引用本文： 尹力, 陈文, 何帅, 邱志兵. 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）信号通路在猪静脉桥血管早期再狭窄模型中的表达及作用. 中国胸心血管外科临床杂志, 2018, 25(5): 427-433. doi: 10.7507/1007-4848.201704029 复制
冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是一种血管炎性与复杂的多因素疾病病理生理参与的常见病[1]。随着社会的发展与人们生活水平的提高，CHD 在人群中的发病率逐年增加。冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）已成为心脏外科治疗 CHD 的常规手术之一，然而 CABG 术后桥血管通畅率不高[2]、桥血管再狭窄等术后并发症大大降低了手术效果，也给手术患者带来很大的困扰与痛苦。因此，CABG 术后桥血管的再狭窄机制成为当前研究的热点，目前认为血管再狭窄可能与细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的降解、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖迁移和不良的血管重塑（vascular remodeling，VR）等因素有关[3]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL）作为 lipocalin 家族中的一员更多作为一种致炎因子用于急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）等的研究[4]，但近些年有研究表明NGAL 在动脉粥样硬化、血管狭窄的形成中有特殊意义[5-6]，最近有大量的临床研究表明，NGAL 与 CHD、心肌梗死的发生与预后有重要的联系[7-9]。但 NGAL 在心血管中，特别是在 CABG 术后，导致血管狭窄、致炎、血管损伤等方面作用机制还未被阐明。本文通过建立动物模型，模拟一种与人 CABG 术后桥静脉再狭窄相关的病理过程，探讨 NGAL 及其下游的作用因子在静脉桥血管中表达，从而探索 NGAL 信号通路在动脉粥样硬化、血管狭窄的形成中可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
健康的普通长白猪 18 只，雌雄不拘，体重 25～30 kg。超薄切片机（RM213 型，Leica 公司，德国），光学显微镜（ⅣC TK-870E，Olympus 公司，日本），高清晰度数码显微图像分析系统（Axioplan 2 imaging，Zeiss 公司，德国）；NGAL（AntibodyShop 公司，丹麦）；基质金属蛋白酶（MMP）9、MMP2、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）1（Abcam 公司，美国）。
1.2 猪静脉桥再狭窄模型的建立
根据万松等[10-11]实验方式建立猪静脉桥模型，将实验对象用盐酸氯胺酮（20 mg/kg）、阿托品（1 mg）肌肉注射基础麻醉后，行气管插管并接麻醉机辅助通气，再以氯胺酮和苯巴比妥钠静脉维持麻醉。局部消毒铺巾后，取后腿外侧切口，长约 8～10 cm，采用“no-touch”技术剥离大隐静脉，分支以 3-0 丝线结扎，游离其主干长约 10 cm ，离断后置于合肝素和硝酸甘油的常温生理盐水中冲洗并保存备用。然后颈部两侧气管旁 8～10 cm 距离纵切口，逐层分离颈部肌群，于两侧气管食管沟内解剖出两侧颈总动脉。离断动脉前给予肝素钠 1 mg/kg 静脉注射，全身肝素化后用 Bulldog 钳阻断动脉两端，预留动脉段约 3 cm，从动脉段中间切断，断端一侧剪开并斜剪为 45 度，大隐静脉等分为两段同样剪为 45 度，倒转，然后用 7-0 Prolene 线与两侧颈总动脉进行端端吻合，吻合方式同血管吻合，完毕后开放阻断钳，静脉桥充盈，触之有搏动，切口常规逐层缝合。复苏后常规饲养，未使用抗生素和抗凝药。
1.3 术后分组及标本制备
将动物标本随机分为建模后 7 d、14 d 和 30 d 共 3 组，每组 6 只，分别于建模后不同时间点，将猪麻醉后，经原颈部切口于气管食管沟内找到静脉桥，切断静脉桥远端吻合口动脉端，可见血液喷出，证实静脉桥通畅，保留两端动脉约 1 cm，完整取下静脉桥，10% 中性甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等程序制成蜡块，切片厚度 5 μm，以未移植前大隐静脉为对照。
1.4 实验方法
1.4.1 苏木素-伊红（HE）染色与 Masson 染色
通过 HE 染色，石蜡切片脱蜡水化，苏木素染色 5 min，流水冲洗 10 min，1% 氯化氢脱色，流水冲洗 10 min，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。苏木素染液为碱性，使细胞核着紫蓝色；伊红为酸性，使细胞质着红色，通过 Masson 染色法将胶原纤维染成绿色，平滑肌纤维呈红色。用光镜观察静脉桥内膜、中膜、外膜的变化，以及各层膜中胶原变化和 VSMC 增殖、迁移情况，拍照以做记录。
1.4.2 免疫组织化学染色
石蜡切片脱蜡水化，过氧化氢消耗过氧化氢酶，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗 5 min，3 次，枸橼酸缓冲液水煮抗原修复，山羊血清工作液封闭，分别加入一抗 NGAL、MMP9、MMP2、TIMP1，滴加一抗稀释液作为阴性参照组，4℃ 孵育过夜，室温复温 1 h，PBS 浸洗 5 min，4 次，分别滴加二抗，室温孵育 15 min，显微镜下 DAB 液染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。染色结果判定标准多参照 Fromowitz 等半定量分级法方法，在高倍镜下对细胞核内反应作如下评分：① 无着色为 0 分，淡黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；② 阳性范围：<5% 为 0 分，5%～25% 为 1 分，26%～50% 为 2 分，51%～75% 为 3 分，>75% 为 4 分。两项结果相加<2 分为阴性（–），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中度阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），其中（–）～（+）视为低表达，（++）～（+++）视为过表达。
1.5 统计学分析
所有数据均应用 SPSS11.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE 染色与 Masson 染色结果
HE 染色，光镜下观察，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈淡粉红色，肌纤维呈亮粉红色，与对照组相比，实验组中静脉桥血管中膜层胶原基质降解，中膜层肌纤维增生，并向内膜层迁移，建模 14 d 与 7 d 相比，中膜层肌纤维染色明显，并且向内膜层迁移，建模 30 d 肌纤维层明显向内膜层迁移，并且中膜层胶原基质降解，弹力纤维层甚至出现断裂、紊乱现象，由此不难看出，桥血管的狭窄，与中膜层胶原基质降解，肌纤维增生并向内膜迁移有着密切的联系，胶原基质降解，弹力纤维层被破坏，肌纤维增厚向内膜迁移，从而导致桥血管的再狭窄（图 1a）。Masson 染色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色。建模 14 d 蓝色的胶原纤维逐渐被红色的肌纤维取代，30 d 时红色肌纤维增多并向内膜层延伸，并且中膜、内膜层细胞排列紊乱，失去原来的血管结构（图 1b），这与 HE 染色的结果一致。提示本实验建立桥血管狭窄模型成功。
2.2 免疫组织化学染色结果
2.2.1 NGAL 在桥血管中的表达
正常静脉中，血管内膜、中膜和外膜 NAGL 表达均呈阴性或弱阳性（图 2a）；建模 7 d 与正常静脉相似，无明显表达；建模后 14 d 与正常静脉相比，中膜层明显出现 NGAL 表达（P<0.05），内膜、外膜层未见明显表达，建模后 30 d 与正常静脉相比，中膜层 NGAL 的表达量增加（P<0.05），并且有向内膜层迁移的趋势，而与建模后 14 d 相比，表达量增加不明显（图 2b）。由此可以看出，NGAL 参与到血管再狭窄的过程中，最初主要作用于血管中膜层，在建模后 14 d开始出现一个表达高峰，并一直持续到建模后 30 d，并且随着时间的推移，内膜层也逐渐出现 NGAL 的表达。
2.2.2 MMP9、MMP2 在桥血管中的表达
正常大隐静脉中 MMP9 几乎不表达（图 3a），建模后 7 d 中膜层 MMP9 开始出现阳性表达（P<0.05），与正常静脉相比，术后 14 d 中膜层阳性表达显著（P<0.05），并且内膜层也出现阳性表达，建模后 30 d 中膜 MMP9 表达明显减少。MMP2 也出现类似 MMP9 的表达趋势，只是表达量相对于 MMP9 较少（图 3b）。由此可以看出，MMP9 和 MMP2 在建模后 7d 出现明显表达，在 14 d 后出现表达高峰，此后逐渐减少，30 d 时 MMP9 和 MMP2 表达量已经明显下降，与正常大隐静脉无明显差异。
2.2.3 TIMP1 在桥血管中的表达
本实验同时检测不同建模时间后 TIMP1 的表达（图 4a），可以看出建模后 14 d 的表达量明显增加，与正常静脉相比，差异有统计学意义（P<0.05），与 MMP9、MMP2 相比，TIMP1 的表达有相对滞后的趋势（图 4b），并且表达量与 MMP9、MMP2 相比也相对较低，考虑可能与 TIMP1 的负性调节有关。
3 讨论
有研究[12]表明，基质的降解和 VSMC 的增殖活性改变等血管重塑的发生，参与并促进了血管桥再狭窄的发生过程。本研究发现建模后 7 d 静脉桥血管中膜层胶原基质开始出现降解，中膜层肌纤维逐渐增生，建模 14 d 后，中膜层肌纤维增生明显，并且向内膜层迁移，建模 30 d 中膜层胶原基质降解，甚至出现断裂现象，并且肌纤维层明显向内膜层迁移，直观地展现了桥血管发生狭窄的病理过程。
NGAL 最早用于研究急、慢性肾损伤等的病理过程，在肾脏疾病中作为一种是新型标志物运用到临床中，并且有研究表明 NGAL 在抑制肿瘤细胞粘附、转移、血管生成等方面具有应用价值[13-14]。近些年 NGAL 逐渐应用到心脏疾病中去，Kafkas 等[5]报道 CHD 患者血清 NGAL 水平与C反应蛋白（CRP）、白细胞数显著正相关，提示血清中 NGAL 可反映冠状动脉综合征患者的炎症水平，有研究表明，在 CHD 患者血清中 NGAL 的表达量明显高于正常人，并且 NGAL 在不同冠状动脉狭窄程度时表达有明显差异，说明 NGAL 在 CHD 的形成、血管狭窄中发挥作用，NGAL 存在于中性粒细胞中的过氧化物酶阴性颗粒中[15]，NF-κB 的活化能够促进 NGAL 的表达[16]。各种危险因素、环境、应激的因素，可通过白介素（IL）1、IL6、肿瘤坏死因子（TNF）-α 等炎症因子的表达，促进核因子-κB（NF-κB）的表达增加，可促使 NGAL 在转录水平、蛋白水平升高。本研究显示，在正常静脉中 NAGL 无明显表达；在建立猪狭窄静脉桥模型后，随着时间的推移 NGAL 的表达量出现明显变化，特别是在中膜层，14 d 表达量明显增加，30 d 后达到一个表达高峰，并有向内膜层迁移的趋势。此实验可以直观看到在桥血管狭窄的急性期 NGAL 的主要作用靶点，并且可以看到在整个急性期内 NGAL 表达趋势的变化，不难看出，NGAL 在整个桥血管狭窄的发生过程中起促进作用。
NGAL 是在研究 MMP9 时发现的 MMPs 作为 NGAL 的下游因子已被证明是斑块不稳定的关键因素[17-18]，血管斑块的不稳定性是造成血管粥样硬化性狭窄的原因之一，研究表明 MMPs 在细胞迁移和基质重塑中发挥作用[19]。
MMP9 主要由中性粒细胞和巨噬细胞合成与分泌，降解血管基膜，促进病理性血管重塑，有研究表明血清 MMP9 的浓度与冠状动脉狭窄严重程度之间有相关性[20]，Kalela 等[21]通过研究糖尿病、高脂血症等 CHD 的危险因素与 MMP9 的关系，发现 MMP9 与白细胞计数呈显著正相关，说明 MMP9 作为致炎因子参与血管狭窄的发生。大部分情况下 MMP9 以前体形式（pro-MMP9）分泌，而 NGAL 可与之以二硫键为基础形成异源二聚体 NGAL/pro-MMP9 共同发挥作用[22]。本实验显示 MMP9 在建模后也出现类似 NGAL 的表达，建模后 7 d 表达量明显增加，表达的高峰期出现在建模后 14 d，而建模后 30 d 表达量已经明显下降，MMP2 与 MMP9 有相似的表达。但是 MMPs 的表达与 NGAL 并不完全同步，考虑可能与 TIMP1 负性调节有关。
有研究[23]表明，TIMP1 的表达没有对血管的狭窄起直接的作用，而是因为血管壁中 MMPs 的升高所产生的代偿反应，所以 TIMP1 相当于一个负性调节因子，在通路中起平衡作用，研究[24]发现 TIMP2 具有类似的特性，TIMPs 的作用机制阻止平滑肌细胞向合成型转变，抑制基质的合成和 VSMC 的迁移。基质的合成降解以及平滑肌的迁移增生取决于 MMPs 和 TIMPs 之间的动态平衡[25]。通常情况下，TIMP1、TIMP2 作为 MMP9 内源性抑制因子可负性调节 MMP9 的活性，本实验可以看出，TIMP1 在建模后 14 d 出现一个明显的表达峰值，我们可以推测，正是 MMPs 在建模后第 7～14 d 的表达增殖，触发了 TIMP1 的反馈抑制，但其反馈抑制能力相对较弱，并不能逆转只能相对延缓桥静脉狭窄的过程。
因此，通过本实验，我们可以初步论证 NGAL 信号通路在静脉桥血管再狭窄中的作用及机制。一些损伤、应激、缺氧等刺激，导致机体内 IL1、IL6、TNF-α 等炎症因子表达增加，从而通过 NF-κB 促使 NGAL 的表达量增加，进而增加 NGAL 下游 MMP2、MMP9 等蛋白的表达，增强其蛋白水解活性，从而促进降解细胞外基质的降解，基膜中细胞外基质降解，弹力纤维完整性遭到破坏，平滑肌细胞向内膜迁移，造成静脉桥血管的狭窄，整个过程受到 TIMP1、TIMP2 的反馈抑制（图 5）。综上所述，本文通过研究 NGAL 等因子在桥血管早期再狭窄中的作用，初步明确一条可能的信号通道，从而对桥静脉的早期再狭窄过程有了新的认识，并希望能为临床抑制或者延缓桥血管再狭窄提供一个新的思路。
图1
HE 与 Masson 染色中术前与术后不同时间胶原纤维与肌纤维的分布情况
a：将标本切片进行 HE 染色，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈淡粉红色，肌纤维呈亮粉红色（×100）；b：Masson 染色时胶原纤维呈蓝绿色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色（×100）；NC：术前对照组静脉
图2
NGAL 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，NGAL 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化，棕褐色颗粒为 NGAL 表达；b：建模后中膜层与正常静脉 NGAL 的表达量比较；*：建模后 14 d 中膜层与正常静脉 NGAL 的表达量比较，
图3
MMP2、MMP9 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，MMP2、MMP9 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化；b：建模后与正常静脉表达量比较，*：建模后 7 d 与正常静脉表达量比较，
图4
TIMP1 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，TIMP1 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化；b：建模后 14 d 与正常静脉表达量比较，*：建模后 14 d 与正常静脉表达量比较，
图5
NGAL 信号通路模式图
冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是一种血管炎性与复杂的多因素疾病病理生理参与的常见病[1]。随着社会的发展与人们生活水平的提高，CHD 在人群中的发病率逐年增加。冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）已成为心脏外科治疗 CHD 的常规手术之一，然而 CABG 术后桥血管通畅率不高[2]、桥血管再狭窄等术后并发症大大降低了手术效果，也给手术患者带来很大的困扰与痛苦。因此，CABG 术后桥血管的再狭窄机制成为当前研究的热点，目前认为血管再狭窄可能与细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的降解、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖迁移和不良的血管重塑（vascular remodeling，VR）等因素有关[3]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL）作为 lipocalin 家族中的一员更多作为一种致炎因子用于急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）等的研究[4]，但近些年有研究表明NGAL 在动脉粥样硬化、血管狭窄的形成中有特殊意义[5-6]，最近有大量的临床研究表明，NGAL 与 CHD、心肌梗死的发生与预后有重要的联系[7-9]。但 NGAL 在心血管中，特别是在 CABG 术后，导致血管狭窄、致炎、血管损伤等方面作用机制还未被阐明。本文通过建立动物模型，模拟一种与人 CABG 术后桥静脉再狭窄相关的病理过程，探讨 NGAL 及其下游的作用因子在静脉桥血管中表达，从而探索 NGAL 信号通路在动脉粥样硬化、血管狭窄的形成中可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
健康的普通长白猪 18 只，雌雄不拘，体重 25～30 kg。超薄切片机（RM213 型，Leica 公司，德国），光学显微镜（ⅣC TK-870E，Olympus 公司，日本），高清晰度数码显微图像分析系统（Axioplan 2 imaging，Zeiss 公司，德国）；NGAL（AntibodyShop 公司，丹麦）；基质金属蛋白酶（MMP）9、MMP2、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）1（Abcam 公司，美国）。
1.2 猪静脉桥再狭窄模型的建立
根据万松等[10-11]实验方式建立猪静脉桥模型，将实验对象用盐酸氯胺酮（20 mg/kg）、阿托品（1 mg）肌肉注射基础麻醉后，行气管插管并接麻醉机辅助通气，再以氯胺酮和苯巴比妥钠静脉维持麻醉。局部消毒铺巾后，取后腿外侧切口，长约 8～10 cm，采用“no-touch”技术剥离大隐静脉，分支以 3-0 丝线结扎，游离其主干长约 10 cm ，离断后置于合肝素和硝酸甘油的常温生理盐水中冲洗并保存备用。然后颈部两侧气管旁 8～10 cm 距离纵切口，逐层分离颈部肌群，于两侧气管食管沟内解剖出两侧颈总动脉。离断动脉前给予肝素钠 1 mg/kg 静脉注射，全身肝素化后用 Bulldog 钳阻断动脉两端，预留动脉段约 3 cm，从动脉段中间切断，断端一侧剪开并斜剪为 45 度，大隐静脉等分为两段同样剪为 45 度，倒转，然后用 7-0 Prolene 线与两侧颈总动脉进行端端吻合，吻合方式同血管吻合，完毕后开放阻断钳，静脉桥充盈，触之有搏动，切口常规逐层缝合。复苏后常规饲养，未使用抗生素和抗凝药。
1.3 术后分组及标本制备
将动物标本随机分为建模后 7 d、14 d 和 30 d 共 3 组，每组 6 只，分别于建模后不同时间点，将猪麻醉后，经原颈部切口于气管食管沟内找到静脉桥，切断静脉桥远端吻合口动脉端，可见血液喷出，证实静脉桥通畅，保留两端动脉约 1 cm，完整取下静脉桥，10% 中性甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等程序制成蜡块，切片厚度 5 μm，以未移植前大隐静脉为对照。
1.4 实验方法
1.4.1 苏木素-伊红（HE）染色与 Masson 染色
通过 HE 染色，石蜡切片脱蜡水化，苏木素染色 5 min，流水冲洗 10 min，1% 氯化氢脱色，流水冲洗 10 min，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。苏木素染液为碱性，使细胞核着紫蓝色；伊红为酸性，使细胞质着红色，通过 Masson 染色法将胶原纤维染成绿色，平滑肌纤维呈红色。用光镜观察静脉桥内膜、中膜、外膜的变化，以及各层膜中胶原变化和 VSMC 增殖、迁移情况，拍照以做记录。
1.4.2 免疫组织化学染色
石蜡切片脱蜡水化，过氧化氢消耗过氧化氢酶，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗 5 min，3 次，枸橼酸缓冲液水煮抗原修复，山羊血清工作液封闭，分别加入一抗 NGAL、MMP9、MMP2、TIMP1，滴加一抗稀释液作为阴性参照组，4℃ 孵育过夜，室温复温 1 h，PBS 浸洗 5 min，4 次，分别滴加二抗，室温孵育 15 min，显微镜下 DAB 液染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。染色结果判定标准多参照 Fromowitz 等半定量分级法方法，在高倍镜下对细胞核内反应作如下评分：① 无着色为 0 分，淡黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；② 阳性范围：<5% 为 0 分，5%～25% 为 1 分，26%～50% 为 2 分，51%～75% 为 3 分，>75% 为 4 分。两项结果相加<2 分为阴性（–），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中度阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），其中（–）～（+）视为低表达，（++）～（+++）视为过表达。
1.5 统计学分析
所有数据均应用 SPSS11.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE 染色与 Masson 染色结果
HE 染色，光镜下观察，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈淡粉红色，肌纤维呈亮粉红色，与对照组相比，实验组中静脉桥血管中膜层胶原基质降解，中膜层肌纤维增生，并向内膜层迁移，建模 14 d 与 7 d 相比，中膜层肌纤维染色明显，并且向内膜层迁移，建模 30 d 肌纤维层明显向内膜层迁移，并且中膜层胶原基质降解，弹力纤维层甚至出现断裂、紊乱现象，由此不难看出，桥血管的狭窄，与中膜层胶原基质降解，肌纤维增生并向内膜迁移有着密切的联系，胶原基质降解，弹力纤维层被破坏，肌纤维增厚向内膜迁移，从而导致桥血管的再狭窄（图 1a）。Masson 染色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色。建模 14 d 蓝色的胶原纤维逐渐被红色的肌纤维取代，30 d 时红色肌纤维增多并向内膜层延伸，并且中膜、内膜层细胞排列紊乱，失去原来的血管结构（图 1b），这与 HE 染色的结果一致。提示本实验建立桥血管狭窄模型成功。
2.2 免疫组织化学染色结果
2.2.1 NGAL 在桥血管中的表达
正常静脉中，血管内膜、中膜和外膜 NAGL 表达均呈阴性或弱阳性（图 2a）；建模 7 d 与正常静脉相似，无明显表达；建模后 14 d 与正常静脉相比，中膜层明显出现 NGAL 表达（P<0.05），内膜、外膜层未见明显表达，建模后 30 d 与正常静脉相比，中膜层 NGAL 的表达量增加（P<0.05），并且有向内膜层迁移的趋势，而与建模后 14 d 相比，表达量增加不明显（图 2b）。由此可以看出，NGAL 参与到血管再狭窄的过程中，最初主要作用于血管中膜层，在建模后 14 d开始出现一个表达高峰，并一直持续到建模后 30 d，并且随着时间的推移，内膜层也逐渐出现 NGAL 的表达。
2.2.2 MMP9、MMP2 在桥血管中的表达
正常大隐静脉中 MMP9 几乎不表达（图 3a），建模后 7 d 中膜层 MMP9 开始出现阳性表达（P<0.05），与正常静脉相比，术后 14 d 中膜层阳性表达显著（P<0.05），并且内膜层也出现阳性表达，建模后 30 d 中膜 MMP9 表达明显减少。MMP2 也出现类似 MMP9 的表达趋势，只是表达量相对于 MMP9 较少（图 3b）。由此可以看出，MMP9 和 MMP2 在建模后 7d 出现明显表达，在 14 d 后出现表达高峰，此后逐渐减少，30 d 时 MMP9 和 MMP2 表达量已经明显下降，与正常大隐静脉无明显差异。
2.2.3 TIMP1 在桥血管中的表达
本实验同时检测不同建模时间后 TIMP1 的表达（图 4a），可以看出建模后 14 d 的表达量明显增加，与正常静脉相比，差异有统计学意义（P<0.05），与 MMP9、MMP2 相比，TIMP1 的表达有相对滞后的趋势（图 4b），并且表达量与 MMP9、MMP2 相比也相对较低，考虑可能与 TIMP1 的负性调节有关。
3 讨论
有研究[12]表明，基质的降解和 VSMC 的增殖活性改变等血管重塑的发生，参与并促进了血管桥再狭窄的发生过程。本研究发现建模后 7 d 静脉桥血管中膜层胶原基质开始出现降解，中膜层肌纤维逐渐增生，建模 14 d 后，中膜层肌纤维增生明显，并且向内膜层迁移，建模 30 d 中膜层胶原基质降解，甚至出现断裂现象，并且肌纤维层明显向内膜层迁移，直观地展现了桥血管发生狭窄的病理过程。
NGAL 最早用于研究急、慢性肾损伤等的病理过程，在肾脏疾病中作为一种是新型标志物运用到临床中，并且有研究表明 NGAL 在抑制肿瘤细胞粘附、转移、血管生成等方面具有应用价值[13-14]。近些年 NGAL 逐渐应用到心脏疾病中去，Kafkas 等[5]报道 CHD 患者血清 NGAL 水平与C反应蛋白（CRP）、白细胞数显著正相关，提示血清中 NGAL 可反映冠状动脉综合征患者的炎症水平，有研究表明，在 CHD 患者血清中 NGAL 的表达量明显高于正常人，并且 NGAL 在不同冠状动脉狭窄程度时表达有明显差异，说明 NGAL 在 CHD 的形成、血管狭窄中发挥作用，NGAL 存在于中性粒细胞中的过氧化物酶阴性颗粒中[15]，NF-κB 的活化能够促进 NGAL 的表达[16]。各种危险因素、环境、应激的因素，可通过白介素（IL）1、IL6、肿瘤坏死因子（TNF）-α 等炎症因子的表达，促进核因子-κB（NF-κB）的表达增加，可促使 NGAL 在转录水平、蛋白水平升高。本研究显示，在正常静脉中 NAGL 无明显表达；在建立猪狭窄静脉桥模型后，随着时间的推移 NGAL 的表达量出现明显变化，特别是在中膜层，14 d 表达量明显增加，30 d 后达到一个表达高峰，并有向内膜层迁移的趋势。此实验可以直观看到在桥血管狭窄的急性期 NGAL 的主要作用靶点，并且可以看到在整个急性期内 NGAL 表达趋势的变化，不难看出，NGAL 在整个桥血管狭窄的发生过程中起促进作用。
NGAL 是在研究 MMP9 时发现的 MMPs 作为 NGAL 的下游因子已被证明是斑块不稳定的关键因素[17-18]，血管斑块的不稳定性是造成血管粥样硬化性狭窄的原因之一，研究表明 MMPs 在细胞迁移和基质重塑中发挥作用[19]。
MMP9 主要由中性粒细胞和巨噬细胞合成与分泌，降解血管基膜，促进病理性血管重塑，有研究表明血清 MMP9 的浓度与冠状动脉狭窄严重程度之间有相关性[20]，Kalela 等[21]通过研究糖尿病、高脂血症等 CHD 的危险因素与 MMP9 的关系，发现 MMP9 与白细胞计数呈显著正相关，说明 MMP9 作为致炎因子参与血管狭窄的发生。大部分情况下 MMP9 以前体形式（pro-MMP9）分泌，而 NGAL 可与之以二硫键为基础形成异源二聚体 NGAL/pro-MMP9 共同发挥作用[22]。本实验显示 MMP9 在建模后也出现类似 NGAL 的表达，建模后 7 d 表达量明显增加，表达的高峰期出现在建模后 14 d，而建模后 30 d 表达量已经明显下降，MMP2 与 MMP9 有相似的表达。但是 MMPs 的表达与 NGAL 并不完全同步，考虑可能与 TIMP1 负性调节有关。
有研究[23]表明，TIMP1 的表达没有对血管的狭窄起直接的作用，而是因为血管壁中 MMPs 的升高所产生的代偿反应，所以 TIMP1 相当于一个负性调节因子，在通路中起平衡作用，研究[24]发现 TIMP2 具有类似的特性，TIMPs 的作用机制阻止平滑肌细胞向合成型转变，抑制基质的合成和 VSMC 的迁移。基质的合成降解以及平滑肌的迁移增生取决于 MMPs 和 TIMPs 之间的动态平衡[25]。通常情况下，TIMP1、TIMP2 作为 MMP9 内源性抑制因子可负性调节 MMP9 的活性，本实验可以看出，TIMP1 在建模后 14 d 出现一个明显的表达峰值，我们可以推测，正是 MMPs 在建模后第 7～14 d 的表达增殖，触发了 TIMP1 的反馈抑制，但其反馈抑制能力相对较弱，并不能逆转只能相对延缓桥静脉狭窄的过程。
因此，通过本实验，我们可以初步论证 NGAL 信号通路在静脉桥血管再狭窄中的作用及机制。一些损伤、应激、缺氧等刺激，导致机体内 IL1、IL6、TNF-α 等炎症因子表达增加，从而通过 NF-κB 促使 NGAL 的表达量增加，进而增加 NGAL 下游 MMP2、MMP9 等蛋白的表达，增强其蛋白水解活性，从而促进降解细胞外基质的降解，基膜中细胞外基质降解，弹力纤维完整性遭到破坏，平滑肌细胞向内膜迁移，造成静脉桥血管的狭窄，整个过程受到 TIMP1、TIMP2 的反馈抑制（图 5）。综上所述，本文通过研究 NGAL 等因子在桥血管早期再狭窄中的作用，初步明确一条可能的信号通道，从而对桥静脉的早期再狭窄过程有了新的认识，并希望能为临床抑制或者延缓桥血管再狭窄提供一个新的思路。
图1
HE 与 Masson 染色中术前与术后不同时间胶原纤维与肌纤维的分布情况
a：将标本切片进行 HE 染色，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈淡粉红色，肌纤维呈亮粉红色（×100）；b：Masson 染色时胶原纤维呈蓝绿色，细胞质、肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色（×100）；NC：术前对照组静脉
图2
NGAL 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，NGAL 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化，棕褐色颗粒为 NGAL 表达；b：建模后中膜层与正常静脉 NGAL 的表达量比较；*：建模后 14 d 中膜层与正常静脉 NGAL 的表达量比较，
图3
MMP2、MMP9 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，MMP2、MMP9 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化；b：建模后与正常静脉表达量比较，*：建模后 7 d 与正常静脉表达量比较，
图4
TIMP1 在狭窄桥血管中的表达情况
a：免疫组织化学染色中，TIMP1 在术前与术后 7 d、14 d、30 d 不同时间段的表达变化；b：建模后 14 d 与正常静脉表达量比较，*：建模后 14 d 与正常静脉表达量比较，
图5
NGAL 信号通路模式图
