引用本文： 李斌, 朱多杰, 何雯婷, 刘涛, 王成, 宋铁牛, 杨建宝, 郭权威, 蒋鹏, 魏小平, 孟于琪. 靶向沉默 DDX46 基因对食管鳞癌 TE-1 细胞增殖及凋亡的影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(6): 463-468. doi: 10.7507/1007-4848.201608084 复制
食管癌居全球恶性肿瘤死亡率第 6 位[1]。中国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，全球近 70% 的食管癌发生在中国，死亡率居我国所有恶性肿瘤第 4 位，严重威胁国人健康[2]。我国食管癌的病理学类型 90% 以上为食管鳞癌，目前远期疗效很不理想，基因事件在食管鳞癌发生发展中的机制仍不清楚[3]。近年来 RNA 在生命系统中的重要作用备受关注，而 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶参与了 RNA 代谢的全过程[4]。DDX 解旋酶可通过改变癌基因表达水平、基因突变，或者参与肿瘤启动和进展相关信号通路、调控肿瘤耐药基因的表达，参与肿瘤的发生发展[5]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员[5]，我们前期研究报道了 DDX46 蛋白表达主要定位于细胞核，食管鳞癌组织中 DDX46 蛋白和 mRNA 的表达均明显高于相对应食管正常组织[6]。本实验通过 shRNA 干扰技术，探讨靶向沉默 DDX46 基因对食管鳞癌 TE-1 细胞增殖及凋亡的影响，并阐述可能的作用机制，以期为揭示食管鳞癌新型生物学标记、探索新的个体化治疗策略提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 细胞系来源
本实验所用人食管鳞癌细胞 TE-1 购于上海生命科学研究院细胞资源中心，人永生化食管鳞状上皮细胞 Het-1A 购于上海拜力生物科技有限公司。
1.2 主要试剂和仪器
本实验使用的主要试剂包括 RNAlater（Qiagen）、Trizol 试剂（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆转录酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（广州锐博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（广州锐博）、Rnase Inhibitor（Promega）、RPMI-1640 细胞培养基（Lonza）、BulletKit 内皮细胞培养基（Lonza）、Anti-DDX46（Sigma-Aldrich）、D-Hanks 液（Sigma-Aldrich）、Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen）、Giemsa（上海鼎国）、Annexin V-APC single-staining 凋亡试剂盒（eBioscience）、PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit（CST）。
本实验所用主要仪器与设备包括二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）、隔水式恒温培养箱（上海一恒）、Nanodrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）、PCR 仪（Applied Biosystems）、Cellomics 高内涵筛选成像系统（Thermo Fisher Scientific）、荧光显微镜（Olympus）、倒置相差显微镜（Olympus）、流式细胞仪（Millipore）、高速冷冻台式离心机（Thermo Fisher Scientific）、超速离心机（Thermo Fisher Scientific）、精密天平（浙江力辰）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及传代 目的细胞 TE-1 培养于 RPMI-1640 培养液中，Het-1A 培养于 BulletKit 内皮细胞培养基中，均置于 37℃、5% CO 2 培养箱内。每 3 d 换液 1 次。支原体检测均为阴性。至细胞 80% 融合且状态良好时，弃旧培养液，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔清洗1遍，再加入适量 0.25% 胰蛋白酶消化约 2～5 min，置于显微镜下观察，细胞回缩变圆后弃去胰酶消化液，并立即加入细胞培养液终止消化。吸管吸取培养瓶内培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使贴壁细胞脱落制成单细胞悬液。将上述单细胞悬液移至 10 ml 离心管，1 000 rpm 离心 5 min，弃上清液，加入 2 ml 培养液重悬混匀细胞后，将细胞重新接种于新的培养瓶中（细胞数≥1×104 个），置于 37℃、5% CO 2 培养箱内继续培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.3.2 目的细胞 DDX46 基因 qRT-PCR 检测 收集目的细胞，用 2 000 rpm 离心 5 min 后，弃上清液，沉淀的细胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混匀后静置于室温下 5 min，然后转移至 1.5 ml EP 管中，完成细胞样本 Trizol 裂解。依据 Invitrogen 公司 Trizol 操作说明书完成总 RNA 抽提。依据 Promega 公司 M-MLV 操作说明书逆转录 RNA 获得 cDNA。以 GAPDH 基因为内参，两步法进行 qRT-PCR，2–∆∆Ct法计算 DDX46 基因 mRNA 的相对表达量（∆Ct=目的基因 Ct 值–内参基因 Ct 值；∆∆Ct=样品 ∆Ct 值–对照组 ∆Ct 平均值）。实验重复 3 次。
1.3.3 DDX46 基因 RNAi 慢病毒制备和包装 DDX46基因 RNAi 靶点序列和 RNAi 慢病毒（DDX46-shRNA-LV）制备和包装由上海吉凯基因化学技术有限公司设计完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5′-AGAAATCACCAGGCTCATA-3′，阴性对照序列应用公认序列：5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′[7]。
1.3.4 慢病毒感染 TE-1 细胞 胰蛋白酶消化对数生长期的 TE-1 细胞，然后 RPMI-1640 完全培养基重悬制成 3×104～5×104 个细胞/ml 的悬液，均匀接种至 6 孔板中继续培养；铺板量达到 30% 左右时，更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染（感染复数为 5），实验组（DDX46 基因 RNAi 靶点序列慢病毒感染，DDX46-shRNA-LV 组）病毒滴度 2×108 TU/ml、病毒感染用量 5 μl，对照组（阴性对照序列慢病毒感染，Control-LV 组）病毒滴度 4×108 TU/ml、病毒感染用量 2.5 μl；感染后 12 h，更换为常规培养基继续培养；观察细胞状态良好，未出现大量死亡现象，实验组与对照组细胞状态相当；感染后 72 h，荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率。
1.3.5 qRT-PCR 检测 DDX46 基因的敲减效率 实验方法同 1.3.2。
1.3.6 细胞计数检测 将处于对数生长期的各组细胞胰蛋白酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液并计数；以每孔 2 000 细胞接种于 96 孔板，每组 3 复孔，培养体系为每孔 100 μl，铺板过程中每孔加入细胞数一致，37℃、5%CO 2 培养箱培养；铺板后第 2 d 开始，每天 Cellomics 高内涵筛选成像系统（HCS）检测读板 1 次，连续 5 d；计算出每次 HCS 检测扫描孔板中带绿色荧光的细胞数量，绘出 5 d 的细胞增殖曲线图：根据细胞计数值和时间点，绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线；计算各组细胞各时间点细胞计数值与该组第 1 d 的细胞计数值的比值，获得该组细胞各时间点的增殖倍数，根据该增殖倍数和时间点，绘制基于细胞增殖倍数的细胞生长曲线。
1.3.7 克隆形成实验 将处于对数生长期的各组细胞胰蛋白酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液并计数；以每孔 600 细胞接种于 6 孔板培养板中，每组设 3 复孔，培养体系为每孔 2 ml；将接种好的细胞 37℃、5%CO 2 培养箱中持续培养 15 d，中途每 5 d 进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS 液洗涤细胞 1 次；每孔加入 4% 多聚甲醛 1 ml，固定细胞 30～60 min，PBS 液洗涤细胞 1 次；每孔加入 Giemsa 染液 500 μl，染色细胞 10～20 min；ddH 2O 洗涤细胞数次，晾干后拍照，克隆计数（含有 50 个以上细胞的克隆计为 1 个细胞克隆）。
1.3.8 细胞凋亡实验 待各组 6 孔板细胞生长至覆盖率约为 80% 时胰酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液，与孔板上清细胞收集于同一 5 ml 离心管中（细胞数≥5×105 个），每组设 3 个孔；1 300 rmp 离心 5 min，弃上清液，4℃ 预冷的 D-Hanks 液（pH 值 7.2～7.4）洗涤细胞沉淀 1 次；Binding Buffer 洗涤细胞沉淀 1 次，1 300 rmp 离心 3 min 收集细胞；200 μl Binding Buffer 重悬细胞沉淀；加入 10 μl Annexin V-APC 染色，室温避光 10～15 min，上流式细胞仪检测。
1.3.9 PathScan® Antibody Array 检测 目的细胞 Trizol 裂解方法同 1.3.2。依据 CST 公司 Signaling Antibody Array Kit 操作说明书完成抗体芯片检测。
1.4 统计学分析
应用 SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示。计量资料比较采用 t 检验，等级资料比较采用秩和检验，率的比较采用 χ2 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 目的细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达
与人正常食管上皮细胞 Het-1A 相比，DDX46 基因 mRNA 的表达在人食管鳞癌 TE-1 细胞中显著上调（P<0.001）；见图 1 。
图1
TE-1 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达较 Het-1A 显 著上调（***P<0.001）
2.2 shRNA 慢病毒介导的 RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表达
慢病毒目的细胞感染率达到 80% 以上。qRT-PCR 结果显示，经 DDX46-shRNA-LV 慢病毒感染后，TE-1 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达明显受到抑制（P<0.01），敲减效率达到 86.6%；见图 2。
图2
慢病毒目的细胞感染率达到 80% 以上，RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表达（**P<0.01）
2.3 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞生长
慢病毒感染目的细胞 3 d 后，HCS 仪连续检测 5 d，记录各时间点的细胞数目，绘制出细胞生长曲线图，结果如图 3 所示，与对照组相比，实验组 TE-1 细胞生长被显著抑制。
图3
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞生长 a. HCS 连续读取荧光信号； b. 增殖倍数细胞生长曲线； c. 计数值细胞生长曲线，**与对照组比较P<0.01，***与对照组比较P<0.001
2.4 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞克隆形成
相对于对照组，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 细胞克隆形成数显著减少（P<0.001），细胞克隆形成能力被抑制；见图4。
图4
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞克隆形成，***P<0.001
2.5 靶向沉默 DDX46 基因诱导 TE-1 细胞凋亡
相对于对照组，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 细胞凋亡率显著升高（P<0.001）；见图 5。
图5
靶向沉默 DDX46 基因诱导 TE-1 细胞凋亡，***P<0.001
2.6 PathScan® Antibody Array 检测结果
靶向沉默 DDX46 基因后，检测 Stress and Apoptosis 细胞信号通路中关键信号分子的变化，4 号目标点 Akt（Ser473，Phosphorylation）和 14 号目标点 IκBα（total，N/A）表达水平显著下调（P<0.01），12 号目标点 Caspase-3（Asp175，cleaved）蛋白表达水平上调（P<0.05），提示靶向沉默 DDX46 基因可能通过下调 Akt/NF-κB 信号通路，进而抑制 TE-1 细胞增殖并诱导细胞凋亡；见图 6。
图6
Antibody Array 检测结果
3 讨论
食管鳞癌是我国恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一，虽有手术、化疗、放疗以及其他辅助疗法，但其远期疗效令人沮丧，并且部分病人首诊时已是局部晚期或转移性疾病，失去了根治性手术的机会，导致平均 5 年生存率仅为 10%[3]，远远不能令人满意。食管鳞癌缺乏特异性的早期肿瘤标记物，靶向治疗的相关研究尚处于萌芽阶段，目前许多靶向药物的相关研究多针对胃-食管交界部腺癌开展，这些研究结果对于食管鳞癌是否适合尚未证实，对食管鳞癌基因事件的认识还远未达到精准医疗所需要的程度。
蛋白质是生命活动的物质基础，但 DNA 不能直接制造蛋白质。RNA 将 DNA 与蛋白质联络起来，完成生物体的各种生理活动。涉及 RNA 的细胞生物进程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用 ATP 水解产生的能量实现 RNA 解旋或核糖核蛋白结构重组[8]，几乎参与了 RNA 代谢的所有环节，包括基因的转录、RNA 的剪接、转运、贮存、降解、核糖体合成、翻译及细胞器基因表达等[9-11]。DDX 蛋白家族是一类重要的 RNA 解旋酶，几乎存在于所有真核生物中[4]，因其基序Ⅱ中含有一段保守的氨基酸片段：天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Ala-Asp，D-E-A-D），故将其命名为 DEAD-box 蛋白家族，即 DDX 蛋白家族[12]。虽然一些 DDX 基因在人类肿瘤中的表达失调已被报道，但仍有许多 DDX 解旋酶家族成员在人类肿瘤中的表达情况，以及与人类肿瘤的关系未被阐述[5, 13]。
DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员[5]，研究表明 DDX46 在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[14-16]。人类 DDX46 基因位于染色体 5q31.1，有 26 个外显子，编码的 DDX46 蛋白分子量为 131 kDa[17]，在肿瘤中的表达及与肿瘤的相关性罕见报道[18]。我们先前首次报道了 DDX46 在食管鳞癌中的表达情况[6]。基因表达水平可以揭示某一信号通路是否参与肿瘤细胞的增殖和分化，本研究应用 qRT-PCR 检测 DDX46 基因 mRNA 在人食管鳞癌细胞 TE-1 及人正常食管上皮细胞 Het-1A 中的表达，发现与 Het-1A 相比，TE-1 中 DDX46 基因 mRNA 的表达均显著上调。随后应用 DDX46-shRNA-LV 靶向沉默 DDX46 基因，检测 DDX46 基因沉默后 TE-1 细胞生物功能学变化，结果显示靶向沉默 DDX46 基因可显著抑制 TE-1 细胞增殖，并诱导细胞凋亡，说明 DDX46 基因与食管鳞癌细胞的增殖和凋亡密切相关。
为阐明其可能的作用机制，本实验应用 PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit 检测比较 DDX46 基因敲减前后 TE-1 细胞信号通路关键信号分子的变化，结果表明 Akt 和 IκBα 表达水平明显下调，Caspase-3 表达水平上调，Akt/NF-κB 信号通路被抑制。Akt（蛋白激酶 B）是一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以磷酸化百余种不同底物，是调节细胞增殖、凋亡和自噬等上游信号通路的汇合点，在肿瘤的发生中起到了关键作用[19]。NF-κB 是真核细胞的快反应核转录因子，几乎存在于所有的细胞中，是 Akt 信号通路下游的重要效应分子。食管鳞癌细胞中存在有活化的 NF-κB 信号通路[20]。NF-κB 与抑制性蛋白 IκBα 结合形成无活性的复合物驻于胞浆内，若抑制性蛋白 IκBα 磷酸化而被降解，则 NF-κB 从无活性的复合物脱落释放而得以激活，并从细胞质中转位进入细胞核，激活其下游靶基因，发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用[20-22]。Caspase-3 是参与细胞凋亡的关键执行分子，在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，正常以无活性的酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[23]。因此我们推测靶向沉默 DDX46 基因可能通过抑制 Akt 磷酸化，进而抑制 IκBα 磷酸化，使 NF-κB 不能从无活性的复合物脱落释放，进而发挥抑制 TE-1 细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。
综上所述，DDX46 在食管鳞癌 TE-1 细胞中高表达，靶向沉默 DDX46 基因可抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡；靶向沉默 DDX46 基因可能是通过下调 Akt/NF-κB 信号通路，进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。DDX46 与食管鳞癌的相关性还需要其他食管鳞癌细胞株功能实验和体内裸鼠成瘤实验进一步验证。
食管癌居全球恶性肿瘤死亡率第 6 位[1]。中国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，全球近 70% 的食管癌发生在中国，死亡率居我国所有恶性肿瘤第 4 位，严重威胁国人健康[2]。我国食管癌的病理学类型 90% 以上为食管鳞癌，目前远期疗效很不理想，基因事件在食管鳞癌发生发展中的机制仍不清楚[3]。近年来 RNA 在生命系统中的重要作用备受关注，而 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶参与了 RNA 代谢的全过程[4]。DDX 解旋酶可通过改变癌基因表达水平、基因突变，或者参与肿瘤启动和进展相关信号通路、调控肿瘤耐药基因的表达，参与肿瘤的发生发展[5]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员[5]，我们前期研究报道了 DDX46 蛋白表达主要定位于细胞核，食管鳞癌组织中 DDX46 蛋白和 mRNA 的表达均明显高于相对应食管正常组织[6]。本实验通过 shRNA 干扰技术，探讨靶向沉默 DDX46 基因对食管鳞癌 TE-1 细胞增殖及凋亡的影响，并阐述可能的作用机制，以期为揭示食管鳞癌新型生物学标记、探索新的个体化治疗策略提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 细胞系来源
本实验所用人食管鳞癌细胞 TE-1 购于上海生命科学研究院细胞资源中心，人永生化食管鳞状上皮细胞 Het-1A 购于上海拜力生物科技有限公司。
1.2 主要试剂和仪器
本实验使用的主要试剂包括 RNAlater（Qiagen）、Trizol 试剂（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆转录酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（广州锐博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（广州锐博）、Rnase Inhibitor（Promega）、RPMI-1640 细胞培养基（Lonza）、BulletKit 内皮细胞培养基（Lonza）、Anti-DDX46（Sigma-Aldrich）、D-Hanks 液（Sigma-Aldrich）、Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen）、Giemsa（上海鼎国）、Annexin V-APC single-staining 凋亡试剂盒（eBioscience）、PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit（CST）。
本实验所用主要仪器与设备包括二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）、隔水式恒温培养箱（上海一恒）、Nanodrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）、PCR 仪（Applied Biosystems）、Cellomics 高内涵筛选成像系统（Thermo Fisher Scientific）、荧光显微镜（Olympus）、倒置相差显微镜（Olympus）、流式细胞仪（Millipore）、高速冷冻台式离心机（Thermo Fisher Scientific）、超速离心机（Thermo Fisher Scientific）、精密天平（浙江力辰）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及传代 目的细胞 TE-1 培养于 RPMI-1640 培养液中，Het-1A 培养于 BulletKit 内皮细胞培养基中，均置于 37℃、5% CO 2 培养箱内。每 3 d 换液 1 次。支原体检测均为阴性。至细胞 80% 融合且状态良好时，弃旧培养液，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔清洗1遍，再加入适量 0.25% 胰蛋白酶消化约 2～5 min，置于显微镜下观察，细胞回缩变圆后弃去胰酶消化液，并立即加入细胞培养液终止消化。吸管吸取培养瓶内培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使贴壁细胞脱落制成单细胞悬液。将上述单细胞悬液移至 10 ml 离心管，1 000 rpm 离心 5 min，弃上清液，加入 2 ml 培养液重悬混匀细胞后，将细胞重新接种于新的培养瓶中（细胞数≥1×104 个），置于 37℃、5% CO 2 培养箱内继续培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.3.2 目的细胞 DDX46 基因 qRT-PCR 检测 收集目的细胞，用 2 000 rpm 离心 5 min 后，弃上清液，沉淀的细胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混匀后静置于室温下 5 min，然后转移至 1.5 ml EP 管中，完成细胞样本 Trizol 裂解。依据 Invitrogen 公司 Trizol 操作说明书完成总 RNA 抽提。依据 Promega 公司 M-MLV 操作说明书逆转录 RNA 获得 cDNA。以 GAPDH 基因为内参，两步法进行 qRT-PCR，2–∆∆Ct法计算 DDX46 基因 mRNA 的相对表达量（∆Ct=目的基因 Ct 值–内参基因 Ct 值；∆∆Ct=样品 ∆Ct 值–对照组 ∆Ct 平均值）。实验重复 3 次。
1.3.3 DDX46 基因 RNAi 慢病毒制备和包装 DDX46基因 RNAi 靶点序列和 RNAi 慢病毒（DDX46-shRNA-LV）制备和包装由上海吉凯基因化学技术有限公司设计完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5′-AGAAATCACCAGGCTCATA-3′，阴性对照序列应用公认序列：5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′[7]。
1.3.4 慢病毒感染 TE-1 细胞 胰蛋白酶消化对数生长期的 TE-1 细胞，然后 RPMI-1640 完全培养基重悬制成 3×104～5×104 个细胞/ml 的悬液，均匀接种至 6 孔板中继续培养；铺板量达到 30% 左右时，更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染（感染复数为 5），实验组（DDX46 基因 RNAi 靶点序列慢病毒感染，DDX46-shRNA-LV 组）病毒滴度 2×108 TU/ml、病毒感染用量 5 μl，对照组（阴性对照序列慢病毒感染，Control-LV 组）病毒滴度 4×108 TU/ml、病毒感染用量 2.5 μl；感染后 12 h，更换为常规培养基继续培养；观察细胞状态良好，未出现大量死亡现象，实验组与对照组细胞状态相当；感染后 72 h，荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率。
1.3.5 qRT-PCR 检测 DDX46 基因的敲减效率 实验方法同 1.3.2。
1.3.6 细胞计数检测 将处于对数生长期的各组细胞胰蛋白酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液并计数；以每孔 2 000 细胞接种于 96 孔板，每组 3 复孔，培养体系为每孔 100 μl，铺板过程中每孔加入细胞数一致，37℃、5%CO 2 培养箱培养；铺板后第 2 d 开始，每天 Cellomics 高内涵筛选成像系统（HCS）检测读板 1 次，连续 5 d；计算出每次 HCS 检测扫描孔板中带绿色荧光的细胞数量，绘出 5 d 的细胞增殖曲线图：根据细胞计数值和时间点，绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线；计算各组细胞各时间点细胞计数值与该组第 1 d 的细胞计数值的比值，获得该组细胞各时间点的增殖倍数，根据该增殖倍数和时间点，绘制基于细胞增殖倍数的细胞生长曲线。
1.3.7 克隆形成实验 将处于对数生长期的各组细胞胰蛋白酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液并计数；以每孔 600 细胞接种于 6 孔板培养板中，每组设 3 复孔，培养体系为每孔 2 ml；将接种好的细胞 37℃、5%CO 2 培养箱中持续培养 15 d，中途每 5 d 进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS 液洗涤细胞 1 次；每孔加入 4% 多聚甲醛 1 ml，固定细胞 30～60 min，PBS 液洗涤细胞 1 次；每孔加入 Giemsa 染液 500 μl，染色细胞 10～20 min；ddH 2O 洗涤细胞数次，晾干后拍照，克隆计数（含有 50 个以上细胞的克隆计为 1 个细胞克隆）。
1.3.8 细胞凋亡实验 待各组 6 孔板细胞生长至覆盖率约为 80% 时胰酶消化，完全培养基重悬细胞成悬液，与孔板上清细胞收集于同一 5 ml 离心管中（细胞数≥5×105 个），每组设 3 个孔；1 300 rmp 离心 5 min，弃上清液，4℃ 预冷的 D-Hanks 液（pH 值 7.2～7.4）洗涤细胞沉淀 1 次；Binding Buffer 洗涤细胞沉淀 1 次，1 300 rmp 离心 3 min 收集细胞；200 μl Binding Buffer 重悬细胞沉淀；加入 10 μl Annexin V-APC 染色，室温避光 10～15 min，上流式细胞仪检测。
1.3.9 PathScan® Antibody Array 检测 目的细胞 Trizol 裂解方法同 1.3.2。依据 CST 公司 Signaling Antibody Array Kit 操作说明书完成抗体芯片检测。
1.4 统计学分析
应用 SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示。计量资料比较采用 t 检验，等级资料比较采用秩和检验，率的比较采用 χ2 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 目的细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达
与人正常食管上皮细胞 Het-1A 相比，DDX46 基因 mRNA 的表达在人食管鳞癌 TE-1 细胞中显著上调（P<0.001）；见图 1 。
图1
TE-1 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达较 Het-1A 显 著上调（***P<0.001）
2.2 shRNA 慢病毒介导的 RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表达
慢病毒目的细胞感染率达到 80% 以上。qRT-PCR 结果显示，经 DDX46-shRNA-LV 慢病毒感染后，TE-1 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达明显受到抑制（P<0.01），敲减效率达到 86.6%；见图 2。
图2
慢病毒目的细胞感染率达到 80% 以上，RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表达（**P<0.01）
2.3 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞生长
慢病毒感染目的细胞 3 d 后，HCS 仪连续检测 5 d，记录各时间点的细胞数目，绘制出细胞生长曲线图，结果如图 3 所示，与对照组相比，实验组 TE-1 细胞生长被显著抑制。
图3
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞生长 a. HCS 连续读取荧光信号； b. 增殖倍数细胞生长曲线； c. 计数值细胞生长曲线，**与对照组比较P<0.01，***与对照组比较P<0.001
2.4 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞克隆形成
相对于对照组，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 细胞克隆形成数显著减少（P<0.001），细胞克隆形成能力被抑制；见图4。
图4
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 细胞克隆形成，***P<0.001
2.5 靶向沉默 DDX46 基因诱导 TE-1 细胞凋亡
相对于对照组，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 细胞凋亡率显著升高（P<0.001）；见图 5。
图5
靶向沉默 DDX46 基因诱导 TE-1 细胞凋亡，***P<0.001
2.6 PathScan® Antibody Array 检测结果
靶向沉默 DDX46 基因后，检测 Stress and Apoptosis 细胞信号通路中关键信号分子的变化，4 号目标点 Akt（Ser473，Phosphorylation）和 14 号目标点 IκBα（total，N/A）表达水平显著下调（P<0.01），12 号目标点 Caspase-3（Asp175，cleaved）蛋白表达水平上调（P<0.05），提示靶向沉默 DDX46 基因可能通过下调 Akt/NF-κB 信号通路，进而抑制 TE-1 细胞增殖并诱导细胞凋亡；见图 6。
图6
Antibody Array 检测结果
3 讨论
食管鳞癌是我国恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一，虽有手术、化疗、放疗以及其他辅助疗法，但其远期疗效令人沮丧，并且部分病人首诊时已是局部晚期或转移性疾病，失去了根治性手术的机会，导致平均 5 年生存率仅为 10%[3]，远远不能令人满意。食管鳞癌缺乏特异性的早期肿瘤标记物，靶向治疗的相关研究尚处于萌芽阶段，目前许多靶向药物的相关研究多针对胃-食管交界部腺癌开展，这些研究结果对于食管鳞癌是否适合尚未证实，对食管鳞癌基因事件的认识还远未达到精准医疗所需要的程度。
蛋白质是生命活动的物质基础，但 DNA 不能直接制造蛋白质。RNA 将 DNA 与蛋白质联络起来，完成生物体的各种生理活动。涉及 RNA 的细胞生物进程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用 ATP 水解产生的能量实现 RNA 解旋或核糖核蛋白结构重组[8]，几乎参与了 RNA 代谢的所有环节，包括基因的转录、RNA 的剪接、转运、贮存、降解、核糖体合成、翻译及细胞器基因表达等[9-11]。DDX 蛋白家族是一类重要的 RNA 解旋酶，几乎存在于所有真核生物中[4]，因其基序Ⅱ中含有一段保守的氨基酸片段：天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Ala-Asp，D-E-A-D），故将其命名为 DEAD-box 蛋白家族，即 DDX 蛋白家族[12]。虽然一些 DDX 基因在人类肿瘤中的表达失调已被报道，但仍有许多 DDX 解旋酶家族成员在人类肿瘤中的表达情况，以及与人类肿瘤的关系未被阐述[5, 13]。
DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员[5]，研究表明 DDX46 在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[14-16]。人类 DDX46 基因位于染色体 5q31.1，有 26 个外显子，编码的 DDX46 蛋白分子量为 131 kDa[17]，在肿瘤中的表达及与肿瘤的相关性罕见报道[18]。我们先前首次报道了 DDX46 在食管鳞癌中的表达情况[6]。基因表达水平可以揭示某一信号通路是否参与肿瘤细胞的增殖和分化，本研究应用 qRT-PCR 检测 DDX46 基因 mRNA 在人食管鳞癌细胞 TE-1 及人正常食管上皮细胞 Het-1A 中的表达，发现与 Het-1A 相比，TE-1 中 DDX46 基因 mRNA 的表达均显著上调。随后应用 DDX46-shRNA-LV 靶向沉默 DDX46 基因，检测 DDX46 基因沉默后 TE-1 细胞生物功能学变化，结果显示靶向沉默 DDX46 基因可显著抑制 TE-1 细胞增殖，并诱导细胞凋亡，说明 DDX46 基因与食管鳞癌细胞的增殖和凋亡密切相关。
为阐明其可能的作用机制，本实验应用 PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit 检测比较 DDX46 基因敲减前后 TE-1 细胞信号通路关键信号分子的变化，结果表明 Akt 和 IκBα 表达水平明显下调，Caspase-3 表达水平上调，Akt/NF-κB 信号通路被抑制。Akt（蛋白激酶 B）是一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以磷酸化百余种不同底物，是调节细胞增殖、凋亡和自噬等上游信号通路的汇合点，在肿瘤的发生中起到了关键作用[19]。NF-κB 是真核细胞的快反应核转录因子，几乎存在于所有的细胞中，是 Akt 信号通路下游的重要效应分子。食管鳞癌细胞中存在有活化的 NF-κB 信号通路[20]。NF-κB 与抑制性蛋白 IκBα 结合形成无活性的复合物驻于胞浆内，若抑制性蛋白 IκBα 磷酸化而被降解，则 NF-κB 从无活性的复合物脱落释放而得以激活，并从细胞质中转位进入细胞核，激活其下游靶基因，发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用[20-22]。Caspase-3 是参与细胞凋亡的关键执行分子，在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，正常以无活性的酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[23]。因此我们推测靶向沉默 DDX46 基因可能通过抑制 Akt 磷酸化，进而抑制 IκBα 磷酸化，使 NF-κB 不能从无活性的复合物脱落释放，进而发挥抑制 TE-1 细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。
综上所述，DDX46 在食管鳞癌 TE-1 细胞中高表达，靶向沉默 DDX46 基因可抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡；靶向沉默 DDX46 基因可能是通过下调 Akt/NF-κB 信号通路，进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。DDX46 与食管鳞癌的相关性还需要其他食管鳞癌细胞株功能实验和体内裸鼠成瘤实验进一步验证。
