体脑切片灌流模型，研究 CPB/DHCA 对脑白质 preOL 损伤。我们首先利用 MBP 免疫荧光初步检测脑白质在 OGD 灌流后的损伤程度，结果显示 MBP 阳性细胞在不同温度 OGD 设置呈现不同程度的损伤，在 25℃、32℃ 及 36℃ 出现显著的细胞损失及形态改变，包括突触消失及细胞膜变薄碎化等。结果提示脑白质细胞会受 OGD 影响出现急性损伤，更为重要的是我们发现利用 O4 免疫荧光染色观察脑切片模型在实施不同温度的 OGD 灌流后（O4+）损伤状态，可见在 36℃ OGD 下 preOL 有显著损失，在 15℃ OGD 损失程度则显著减少，可见 preOL 损伤与各温度 OGD 组中呈现正性相关。从以上数据表明 CPB/DHCA 能引起 preOL 损伤。
preOL 是少突胶质细胞（OL）细胞系发育的重要阶段，在人胚胎后 3 个月是脑白质中 OL 细胞中的主要细胞，约占 90%，到出生时达到 50%[17]。在 OL 细胞系中，PreOL 对缺血缺氧损伤最敏感，也是感染和炎症损伤的靶细胞[6,18]。preOL 损伤可有以下 3 种结局[19]：（1）preOL 急性死亡；（2）preOL 存活但正常细胞进程丧失，随后的细胞分化和髓鞘化失败；（3）preOL 异常。无论何种损伤，由于 preOL 数量急剧减少，其随后的细胞分化为成熟 OL 也明显减少，结果是髓磷脂合成减少和轴突髓鞘化障碍，最终导致脑白质低髓鞘化和白质损伤[18-20]。因此 PreOL 损伤是最终导致白质损伤的细胞学基础。在本研究中我们发现体外循环和停循环模型中的确存在 preOL 损伤和数量减少以及成熟 OL 明显减少，从而进一步导致整个白质低髓鞘化和损伤。
本研究建立了新生小鼠脑切片体外灌流和 OGD 模型，证实这种模型可有效模拟和复制临床心脏手术中 CPB 和 DHCA 脑细胞损伤相似特征，简单易行、且实验结果具有良好重复性。同时我们发现，这种灌流模型确实可以导致脑白质 preOL 损伤和数量减少，从而触发一系列 OL 细胞系细胞的改变，出现成熟 OL 细胞数量减少和轴突髓鞘化障碍，最终可导致白质损伤，为体外循环及停循环白质损伤提供了直接的细胞学损伤证据。
以往认为脑白质损伤是早产儿特有的神经损伤，近年随着新生儿先天性心脏病手术的开展，核磁共振研究发现，在足月新生儿体外循环手术后也发生脑白质损伤，而且发生率高达 25%～50% 以上[1-2]，严重影响患儿神经和心理发育，导致在手术近、远期出现包括精细和粗大运动缺陷等在内的严重神经发育障碍和心理行为问题[3]。
尽管在临床上观察到体外循环后白质损伤现象，但是在人体研究中，由于技术和伦理等因素的影响，至今还没有直接的人类体外循环下白质损伤的病理学和细胞学证据，因此人们只有通过借助动物体外循环模型来证实白质损伤的存在。先前研究者往往采用大动物或小动物进行模拟人类体外循环灌注的方式来研究脑损伤[4-6]，由于这类模型影响因素众多，实验条件控制难度也比较大，对脑组织损伤的评价很难做到精确定位和实时取材，近年来许多研究者采用脑组织切片进行体外灌流的模型来研究白质损伤[7-9]，为此我们拟建立新生大鼠离体脑切片体外灌注模型，通过控制灌流温度及采用氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）方法来模拟不同温度体外循环灌注以及停循环状态[10-11]，研究这一模型是否可以模拟体外循环和停循环的病理生理过程，并探讨在 OGD 状态下是否可以造成白质中少突胶质前体细胞（preoligodendrocytes，preOL）损伤，为体外循环白质损伤提供直接的细胞学证据。
1 材料及方法
1.1 实验动物、试剂及分组
1.1.1 实验动物 7 天龄 Sprague-Dawley（SD）大鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验操作严格遵守中国科学院上海药物研究所实验动物管理委员会规定。
1.1.2 实验试剂 少突胶质细胞标记物 O4（O4 为脑硫脂）抗体购自 Millipore 公司。髓鞘碱性蛋白 MBP 抗体购自 Abcam 公司。羊抗兔 IgG 荧光二抗购自 Invitrogen 公司。其他相关试剂均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.1.3 分组 将 40 只 SD 大鼠随机制作活体脑切片，每只大鼠约切出 3～5 片脑切片，后将脑切片随机分为 5 组，每组含脑切片 24 片，包括 36℃ 氧合人工脑脊液对照组及 60 min 不同温度下（36℃，32℃，25℃，15℃）的OGD组。
1.2 脑切片灌流模型建立
1.2.1 实验方法 将大鼠麻醉，无菌条件下迅速解剖动物的大脑，并立即置入冰冷的切片用人工脑脊液（SaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 葡萄糖，75 mmol/L 蔗糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）内。用 Mcllwain 组织切割器将大脑以冠状切面切成 400 μm 厚脑切片，并将其置于含有氧合 SaCSF 的培养皿，在 37℃，95% 湿度及 5% CO2 浓度下培养至少 1 h。最后将脑切片转移至含有灌流用人工脑脊液（PaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L葡萄糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）的定制灌流培养皿中，连接管道建立灌流系统，并将其放置于可调控温度的培养箱（上海博讯实业有限公司，中国）中，模拟体外循环灌流及其温度变化。
表1
人工脑脊液灌流液成分
1.2.2 氧糖剥夺 OGD被用于复制深低温停循环在心脏手术中的应用。通过改变灌流溶液，其中 PaCSF 中的葡萄糖被取代为 10 mmol/L 的蔗糖，并以 95% 氮气/5% 二氧化碳进行气体混合。当 OGD 结束后将灌流溶液更换回 PaCSF 溶液，并进行 24 h 持续灌流。
1.2.3 灌流系统和流程 在 36℃ 下建立平衡灌流系统后，用约 30 min 降温至目标温度，之后在目标温度水平更换 OGD 溶液，以此进行 60 min 氧糖剥夺过程。当 OGD 结束时，将灌流溶液更换为氧合 PaCSF，进行 10 min 再氧合，随后用约 30 min 复温至 36℃，并维持持续灌注约 24 h。对照组为在 36℃ 及相同周期下持续灌流氧合 PaCSF。灌流系统和流程见图 1、图 2。
图1
实验灌流系统示意图
图2
灌流程序示意图
1.3 免疫鉴定方法
灌流程序结束后，取出脑切片并加入 4% 多聚甲醛（PFA）于室温固定 1 h，磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH=7.4）清洗 3 遍；然后加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱过夜孵育；切底脱水后用组织冰冻切片包埋剂（OCT）在冰冻切片机包埋，将脑片切成 20 μm 切片并置于载玻片上；室温下用含 10% 葡萄糖及 5% 牛血清白蛋白的封闭液封闭 1 h。将稀释好的一抗孵育玻片上的脑切片，湿盒中 4℃ 冰箱过夜孵育。少突胶质细胞标记物 O4 抗体及髓鞘碱性蛋白 MBP 抗体的稀释浓度分别为：1：100 及 1：200。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1：200 比例稀释联有荧光的二抗，用与一抗相同的方法加 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育玻片，室温避光 1 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬灭封片剂 Dako Cytomation 封片，Olympus 倒置荧光显微镜观察。图形的定量处理用 Image-pro plus 5.1 软件完成。每一张脑切片在胼胝体部位随机选取 3 个视野采 400 倍照片，并计算每个视野的 O4 阳性染色数量与 DAPI 阳性染色数量的百分比值。荧光绿色提示为 O4 阳性表达，蓝色提示为 DAPI 阳性表达。
1.4 统计学分析
对免疫荧光染色的实验结果进行统计学分析，各组数据之间利用 GraphPad Prism 6 软件通过 one way ANOVA 及 Bonferroni post hoc test 进行差异性检验。计量资料以均数±标准差（ ）表示。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑切片灌流 OGD 后髓鞘碱性蛋白 MBP 荧光表达及形态
MBP 表达的变化可作为脑白质损伤程度的指标。为探讨本实验脑切片模型能否有效复制体外循环 DHCA 所引起的脑白质损伤，测试了在灌流程序后髓鞘 MBP 的表达程度。MBP 免疫荧光染色表明，MBP 阳性细胞的形态学和荧光表达改变在对照组及 15℃ OGD 组之间差异无统计学意义。然而，MBP 阳性细胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 组均出现不同程度的形态改变以及荧光表达减少，并与 OGD 温度呈显著正相关（图 3）。
图3
离体脑切片 OGD 灌流模型 MBP 免疫荧光鉴定 ×400，MBP 阳性免疫荧光染色呈白色； a. 对照组； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD；e. 36℃ OGD
2.2 脑切片灌流 OGD 后 O4 荧光表达
少突胶质细胞前体细胞（preOL，O4+）是在人类孕中后期及婴幼儿期脑白质损伤的主要目标细胞。脑切片以 O4 抗体标记来评价 OGD 对 preOL 细胞的损伤程度。O4 阳性细胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 组均出现不同程度的荧光表达减少，并与 OGD 温度呈显著正相关。O4 阳性细胞的形态学和荧光表达改变在对照组及 15℃ OGD 组之间差异无统计学意义（图 4）。
图4
离体脑切片 OGD 灌流模型 O4 免疫荧光鉴定 ×400，O4 阳性免疫荧光染色呈绿色，DAPI 阳性免疫荧光染色呈蓝色； a. 对照组； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD； e. 36℃ OGD； f. 统计图，各组 O4 阳性细胞与 DAPI 阳性细胞百分比，与对照组比较，*P<0.01
3 讨论
3.1 离体脑切片灌流模型的建立与意义
在小儿心脏外科体外循环脑损伤研究中，一般采用大动物如幼年猪、狗和羊或者小动物如幼年大鼠和豚鼠等在体外利用氧合器和滚轴泵建立类似手术中体外循环，来模拟体外循环和深低温停循环过程，进而研究和评价脑损伤及其程度以及各种防治方法有效性[4-6]。这一模型完全模拟病人手术中体外循环状态，较准确反映了体外循环下全身器官灌注和损伤，但是这种模型虽然反映了脑整体器官的病理生理状态，但是在评价脑组织细微结构以及组织和分子生物学方面，不能做到脑区域精确定位、不能及时有效地获得脑组织、而且在取材时脑组织容易受损从而影响脑损伤的评价，同时在动物模型干扰因素众多、费用较贵。
近年来，脑切片灌流方法广泛应用各种脑病理生理以及各种药物评价研究中[12-14]，其优点在于：（1）能够较为精确定位病变区域，在组织、细胞以及分子水平上观察脑损伤状况；（2）灌流系统能够很好控制实验条件，如脑组织灌流温度、PH 值、灌流液体化学成份、氧合情况以及灌流时间等，实验重复性好；（3）取材方便、简单易行且费用低廉。最近美国国立儿童医院也采用脑切片灌流模型用于研究脑白质损伤[7-9]，通过控制灌流温度和采用 OGD，较好地模拟类似手术中体外循环和 DHCA 脑损伤的特点。受到这些研究的启发，我们在中国科学院上海药物研究所的帮助下，建立了新生小鼠脑切片灌流系统，并采用 OGD 方法模拟 DHCA，研究结果发现，调整不同的灌注和 OGD 温度时，脑白质中形成轴突髓鞘的成熟少突胶质细胞（MBP 阳性）受损，而且随着温度上升，细胞形态变化和荧光表达明显减低，这种细胞损伤程度变化与体外循环和停循环病理生理完全灌注模型较好地复制了手术中体外循环及 DHCA 病理生理过程和效应。
相比一些体外细胞实验模型，脑切片灌流模型仍有相对较完整的组织细胞结构，更全面地反应脑细胞在损伤过程中的共同作用，状态更接近体内实验，可以达到体内动物模型同样的研究效应能力，在研究白质损伤中具有得天独厚的优势。但是这一模型在研究整体机体状态，如血流动力学、脑组织变化以及长期神经系统发育等方面较为欠缺[15-16]。
3.2 CPB/DHCA 对白质的损伤
本研究部分应用离体脑切片灌流模型，研究 CPB/DHCA 对脑白质 preOL 损伤。我们首先利用 MBP 免疫荧光初步检测脑白质在 OGD 灌流后的损伤程度，结果显示 MBP 阳性细胞在不同温度 OGD 设置呈现不同程度的损伤，在 25℃、32℃ 及 36℃ 出现显著的细胞损失及形态改变，包括突触消失及细胞膜变薄碎化等。结果提示脑白质细胞会受 OGD 影响出现急性损伤，更为重要的是我们发现利用 O4 免疫荧光染色观察脑切片模型在实施不同温度的 OGD 灌流后（O4+）损伤状态，可见在 36℃ OGD 下 preOL 有显著损失，在 15℃ OGD 损失程度则显著减少，可见 preOL 损伤与各温度 OGD 组中呈现正性相关。从以上数据表明 CPB/DHCA 能引起 preOL 损伤。
preOL 是少突胶质细胞（OL）细胞系发育的重要阶段，在人胚胎后 3 个月是脑白质中 OL 细胞中的主要细胞，约占 90%，到出生时达到 50%[17]。在 OL 细胞系中，PreOL 对缺血缺氧损伤最敏感，也是感染和炎症损伤的靶细胞[6,18]。preOL 损伤可有以下 3 种结局[19]：（1）preOL 急性死亡；（2）preOL 存活但正常细胞进程丧失，随后的细胞分化和髓鞘化失败；（3）preOL 异常。无论何种损伤，由于 preOL 数量急剧减少，其随后的细胞分化为成熟 OL 也明显减少，结果是髓磷脂合成减少和轴突髓鞘化障碍，最终导致脑白质低髓鞘化和白质损伤[18-20]。因此 PreOL 损伤是最终导致白质损伤的细胞学基础。在本研究中我们发现体外循环和停循环模型中的确存在 preOL 损伤和数量减少以及成熟 OL 明显减少，从而进一步导致整个白质低髓鞘化和损伤。
本研究建立了新生小鼠脑切片体外灌流和 OGD 模型，证实这种模型可有效模拟和复制临床心脏手术中 CPB 和 DHCA 脑细胞损伤相似特征，简单易行、且实验结果具有良好重复性。同时我们发现，这种灌流模型确实可以导致脑白质 preOL 损伤和数量减少，从而触发一系列 OL 细胞系细胞的改变，出现成熟 OL 细胞数量减少和轴突髓鞘化障碍，最终可导致白质损伤，为体外循环及停循环白质损伤提供了直接的细胞学损伤证据。
