引用本文： 生伟, 王海桃, 池一凡, 孙龙, 牛兆倬, 林明山, 乔友进, 吴建涛. 血红素加氧酶-1 对大鼠体外循环后肺组织抗细胞凋亡的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(5): 384-389. doi: 10.7507/1007-4848.201610033 复制
血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）作为一种内源性的保护基因[1]，在肺脏疾病的发生发展过程中，起到了重要的作用[2-3]。本实验旨在研究 HO-1 在体外循环后（CPB）肺组织细胞凋亡中发挥的保护作用，并具体研究其发挥保护作用可能的机制。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料 本实验以 144 只雄性 Wistar 大鼠（体重 250～350 g）为研究对象，大鼠由青岛市药品检验所动物实验中心提供。主要试剂HO-1多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体、SP免疫组化染色试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司。钴原卟啉 (CoPP)、锌原卟啉 (ZnPP)购自Sigma公司。TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.2 分组 将大鼠按照随机原则分为 3 组，每组 48 只。A 组（对照组）：模型建立前 24 h 腹腔注射生理盐水；B 组 [钴原卟啉（CoPP）组]: 模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg）；C 组 [CoPP+锌原卟啉（ZnPP）组]：模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg），同时注射 ZnPP（5 mg/kg）。
1.2 实验方法
1.2.1 改良大鼠体外循环肺损伤模型的建立 采用复合诱导麻醉，通过右侧颈内动脉和颈静脉通路建立体外循环[4]。贮血器置于大鼠心脏平面以下 40 cm 左右，静脉血经过变温器变温，膜肺氧合后通过蠕动泵灌注进入右侧颈内动脉。CPB 开始前经股静脉置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血时间（ACT）在 480 s 以上后才能开始转流。胸骨正中切口，切开心包，分离主肺动脉，平均动脉压在 CPB 过程中维持在 55～60 mm Hg。转流渐趋平稳后，CPB 开始后 10 min，阻断肺动脉，停止机械通气，并行循环 50 min 后开放肺动脉，将颈静脉插管退回至右心房内，恢复机械通气，逐渐复温，30 min 内肛温达到 36.0℃ 左右停止体外循环。改良大鼠体外循环肺损伤模型模拟图见图 1。
图1
改良大鼠体外循环肺损伤模拟图
1.2.2 标本采集 建立改良大鼠 CPB 肺损伤模型后，采用断颈法分别于 CPB 前（T0）、CPB 结束即刻（T1）、CPB 后 2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期将动物处死，每次 8 只。取肺组织作相应指标检测。打开胸腔，取右肺组织，4% 的多聚甲醛固定部分肺组织，石蜡包埋，以备苏木精-伊红（HE）染色及各指标的免疫组织化学法测定。余肺组织置于液氮中冻存备用。
1.2.3 免疫组化法检测肺组织 HO-1 和 Bcl-2 蛋白表达的位置及强度 采用免疫组化链霉素亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）法检测。阳性表达为棕黄色颗粒。应用 Image-Pro Plus 6.0 病理图文分析系统分析图像，随机选择 5 个不同视野，测定阳性产物表达的平均光密度值（OD 值），HO-1 和 Bcl-2 蛋白阳性表达的强度用 5 个不同视野的 OD 值的均值来表示。
1.2.4 肺组织 HO-1 活力测定 根据 HO-1 降解血红素生成一氧化碳和胆红素的原理，计算肺组织中生成胆红素的量评估肺组织 HO-1 的活性。选择 464 nm 和 530 nm 双波长分光光度法来测定肺组织匀浆中胆红素生成量。胆红素摩尔吸光系数为 40 nm/cm，其结果用 pmol/（mg·h） 表示。
1.2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡 TUNEL 标记的阳性细胞即为凋亡细胞，其细胞核呈棕黄色染色。肺组织细胞凋亡指数（AI）[5]：每张切片镜检，测定 5 个不同高倍视野下的凋亡细胞数，凋亡指数=TUNEL 阳性细胞数之和/细胞数总数之和×100%。
1.2.6 大鼠肺组织病理学观察 通过 HE 染色，光镜下观察每组大鼠肺组织在不同时期的结构改变。
1.3 统计学分析
采用统计软件 SPSS 16.0 进行数据分析。经方差分析进行正态性检验，计量资料为正态分布，采用均数±标准差（ ）表示。各组组间、组内数据的比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织 HO-1 的表达
肺组织中 HO-1 蛋白表达主要在细胞膜或细胞浆中，阳性细胞表现为棕黄色染色。采用免疫组化方法显示肺组织细胞中 HO-1 蛋白阳性表达主要分布在细支气管上皮细胞以及肺泡上皮细胞，在肺组织血管内皮也有少量表达。统计数据显示 B 组肺组织 HO-1 蛋白表达在 CPB 前后各期均显著强于 A 组和 C 组（P<0.05）。各组大鼠肺组织在经过 CPB 后 HO-1 蛋白表达增加，在 T2 点表达最多。免疫组化检测的 HO-1 表达见表 1 及图 2。
表1
各组大鼠不同时间点肺组织 HO-1 的表达比较（
）
图2
各组大鼠肺组织 T2 期 HO-1 蛋白的表达 （SABC×200）A 组（2a）和C组（2c）肺组织中少数细胞胞浆可见棕黄色染色，B 组（2b）肺组织中许多细胞胞浆可见明显棕黄色染色；图 3 各组大鼠T0期肺组织Bcl-2蛋白表达 （SABC×400）A 组（3a）、B 组（3b）和 C 组（3c）肺组织视野中许多细胞胞浆可见明显棕黄色染色；图 4 各组大鼠 T2 期肺组织 Bcl-2 蛋白表达 （SABC×400）A 组（4a）和C组（4c）肺组织视野中极少数细胞胞浆可见棕黄色染色，B 组（4b）肺组织视野中少数细胞胞浆可见棕黄色染色；图 5 各组大鼠肺组织 T2 期细胞凋亡情况 （TUNEL×400）A 组（5a）和 C 组（5c）肺组织视野中许多细胞胞核可见明显棕黄色染色，B 组（5b）肺组织视野中少数细胞胞核可见棕黄色染色
2.2 肺组织 HO-1 活力测定
各组大鼠肺组织 HO-1 活力经过 CPB 后逐渐增加，在 T2 点活力最强，其后逐渐降低。B 组肺组织 HO-1 活力在 CPB 前后各期均高于 A 组和 C 组（P<0.05）。肺组织 HO-1 活力测定结果与免疫组化法检测的 HO-1 蛋白表达情况相一致，见表 2。
表2
各组大鼠不同时间点肺组织 HO-1 的活力测定比较[ pmol/（mg·h），
]
2.3 肺组织 Bcl-2 蛋白测定
各组大鼠肺组织细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白在 CPB 前差异无统计学意义（P>0.05），CPB 后 Bcl-2 蛋白逐渐下调，到 T2 点减少最明显，之后逐渐上调。B 组在 CPB 后各期 Bcl-2 蛋白表达全部高于 A 组和 C 组，其差异有统计学意义（P<0.05），见表 3、图 3、图 4。
表3
各组大鼠不同时间点肺组织 Bcl-2 蛋白的测定结果比较（
）
2.4 肺组织凋亡指数的测定
各组大鼠肺组织细胞 AI 在 CPB 前差异无统计学意义，CPB 后 AI 逐渐增加，到 T2 点增加最明显，之后逐渐下降。B 组在 CPB 后各期 AI 均显著低于 A 组和 C 组（P<0.05），见表 4、图 5。
表4
各组大鼠不同时间点肺组织凋亡指数的测定结果比较（%，
）
2.5 肺组织病理学改变
光镜下观察各组大鼠肺组织在 CPB 前 T0 期肺泡腔较为完整，无明显组织液渗出。肺泡间隔无明显增厚，均匀一致，肺泡壁无明显增厚，较为光滑，肺泡腔内未见明显渗出液或仅有少量白细胞渗出。CPB 后 A 组和 C 组大鼠肺泡间隔明显增厚、肺泡壁水肿，毛细血管扩张明显，并出现充血性改变，肺泡间质以及肺泡腔内出现明显的炎性细胞渗出浸润，渗出的炎性细胞以中性粒细胞为主，部分肺泡腔内能观察到渗出的红细胞、炎性渗出液体；与 A 组和 C 组相比，B 组肺泡间隔增厚减轻，肺泡腔内渗出明显减少，较少观察到炎性渗出液体及红细胞。间质水肿也有明显减轻，肺泡毛细血管充血性改变明显减轻，炎性细胞渗出浸润明显减少。各组大鼠肺组织损伤的形态学变化在 T2 期最严重, 见图 6、图 7。
图6
各组大鼠肺组织 T0 期光镜观察图 （HE染色×100） A 组（6a）、B 组（6b）和 C 组（6c）肺组织 T0 期光镜观察图；图 7 各组大鼠肺组织 T2 期光镜观察图 （HE×100）A 组（7a）、B 组（7b）和 C 组（7c）肺组织 T2 期光镜观察图
3 讨论
当机体的某些组织器官以及一些细胞受到一定的应激条件时，机体就会被诱导生成 HO-1，从而发挥保护作用，发挥其抗炎性反应、抗氧化应激[1,6]以及抗增生和抗细胞调亡的效应[7-8]。肺损伤是心脏外科领域尤其是CPB 后发生最早、最普遍，也是最难治疗的并发症之一[9-10]。目前有许多研究证实 HO-1 在肺脏疾病中发挥保护作用，大多心脏外科手术需要经过 CPB 甚至深低温停循环这样一个非生理过程，对于经过这样一个复杂的病理生理过程后，HO-1 是否仍能发挥肺损伤保护作用，其具体的机制又如何？目前国内外研究较少。本实验重点研究在 CPB 后，肺组织细胞凋亡检测，并探讨 HO-1 在 CPB 后肺损伤中发挥的抗细胞凋亡作用，并具体研究其发挥保护作用可能的机制。
本实验表明，在 CPB 前，各组大鼠肺组织 HO-1 表达较少，表明正常情况下，HO-1 表达较少。CPB 后大鼠肺组织 HO-1 表达逐渐增加，表明了 CPB 带来缺血再灌注损伤的同时，也启动了 HO-1 表达的内在保护系统。而且本研究表明在 CPB 前及 CPB 后各时间点 CoPP 组 HO-1 表达明显高于较对照组，表明 CoPP 可以诱导肺组织 HO-1 蛋白的表达，而加入 ZnPP 后 HO-1 表达与对照组无明显差异，说明 ZnPP 抑制了肺组织 HO-1 蛋白的表达。
细胞凋亡是引起肺缺血再灌注早期肺损伤的重要因素之一，而Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织内细胞凋亡最常发生的细胞，也见于肺组织的气道上皮细胞等[11-13]。本实验中 CPB 后细胞凋亡比例逐渐增加，说明了缺血再灌注后细胞凋亡事件参与了肺损伤过程，进一步提示抑制细胞凋亡可在肺缺血再灌注损伤中发挥保护作用。细胞凋亡的发生过程中，Bcl-2 家族起了举足轻重的作用，其中 Bcl-2 是一种原癌基因，是机体内至关重要的抗凋亡基因，能够抑制多种细胞毒因素引起的细胞死亡[14-15]。目前研究指出 Bcl-2 抑制细胞凋亡的作用可能与以下几种作用有关[16-18]：抑制钙离子的跨膜流动[19]；减少氧自由基生成和脂质过氧化反应，发挥抗氧化损伤作用；抑制线粒体通透性的改变，抑制线粒体释放凋亡蛋白激活因子细胞色素 C 和凋亡诱导因子[20-21]；Bcl-2 还可与 Bcl-2 家族外的蛋白结合，共同发挥其抗凋亡作用；它还可以将凋亡蛋白的前体物质凋亡酶活化因子等定位至线粒体膜上，从而抑制其发挥促凋亡作用。此研究数据表明 CoPP 组大鼠 CPB 后肺组织抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达要明显强于对照组和 ZnPP 抑制组，CoPP 组大鼠肺组织经过 CPB 过程后发生细胞凋亡的比例明显减少。因此该研究证实 HO-1 能够在 CPB 过程中减轻和抑制大鼠 CPB 过程中肺组织细胞的细胞凋亡的发生，其抗凋亡作用可能是通过上调抗凋亡相关蛋白 Bcl-2 在肺组织中的表达来实现的。ZnPP 组大鼠 Bcl-2 的表达较 CoPP 组明显减少，说明 HO-1 的抗凋亡作用可被 HO-1 的特异性抑制剂减弱。
在本实验中，从病理切片上观察到 CPB 开始后肺组织的损伤逐渐加重，而经过 CoPP 预处理组肺组织，其损伤程度明显减轻。这从形态学上再次证明了 CoPP 预处理可以减轻大鼠体外循环后肺组织的损伤，改善术后肺功能。C 组中加入了 ZnPP 后，肺组织的损伤程度在病理切片上与对照组类似，再次说明了这一保护作用可被 HO-1 的特异性抑制剂 ZnPP 所抑制。
综上所述，CoPP 可以诱导肺组织 HO-1 的高表达，使其活性增加，而且经过 CPB 这一复杂的病理生理过程后，仍保持较高的表达。内源性 HO-1 高表达在 CPB 肺损伤中具有一定的抗细胞凋亡作用。从而减轻 CPB 后肺组织损伤的发生。其抗凋亡作用可能通过使抗凋亡蛋白 Bcl-2 增高而实现。因此通过各种途径诱导 HO-1 在肺组织的高表达能够为心脏外科领域 CPB 过程中肺功能的保护另辟蹊径。
血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）作为一种内源性的保护基因[1]，在肺脏疾病的发生发展过程中，起到了重要的作用[2-3]。本实验旨在研究 HO-1 在体外循环后（CPB）肺组织细胞凋亡中发挥的保护作用，并具体研究其发挥保护作用可能的机制。
1 资料与方法
1.1 实验材料和分组
1.1.1 实验材料 本实验以 144 只雄性 Wistar 大鼠（体重 250～350 g）为研究对象，大鼠由青岛市药品检验所动物实验中心提供。主要试剂HO-1多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体、SP免疫组化染色试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司。钴原卟啉 (CoPP)、锌原卟啉 (ZnPP)购自Sigma公司。TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.2 分组 将大鼠按照随机原则分为 3 组，每组 48 只。A 组（对照组）：模型建立前 24 h 腹腔注射生理盐水；B 组 [钴原卟啉（CoPP）组]: 模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg）；C 组 [CoPP+锌原卟啉（ZnPP）组]：模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg），同时注射 ZnPP（5 mg/kg）。
1.2 实验方法
1.2.1 改良大鼠体外循环肺损伤模型的建立 采用复合诱导麻醉，通过右侧颈内动脉和颈静脉通路建立体外循环[4]。贮血器置于大鼠心脏平面以下 40 cm 左右，静脉血经过变温器变温，膜肺氧合后通过蠕动泵灌注进入右侧颈内动脉。CPB 开始前经股静脉置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血时间（ACT）在 480 s 以上后才能开始转流。胸骨正中切口，切开心包，分离主肺动脉，平均动脉压在 CPB 过程中维持在 55～60 mm Hg。转流渐趋平稳后，CPB 开始后 10 min，阻断肺动脉，停止机械通气，并行循环 50 min 后开放肺动脉，将颈静脉插管退回至右心房内，恢复机械通气，逐渐复温，30 min 内肛温达到 36.0℃ 左右停止体外循环。改良大鼠体外循环肺损伤模型模拟图见图 1。
图1
改良大鼠体外循环肺损伤模拟图
1.2.2 标本采集 建立改良大鼠 CPB 肺损伤模型后，采用断颈法分别于 CPB 前（T0）、CPB 结束即刻（T1）、CPB 后 2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期将动物处死，每次 8 只。取肺组织作相应指标检测。打开胸腔，取右肺组织，4% 的多聚甲醛固定部分肺组织，石蜡包埋，以备苏木精-伊红（HE）染色及各指标的免疫组织化学法测定。余肺组织置于液氮中冻存备用。
1.2.3 免疫组化法检测肺组织 HO-1 和 Bcl-2 蛋白表达的位置及强度 采用免疫组化链霉素亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）法检测。阳性表达为棕黄色颗粒。应用 Image-Pro Plus 6.0 病理图文分析系统分析图像，随机选择 5 个不同视野，测定阳性产物表达的平均光密度值（OD 值），HO-1 和 Bcl-2 蛋白阳性表达的强度用 5 个不同视野的 OD 值的均值来表示。
1.2.4 肺组织 HO-1 活力测定 根据 HO-1 降解血红素生成一氧化碳和胆红素的原理，计算肺组织中生成胆红素的量评估肺组织 HO-1 的活性。选择 464 nm 和 530 nm 双波长分光光度法来测定肺组织匀浆中胆红素生成量。胆红素摩尔吸光系数为 40 nm/cm，其结果用 pmol/（mg·h） 表示。
1.2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡 TUNEL 标记的阳性细胞即为凋亡细胞，其细胞核呈棕黄色染色。肺组织细胞凋亡指数（AI）[5]：每张切片镜检，测定 5 个不同高倍视野下的凋亡细胞数，凋亡指数=TUNEL 阳性细胞数之和/细胞数总数之和×100%。
1.2.6 大鼠肺组织病理学观察 通过 HE 染色，光镜下观察每组大鼠肺组织在不同时期的结构改变。
1.3 统计学分析
采用统计软件 SPSS 16.0 进行数据分析。经方差分析进行正态性检验，计量资料为正态分布，采用均数±标准差（ ）表示。各组组间、组内数据的比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织 HO-1 的表达
肺组织中 HO-1 蛋白表达主要在细胞膜或细胞浆中，阳性细胞表现为棕黄色染色。采用免疫组化方法显示肺组织细胞中 HO-1 蛋白阳性表达主要分布在细支气管上皮细胞以及肺泡上皮细胞，在肺组织血管内皮也有少量表达。统计数据显示 B 组肺组织 HO-1 蛋白表达在 CPB 前后各期均显著强于 A 组和 C 组（P<0.05）。各组大鼠肺组织在经过 CPB 后 HO-1 蛋白表达增加，在 T2 点表达最多。免疫组化检测的 HO-1 表达见表 1 及图 2。
表1
各组大鼠不同时间点肺组织 HO-1 的表达比较（
）
图2
各组大鼠肺组织 T2 期 HO-1 蛋白的表达 （SABC×200）A 组（2a）和C组（2c）肺组织中少数细胞胞浆可见棕黄色染色，B 组（2b）肺组织中许多细胞胞浆可见明显棕黄色染色；图 3 各组大鼠T0期肺组织Bcl-2蛋白表达 （SABC×400）A 组（3a）、B 组（3b）和 C 组（3c）肺组织视野中许多细胞胞浆可见明显棕黄色染色；图 4 各组大鼠 T2 期肺组织 Bcl-2 蛋白表达 （SABC×400）A 组（4a）和C组（4c）肺组织视野中极少数细胞胞浆可见棕黄色染色，B 组（4b）肺组织视野中少数细胞胞浆可见棕黄色染色；图 5 各组大鼠肺组织 T2 期细胞凋亡情况 （TUNEL×400）A 组（5a）和 C 组（5c）肺组织视野中许多细胞胞核可见明显棕黄色染色，B 组（5b）肺组织视野中少数细胞胞核可见棕黄色染色
2.2 肺组织 HO-1 活力测定
各组大鼠肺组织 HO-1 活力经过 CPB 后逐渐增加，在 T2 点活力最强，其后逐渐降低。B 组肺组织 HO-1 活力在 CPB 前后各期均高于 A 组和 C 组（P<0.05）。肺组织 HO-1 活力测定结果与免疫组化法检测的 HO-1 蛋白表达情况相一致，见表 2。
表2
各组大鼠不同时间点肺组织 HO-1 的活力测定比较[ pmol/（mg·h），
]
2.3 肺组织 Bcl-2 蛋白测定
各组大鼠肺组织细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白在 CPB 前差异无统计学意义（P>0.05），CPB 后 Bcl-2 蛋白逐渐下调，到 T2 点减少最明显，之后逐渐上调。B 组在 CPB 后各期 Bcl-2 蛋白表达全部高于 A 组和 C 组，其差异有统计学意义（P<0.05），见表 3、图 3、图 4。
表3
各组大鼠不同时间点肺组织 Bcl-2 蛋白的测定结果比较（
）
2.4 肺组织凋亡指数的测定
各组大鼠肺组织细胞 AI 在 CPB 前差异无统计学意义，CPB 后 AI 逐渐增加，到 T2 点增加最明显，之后逐渐下降。B 组在 CPB 后各期 AI 均显著低于 A 组和 C 组（P<0.05），见表 4、图 5。
表4
各组大鼠不同时间点肺组织凋亡指数的测定结果比较（%，
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2.5 肺组织病理学改变
光镜下观察各组大鼠肺组织在 CPB 前 T0 期肺泡腔较为完整，无明显组织液渗出。肺泡间隔无明显增厚，均匀一致，肺泡壁无明显增厚，较为光滑，肺泡腔内未见明显渗出液或仅有少量白细胞渗出。CPB 后 A 组和 C 组大鼠肺泡间隔明显增厚、肺泡壁水肿，毛细血管扩张明显，并出现充血性改变，肺泡间质以及肺泡腔内出现明显的炎性细胞渗出浸润，渗出的炎性细胞以中性粒细胞为主，部分肺泡腔内能观察到渗出的红细胞、炎性渗出液体；与 A 组和 C 组相比，B 组肺泡间隔增厚减轻，肺泡腔内渗出明显减少，较少观察到炎性渗出液体及红细胞。间质水肿也有明显减轻，肺泡毛细血管充血性改变明显减轻，炎性细胞渗出浸润明显减少。各组大鼠肺组织损伤的形态学变化在 T2 期最严重, 见图 6、图 7。
图6
各组大鼠肺组织 T0 期光镜观察图 （HE染色×100） A 组（6a）、B 组（6b）和 C 组（6c）肺组织 T0 期光镜观察图；图 7 各组大鼠肺组织 T2 期光镜观察图 （HE×100）A 组（7a）、B 组（7b）和 C 组（7c）肺组织 T2 期光镜观察图
3 讨论
当机体的某些组织器官以及一些细胞受到一定的应激条件时，机体就会被诱导生成 HO-1，从而发挥保护作用，发挥其抗炎性反应、抗氧化应激[1,6]以及抗增生和抗细胞调亡的效应[7-8]。肺损伤是心脏外科领域尤其是CPB 后发生最早、最普遍，也是最难治疗的并发症之一[9-10]。目前有许多研究证实 HO-1 在肺脏疾病中发挥保护作用，大多心脏外科手术需要经过 CPB 甚至深低温停循环这样一个非生理过程，对于经过这样一个复杂的病理生理过程后，HO-1 是否仍能发挥肺损伤保护作用，其具体的机制又如何？目前国内外研究较少。本实验重点研究在 CPB 后，肺组织细胞凋亡检测，并探讨 HO-1 在 CPB 后肺损伤中发挥的抗细胞凋亡作用，并具体研究其发挥保护作用可能的机制。
本实验表明，在 CPB 前，各组大鼠肺组织 HO-1 表达较少，表明正常情况下，HO-1 表达较少。CPB 后大鼠肺组织 HO-1 表达逐渐增加，表明了 CPB 带来缺血再灌注损伤的同时，也启动了 HO-1 表达的内在保护系统。而且本研究表明在 CPB 前及 CPB 后各时间点 CoPP 组 HO-1 表达明显高于较对照组，表明 CoPP 可以诱导肺组织 HO-1 蛋白的表达，而加入 ZnPP 后 HO-1 表达与对照组无明显差异，说明 ZnPP 抑制了肺组织 HO-1 蛋白的表达。
细胞凋亡是引起肺缺血再灌注早期肺损伤的重要因素之一，而Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织内细胞凋亡最常发生的细胞，也见于肺组织的气道上皮细胞等[11-13]。本实验中 CPB 后细胞凋亡比例逐渐增加，说明了缺血再灌注后细胞凋亡事件参与了肺损伤过程，进一步提示抑制细胞凋亡可在肺缺血再灌注损伤中发挥保护作用。细胞凋亡的发生过程中，Bcl-2 家族起了举足轻重的作用，其中 Bcl-2 是一种原癌基因，是机体内至关重要的抗凋亡基因，能够抑制多种细胞毒因素引起的细胞死亡[14-15]。目前研究指出 Bcl-2 抑制细胞凋亡的作用可能与以下几种作用有关[16-18]：抑制钙离子的跨膜流动[19]；减少氧自由基生成和脂质过氧化反应，发挥抗氧化损伤作用；抑制线粒体通透性的改变，抑制线粒体释放凋亡蛋白激活因子细胞色素 C 和凋亡诱导因子[20-21]；Bcl-2 还可与 Bcl-2 家族外的蛋白结合，共同发挥其抗凋亡作用；它还可以将凋亡蛋白的前体物质凋亡酶活化因子等定位至线粒体膜上，从而抑制其发挥促凋亡作用。此研究数据表明 CoPP 组大鼠 CPB 后肺组织抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达要明显强于对照组和 ZnPP 抑制组，CoPP 组大鼠肺组织经过 CPB 过程后发生细胞凋亡的比例明显减少。因此该研究证实 HO-1 能够在 CPB 过程中减轻和抑制大鼠 CPB 过程中肺组织细胞的细胞凋亡的发生，其抗凋亡作用可能是通过上调抗凋亡相关蛋白 Bcl-2 在肺组织中的表达来实现的。ZnPP 组大鼠 Bcl-2 的表达较 CoPP 组明显减少，说明 HO-1 的抗凋亡作用可被 HO-1 的特异性抑制剂减弱。
在本实验中，从病理切片上观察到 CPB 开始后肺组织的损伤逐渐加重，而经过 CoPP 预处理组肺组织，其损伤程度明显减轻。这从形态学上再次证明了 CoPP 预处理可以减轻大鼠体外循环后肺组织的损伤，改善术后肺功能。C 组中加入了 ZnPP 后，肺组织的损伤程度在病理切片上与对照组类似，再次说明了这一保护作用可被 HO-1 的特异性抑制剂 ZnPP 所抑制。
综上所述，CoPP 可以诱导肺组织 HO-1 的高表达，使其活性增加，而且经过 CPB 这一复杂的病理生理过程后，仍保持较高的表达。内源性 HO-1 高表达在 CPB 肺损伤中具有一定的抗细胞凋亡作用。从而减轻 CPB 后肺组织损伤的发生。其抗凋亡作用可能通过使抗凋亡蛋白 Bcl-2 增高而实现。因此通过各种途径诱导 HO-1 在肺组织的高表达能够为心脏外科领域 CPB 过程中肺功能的保护另辟蹊径。
