引用本文： 刘涛燕, 崔魏, 李弘夏, 吴福建, 兰峰. 重组人血清白蛋白体外诱导干细胞向心肌细胞的分化. 中国胸心血管外科临床杂志, 2018, 25(7): 604-609. doi: 10.7507/1007-4848.201705038 复制
心血管疾病是世界上死亡率最高的疾病之一，其中缺血性心脏病占绝大多数，因心肌细胞结构损伤导致心脏功能不可逆转性改变，健存心肌细胞的代偿能力不能满足机体需求，而各种保守治疗手段亦不能从根本上解决问题，心脏移植因受心脏移植供体来源、移植物抗宿主反应等方面的限制，使得至今仍无有效的治疗方案，因此亟需一种新型的个体化治疗方案，如疾病特异性或患者个体化药物，抑或再生医学的心脏组织[1]。近年来，干细胞生物学的飞速发展，大量的研究表明干细胞已经大范围地应用于心血管疾病的治疗及研究中[2-4]。
目前大量的研究集中在多能诱导干细胞向心肌细胞定向分化的方法的探讨，现有的研究中有模拟胚胎发育的过程，激活 Activin-nodal 通路，骨形态生成蛋白（BMP），Wnt 和 FGF 信号通路诱导干细胞进入中胚层，随后抑制 Wnt，BMP 和转化生长因子β（TGF-β）信号通路将中胚层向心脏干细胞方向定向分化[5-8]。Lian 等[6]以 RPMI1640 培养基和 B27 细胞培养添加剂为基础培养基，依次使用糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）小分子抑制剂和 Wnt 小分子抑制剂调控 Wnt 信号通路使多潜能诱导干细胞向心肌细胞分化，用该方法分化可达到 83% 的分化效率，尽管如此，B27 含有 20 多种化学成分和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白为动物源性且成分复杂，因此采用 B27 方法分化出来的心肌细胞临床研究中存在局限性，本研究目的旨在探索一种新的且可应用于临床研究的向心肌细胞定向分化方法
人血清白蛋白（HSA）作为人血浆中含量最丰富的蛋白，是激素、脂类等物质的转运载体，其主要生理功能是调节血浆 pH 值和维持血浆渗透压。植物源重组人血清白蛋白（rHSA）是一种来源于转基因水稻的 rHSA，不含有动物源成分，能为无血清培养基提供更安全的选择。在本研究中我们用 RMPI1640 及维生素 C 的基础上加入不同浓度的植物源重组人血清白蛋白添加剂组成基础培养基，成功地在体外诱导人多能干细胞分化为心肌细胞，而且达到较高的分化效率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
干细胞来源 NKX2.5eGFP/W-hESCs 购自北京赛贝公司。人多潜能干细胞培养基 PSCeasy 和 EDTA 购自中国 Cellapy 公司，磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国 HyClone公司，RPMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司，基质胶购自美国 BD 公司，Alexa Fluro 488 标记的山羊抗兔和 Alexa Fluro 594 标记的山羊抗鼠荧光二抗购自美国 Invertogen 公司。
1.1.2 主要仪器
主要仪器包括低速控温离心机（Thermo Scientific CL10）、高速控温离心机（Thermo）、电动移液器（Thermo scientific FinnpipetteC1）、CO2 培养箱（Thermo）、冻存管（Corning）、50 ml/15 ml 离心管、6 孔板/12 孔板、低粘附性培养皿、超净台、显微镜和水浴锅。
1.2 方法
1.2.1 干细胞培养
取出 1 支冻存的干细胞，在 37℃ 水浴锅内迅速融化，加入到含有 4 ml 人多潜能干细胞培养基的离心管中，200 g 5 min，吸去上清液，加入培养基重悬后加入到在 Matrigel 包被的细胞培养皿上，培养液为 PSCeasy，每 4～5 d 用 EDTA 消化后以团块传代。
1.2.2 诱导分化
NKX2.5eGFP/W-hESCs 培养至一定汇合度后，用带有 6 μM CHIR99021 的 CRA3（RPMI1640，植物源 rHSA 和维生素 C 配制而成） 培养 2 d 后，更换带有 5 μM Wnt信号抑制剂 IWP-2 的维持培养基 CRA3 处理 2 d 后，接着更换 CRA3 直至大量的自发跳动心肌细胞出现。
1.2.3 流式细胞仪分析
开启 LSR Fortessa 流式细胞仪，启动 BD FACSDiva Software v6.6 软件，以标准微球（BDTMCytometer Setup&Tracking Beads，CST）校准仪器变异系数（CV）值、电压范围和其他参数，全部通过后即可上样检测。样品用心肌消化液消化成单个细胞后，离心，用 PBS 重悬清洗，离心，用 4% 多聚甲醛固定 5～10 min 后即可上机分析。
1.2.4 RT-qPCR
提取 RNA 后用反转录盒提供的 RNA 逆转录酶进行反转录，得到 cDNA 模板。之后以 2 μl 模板（1∶20）稀释+10 μl 双链嵌合荧光染色法实时多聚酶链反应混合液（SYBR green PCR Master mix）+2 μl 引物组成的 20 μl 体系并在 Bio-Rad iQ5 实时定量 PCR 仪进行实验，进行融解曲线分析后获得可靠 CT 值曲线，目的基因相对表达量计算公式：2（CT 内参–CT 靶基因）。
1.2.5 免疫荧光
在铺有盖玻片的 24 孔板中，接种干细胞诱导分化的心肌细胞。用新鲜配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 30 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。用 0.4% triton X-100（PBS 配制）对细胞透化处理 10 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。3% 牛血清蛋白封闭 30 min。加入一抗心肌肌钙蛋白 T（cTnT，1∶100），4℃孵育过夜，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入二抗，37℃孵育 45 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入含 DAPI 的封片剂封片后，在荧光显微镜下读片。
1.2.6 电子显微镜分析超微结构
用胰酶将贴壁的心肌细胞消化下来，离心吸去上清液，加入戊二醛固定过夜，脱水、浸透、包埋、切片和染色，打开 JEM-2100 电子显微镜观察。
1.3 统计学分析
采用 Graphic prism 作图及统计，计量资料以均数±标准差（
）表示，计量资料比较采用独立样本 t 检验，心肌细胞对不同浓度心脏药物的反应采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 优化心肌细胞分化体系
为了更好地探索化学成份明确的心肌分化培养方法，本研究采用的 NKX2.5eGFP/W-hESCs 干细胞系，干细胞在向心肌细胞定向分化过程中进入心肌前体细胞阶段后常以 NKX2.5 作为标记，当干细胞分化成心肌细胞后则会被检测到绿色荧光。在 RMPI1640 及维生素 C 的基础上分别加入不同浓度的植物源替代的 rHSA（0、50、100、200 g/L）添加剂组成基础培养基 CRA3。人胚胎干细胞克隆界限清楚，形态扁平，细胞核质比高，当汇合度达到 75% 后，开始加入 CHIR99021，48 h 后加入 IWP-2。在 CHIR99021 加入后，干细胞开始分化，克隆形状不断变化，细胞同时向周围延伸，在分化 9 d 左右开始，rHSA 浓度为 100 g/L 和 200 g/L 就能出现跳动的心肌细胞，并在荧光显微镜下能观察到绿色荧光（图 1）。而浓度为 0、50 g/L 的 rHSA 组成的基础培养基不能分化出跳动的心肌细胞。
为了检测不同浓度的 rHSA 分化心肌细胞的效率，我们将心肌细胞消化成单个细胞后做流式分析，结果如图 2 所示，浓度分别为 0、50、100、200 g/L 的 rHSA 构成的心肌分化培养基的分化效率依次是 14.8%、19. 7%、26.7%、60.49%。因此后面的实验均以 200 g/L 的 rHSA 配心肌分化培养基。
2.2 免疫荧光染色和 RT-QPCR
从分化开始每天镜下观察和记录克隆的跳动情况以及跳动的频率。心肌细胞的平均跳动频率为 89 次/min（图 3），在 NKX2.5eGFP/W-hESCs 分化成跳动的心肌细胞后进行心肌特异性标志物 cTNT 和 α-actinin 的免疫荧光染色，结果显示均呈阳性（图 4）。采用 RT-QPCR 的方法检测了分化的第 0 d 和第 15 d 的细胞 OCT4，SOX2，NANOG，MYH7，TNNT2 等基因的表达情况，如图 5 所示，分化第 0 d 的细胞强烈地表达干细胞多潜能因子 OCT4，SOX2，NANOG，不表达心肌特异基因如肌球蛋白重链 7（MYH7）和心肌肌钙蛋白 T（TNNT2）；而分化至第 15 d 的细胞则显著地表达 MYH7 和 TNNT2 等心肌特异性基因（图 5）。
2.3 电子显微镜观察心肌细胞超微结构
跳动 30 d 后的心肌细胞用来观察细胞的超微结构，如图 6 所示，心肌细胞形成双核细胞，肌小节分散地分布在细胞内，Z 线明显，肌小节之间有大量的线粒体为提供心肌细胞跳动需要的能量。
2.4 心肌细胞对药物的反应
跳动的心肌细胞跳至 30 d 后给予药物处理：β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素和 L-型钙离子通道阻滞剂维拉帕米两种药物对心肌细胞的影响，结果如图 3 所示，心肌细胞的跳动频率随着异丙肾上腺素浓度的上升呈剂量依赖性地加快，差异有统计学意义（F=9.842，P<0.001）；而维拉帕米的结果则与之相反，心跳速率随着浓度的上升呈剂量依赖性地降低，但差异无统计学意义（F=2.715，P=0.08）。
图1
显微镜观察记录成分明确分化方法心肌分化过程
图2
流式分析检测不同浓度的重组人血清白蛋白分化心肌细胞的效率
图3
hiPSC-CM 对药物的反应
*：与 0 nM异丙肾上腺素相比，
图4
免疫荧光染色
图5
荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异基因表达情况
*与 iPSCs 相比，
图6
电子显微镜观察心肌细胞超显微结构
3 讨论
心血管疾病是人类健康的头号杀手，其中心肌梗死的发病率最高，目前各种保守治疗手段不能从根本上解决问题，心脏移植受供体来源、移植物抗宿主反应等方面的限制给临床治疗带来困扰，目前，干细胞及干细胞来源的心肌细胞已经大范围地应用于心肌梗死的治疗及研究，并取得了令人振奋的初步研究成果。尽管如此，研究者们一直致力于寻找一种体外诱导胚胎干细胞或多潜能干细胞分化为心肌细胞的方法，它耗费少，却效率高、纯度高、产量大并符合临床应用的要求[9]。在本次研究中以不同浓度植物源 rHSA、维生素 C 和 RPMI1640 为基础培养基（CRA3）依次使用 GSK3β 小分子抑制剂和 Wnt 小分子抑制剂将人多潜能干细胞分化成跳动的心肌细胞，浓度为 200 g/L 的植物源 rHSA 分化心肌细胞效率可达 60%。用该方法分化得到的心肌细胞表达心肌特异性结构蛋白 cTnT 和 α-actinin，超微结构显示心肌胞内有明显的肌丝及在核周围分布大量的线粒体为心肌细胞跳动提供能量，这些结构均与人的心肌细胞相似；另外人多潜能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CM）能自主性跳动，频率 89 次/min，对心脏药物生理反应也与人心肌细胞一致。
本研究使用 NKX2.5eGFP/W-hESCs 工具细胞株探讨不同浓度植物源 rHSA，NKX2.5 基因是心肌特异性的转录因子，因此通过流式检测 NKX2.5-GFP 的阳性细胞数来评估心肌细胞阳性率[10]。本研究采用的白蛋白是一种来源于转基因水稻的 rHSA。无植物源 rHSA 的培养基分化前 6 d 无细胞死亡、细胞发生形变但无荧光表达且至第 9 d 无跳动心肌细胞，而高浓度植物源 rHSA 能得到较高分化效率。植物源 rHSA 提高诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的具体机制目前还不清楚，但白蛋白在培养基中扮演着多种重要的角色，包括可以作为解毒剂或缓冲剂结合脂质和过量的蛋白质、维持激素和生长肽的稳定以及能结合自由基以减少对细胞的氧化损伤。本基础培养基中还添加了维生素 C，大量的研究报道维生素 C 可提高心肌分化效率，在心肌分化过程中不仅起到抗氧化的作用还促进心肌相关基因如 GATA4，MYH6 和 MYH7 的表达[11-13]。采用这种方法诱导分化产生的心肌细胞能为以后的干细胞临床应用打下良好的基础。
体外分化心肌细胞的方法有很多，大多数研究方法均以 RPMI1640 和 B27 作为基础培养基，采用定向诱导分化系统[14-16]，即利用 activin A 和 BMP4 两种因子的序贯作用，仿照了心脏在胚胎发育过程中激活了 nodal 和 Wnt 信号通路促进胚胎形成原肠胚进入中胚层，而后抑制 Wnt 信号通路使得中胚层细胞向心肌细胞定向分化，如穆军升等[15]以 RPMI1640-B27 为基础培养基，依次加入 bFGF，activin A，BMP4 等诱导因子分化效率为 66.7%。然而诱导剂大多价格昂贵，尤其是人干细胞的诱导因子增加了分化的费用。考虑到这点，我们采用小分子的分化方法，在第一阶段使用 GSK-3 抑制剂 CHIR99021，将干细胞向中胚层阶段分化，在第二阶段使用 Wnt/β-catenin 抑制剂 IWP-2 向心肌细胞定向分化，这极大地降低了诱导成本，为体外心肌细胞分化策略具有重要的指导意义。尽管干细胞到临床的治疗应用还有一段很长的路要走，但是我们有理由相信，在不久的将来干细胞治疗心力衰竭的临床应用终究会变为现实。
心血管疾病是世界上死亡率最高的疾病之一，其中缺血性心脏病占绝大多数，因心肌细胞结构损伤导致心脏功能不可逆转性改变，健存心肌细胞的代偿能力不能满足机体需求，而各种保守治疗手段亦不能从根本上解决问题，心脏移植因受心脏移植供体来源、移植物抗宿主反应等方面的限制，使得至今仍无有效的治疗方案，因此亟需一种新型的个体化治疗方案，如疾病特异性或患者个体化药物，抑或再生医学的心脏组织[1]。近年来，干细胞生物学的飞速发展，大量的研究表明干细胞已经大范围地应用于心血管疾病的治疗及研究中[2-4]。
目前大量的研究集中在多能诱导干细胞向心肌细胞定向分化的方法的探讨，现有的研究中有模拟胚胎发育的过程，激活 Activin-nodal 通路，骨形态生成蛋白（BMP），Wnt 和 FGF 信号通路诱导干细胞进入中胚层，随后抑制 Wnt，BMP 和转化生长因子β（TGF-β）信号通路将中胚层向心脏干细胞方向定向分化[5-8]。Lian 等[6]以 RPMI1640 培养基和 B27 细胞培养添加剂为基础培养基，依次使用糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）小分子抑制剂和 Wnt 小分子抑制剂调控 Wnt 信号通路使多潜能诱导干细胞向心肌细胞分化，用该方法分化可达到 83% 的分化效率，尽管如此，B27 含有 20 多种化学成分和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白为动物源性且成分复杂，因此采用 B27 方法分化出来的心肌细胞临床研究中存在局限性，本研究目的旨在探索一种新的且可应用于临床研究的向心肌细胞定向分化方法
人血清白蛋白（HSA）作为人血浆中含量最丰富的蛋白，是激素、脂类等物质的转运载体，其主要生理功能是调节血浆 pH 值和维持血浆渗透压。植物源重组人血清白蛋白（rHSA）是一种来源于转基因水稻的 rHSA，不含有动物源成分，能为无血清培养基提供更安全的选择。在本研究中我们用 RMPI1640 及维生素 C 的基础上加入不同浓度的植物源重组人血清白蛋白添加剂组成基础培养基，成功地在体外诱导人多能干细胞分化为心肌细胞，而且达到较高的分化效率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
干细胞来源 NKX2.5eGFP/W-hESCs 购自北京赛贝公司。人多潜能干细胞培养基 PSCeasy 和 EDTA 购自中国 Cellapy 公司，磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国 HyClone公司，RPMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司，基质胶购自美国 BD 公司，Alexa Fluro 488 标记的山羊抗兔和 Alexa Fluro 594 标记的山羊抗鼠荧光二抗购自美国 Invertogen 公司。
1.1.2 主要仪器
主要仪器包括低速控温离心机（Thermo Scientific CL10）、高速控温离心机（Thermo）、电动移液器（Thermo scientific FinnpipetteC1）、CO2 培养箱（Thermo）、冻存管（Corning）、50 ml/15 ml 离心管、6 孔板/12 孔板、低粘附性培养皿、超净台、显微镜和水浴锅。
1.2 方法
1.2.1 干细胞培养
取出 1 支冻存的干细胞，在 37℃ 水浴锅内迅速融化，加入到含有 4 ml 人多潜能干细胞培养基的离心管中，200 g 5 min，吸去上清液，加入培养基重悬后加入到在 Matrigel 包被的细胞培养皿上，培养液为 PSCeasy，每 4～5 d 用 EDTA 消化后以团块传代。
1.2.2 诱导分化
NKX2.5eGFP/W-hESCs 培养至一定汇合度后，用带有 6 μM CHIR99021 的 CRA3（RPMI1640，植物源 rHSA 和维生素 C 配制而成） 培养 2 d 后，更换带有 5 μM Wnt信号抑制剂 IWP-2 的维持培养基 CRA3 处理 2 d 后，接着更换 CRA3 直至大量的自发跳动心肌细胞出现。
1.2.3 流式细胞仪分析
开启 LSR Fortessa 流式细胞仪，启动 BD FACSDiva Software v6.6 软件，以标准微球（BDTMCytometer Setup&Tracking Beads，CST）校准仪器变异系数（CV）值、电压范围和其他参数，全部通过后即可上样检测。样品用心肌消化液消化成单个细胞后，离心，用 PBS 重悬清洗，离心，用 4% 多聚甲醛固定 5～10 min 后即可上机分析。
1.2.4 RT-qPCR
提取 RNA 后用反转录盒提供的 RNA 逆转录酶进行反转录，得到 cDNA 模板。之后以 2 μl 模板（1∶20）稀释+10 μl 双链嵌合荧光染色法实时多聚酶链反应混合液（SYBR green PCR Master mix）+2 μl 引物组成的 20 μl 体系并在 Bio-Rad iQ5 实时定量 PCR 仪进行实验，进行融解曲线分析后获得可靠 CT 值曲线，目的基因相对表达量计算公式：2（CT 内参–CT 靶基因）。
1.2.5 免疫荧光
在铺有盖玻片的 24 孔板中，接种干细胞诱导分化的心肌细胞。用新鲜配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 30 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。用 0.4% triton X-100（PBS 配制）对细胞透化处理 10 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。3% 牛血清蛋白封闭 30 min。加入一抗心肌肌钙蛋白 T（cTnT，1∶100），4℃孵育过夜，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入二抗，37℃孵育 45 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入含 DAPI 的封片剂封片后，在荧光显微镜下读片。
1.2.6 电子显微镜分析超微结构
用胰酶将贴壁的心肌细胞消化下来，离心吸去上清液，加入戊二醛固定过夜，脱水、浸透、包埋、切片和染色，打开 JEM-2100 电子显微镜观察。
1.3 统计学分析
采用 Graphic prism 作图及统计，计量资料以均数±标准差（
）表示，计量资料比较采用独立样本 t 检验，心肌细胞对不同浓度心脏药物的反应采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 优化心肌细胞分化体系
为了更好地探索化学成份明确的心肌分化培养方法，本研究采用的 NKX2.5eGFP/W-hESCs 干细胞系，干细胞在向心肌细胞定向分化过程中进入心肌前体细胞阶段后常以 NKX2.5 作为标记，当干细胞分化成心肌细胞后则会被检测到绿色荧光。在 RMPI1640 及维生素 C 的基础上分别加入不同浓度的植物源替代的 rHSA（0、50、100、200 g/L）添加剂组成基础培养基 CRA3。人胚胎干细胞克隆界限清楚，形态扁平，细胞核质比高，当汇合度达到 75% 后，开始加入 CHIR99021，48 h 后加入 IWP-2。在 CHIR99021 加入后，干细胞开始分化，克隆形状不断变化，细胞同时向周围延伸，在分化 9 d 左右开始，rHSA 浓度为 100 g/L 和 200 g/L 就能出现跳动的心肌细胞，并在荧光显微镜下能观察到绿色荧光（图 1）。而浓度为 0、50 g/L 的 rHSA 组成的基础培养基不能分化出跳动的心肌细胞。
为了检测不同浓度的 rHSA 分化心肌细胞的效率，我们将心肌细胞消化成单个细胞后做流式分析，结果如图 2 所示，浓度分别为 0、50、100、200 g/L 的 rHSA 构成的心肌分化培养基的分化效率依次是 14.8%、19. 7%、26.7%、60.49%。因此后面的实验均以 200 g/L 的 rHSA 配心肌分化培养基。
2.2 免疫荧光染色和 RT-QPCR
从分化开始每天镜下观察和记录克隆的跳动情况以及跳动的频率。心肌细胞的平均跳动频率为 89 次/min（图 3），在 NKX2.5eGFP/W-hESCs 分化成跳动的心肌细胞后进行心肌特异性标志物 cTNT 和 α-actinin 的免疫荧光染色，结果显示均呈阳性（图 4）。采用 RT-QPCR 的方法检测了分化的第 0 d 和第 15 d 的细胞 OCT4，SOX2，NANOG，MYH7，TNNT2 等基因的表达情况，如图 5 所示，分化第 0 d 的细胞强烈地表达干细胞多潜能因子 OCT4，SOX2，NANOG，不表达心肌特异基因如肌球蛋白重链 7（MYH7）和心肌肌钙蛋白 T（TNNT2）；而分化至第 15 d 的细胞则显著地表达 MYH7 和 TNNT2 等心肌特异性基因（图 5）。
2.3 电子显微镜观察心肌细胞超微结构
跳动 30 d 后的心肌细胞用来观察细胞的超微结构，如图 6 所示，心肌细胞形成双核细胞，肌小节分散地分布在细胞内，Z 线明显，肌小节之间有大量的线粒体为提供心肌细胞跳动需要的能量。
2.4 心肌细胞对药物的反应
跳动的心肌细胞跳至 30 d 后给予药物处理：β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素和 L-型钙离子通道阻滞剂维拉帕米两种药物对心肌细胞的影响，结果如图 3 所示，心肌细胞的跳动频率随着异丙肾上腺素浓度的上升呈剂量依赖性地加快，差异有统计学意义（F=9.842，P<0.001）；而维拉帕米的结果则与之相反，心跳速率随着浓度的上升呈剂量依赖性地降低，但差异无统计学意义（F=2.715，P=0.08）。
图1
显微镜观察记录成分明确分化方法心肌分化过程
图2
流式分析检测不同浓度的重组人血清白蛋白分化心肌细胞的效率
图3
hiPSC-CM 对药物的反应
*：与 0 nM异丙肾上腺素相比，
图4
免疫荧光染色
图5
荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异基因表达情况
*与 iPSCs 相比，
图6
电子显微镜观察心肌细胞超显微结构
3 讨论
心血管疾病是人类健康的头号杀手，其中心肌梗死的发病率最高，目前各种保守治疗手段不能从根本上解决问题，心脏移植受供体来源、移植物抗宿主反应等方面的限制给临床治疗带来困扰，目前，干细胞及干细胞来源的心肌细胞已经大范围地应用于心肌梗死的治疗及研究，并取得了令人振奋的初步研究成果。尽管如此，研究者们一直致力于寻找一种体外诱导胚胎干细胞或多潜能干细胞分化为心肌细胞的方法，它耗费少，却效率高、纯度高、产量大并符合临床应用的要求[9]。在本次研究中以不同浓度植物源 rHSA、维生素 C 和 RPMI1640 为基础培养基（CRA3）依次使用 GSK3β 小分子抑制剂和 Wnt 小分子抑制剂将人多潜能干细胞分化成跳动的心肌细胞，浓度为 200 g/L 的植物源 rHSA 分化心肌细胞效率可达 60%。用该方法分化得到的心肌细胞表达心肌特异性结构蛋白 cTnT 和 α-actinin，超微结构显示心肌胞内有明显的肌丝及在核周围分布大量的线粒体为心肌细胞跳动提供能量，这些结构均与人的心肌细胞相似；另外人多潜能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CM）能自主性跳动，频率 89 次/min，对心脏药物生理反应也与人心肌细胞一致。
本研究使用 NKX2.5eGFP/W-hESCs 工具细胞株探讨不同浓度植物源 rHSA，NKX2.5 基因是心肌特异性的转录因子，因此通过流式检测 NKX2.5-GFP 的阳性细胞数来评估心肌细胞阳性率[10]。本研究采用的白蛋白是一种来源于转基因水稻的 rHSA。无植物源 rHSA 的培养基分化前 6 d 无细胞死亡、细胞发生形变但无荧光表达且至第 9 d 无跳动心肌细胞，而高浓度植物源 rHSA 能得到较高分化效率。植物源 rHSA 提高诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的具体机制目前还不清楚，但白蛋白在培养基中扮演着多种重要的角色，包括可以作为解毒剂或缓冲剂结合脂质和过量的蛋白质、维持激素和生长肽的稳定以及能结合自由基以减少对细胞的氧化损伤。本基础培养基中还添加了维生素 C，大量的研究报道维生素 C 可提高心肌分化效率，在心肌分化过程中不仅起到抗氧化的作用还促进心肌相关基因如 GATA4，MYH6 和 MYH7 的表达[11-13]。采用这种方法诱导分化产生的心肌细胞能为以后的干细胞临床应用打下良好的基础。
体外分化心肌细胞的方法有很多，大多数研究方法均以 RPMI1640 和 B27 作为基础培养基，采用定向诱导分化系统[14-16]，即利用 activin A 和 BMP4 两种因子的序贯作用，仿照了心脏在胚胎发育过程中激活了 nodal 和 Wnt 信号通路促进胚胎形成原肠胚进入中胚层，而后抑制 Wnt 信号通路使得中胚层细胞向心肌细胞定向分化，如穆军升等[15]以 RPMI1640-B27 为基础培养基，依次加入 bFGF，activin A，BMP4 等诱导因子分化效率为 66.7%。然而诱导剂大多价格昂贵，尤其是人干细胞的诱导因子增加了分化的费用。考虑到这点，我们采用小分子的分化方法，在第一阶段使用 GSK-3 抑制剂 CHIR99021，将干细胞向中胚层阶段分化，在第二阶段使用 Wnt/β-catenin 抑制剂 IWP-2 向心肌细胞定向分化，这极大地降低了诱导成本，为体外心肌细胞分化策略具有重要的指导意义。尽管干细胞到临床的治疗应用还有一段很长的路要走，但是我们有理由相信，在不久的将来干细胞治疗心力衰竭的临床应用终究会变为现实。
